急性髓细胞白血病的整体遗传特征轮廓预后相关性研究.docx

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急性髓细胞白血病的整体遗传特征轮廓预后相关性研究

PrognosticRelevanceofIntegratedGeneticProfilinginAcuteMyeloidLeukemia

急性髓细胞白血病的整体遗传特征轮廓预后相关性研究

JayP.Patel,MithatGönen,Ph.D.,MariaE.Figueroa,M.D.,HugoFernandez,M.D.,ZhuoxinSun,Ph.D.,JanisRacevskis,Ph.D.,PieterVanVlierberghe,Ph.D.,IgorDolgalev,B.S.,SabrenaThomas,B.S.,OlgaAminova,B.S.,KetyHuberman,B.S.,JaniceCheng,B.S.,AgnesViale,Ph.D.,NicholasD.Socci,Ph.D.,AdrianaHeguy,Ph.D.,AthenaCherry,Ph.D.,GailVance,M.D.,RodneyR.Higgins,Ph.D.,RhettP.Ketterling,M.D.,RobertE.Gallagher,M.D.,MarkLitzow,M.D.,MarcelR.M.vandenBrink,M.D.,Ph.D.,HillardM.Lazarus,M.D.,JacobM.Rowe,M.D.,SelinaLuger,M.D.,AdolfoFerrando,M.D.,Ph.D.,ElisabethPaietta,Ph.D.,MartinS.Tallman,M.D.,AriMelnick,M.D.,OmarAbdel-Wahab,M.D.,andRossL.Levine,M.D.

Abstract

Background

Acutemyeloidleukemia（AML）isaheterogeneousdiseasewithrespecttopresentationandclinicaloutcome.Theprognosticvalueofrecentlyidentifiedsomaticmutationshasnotbeensystematicallyevaluatedinaphase3trialoftreatmentforAML.

急性髓细胞白血病是一种有关表达和临床结果异构性疾病。

最近发现的体细胞突变的预后价值尚用于急性髓细胞白血病治疗的临床三期试验的系统评价。

Methods

Weperformedamutationalanalysisof18genesin398patientsyoungerthan60yearsofagewhohadAMLandwhowererandomlyassignedtoreceiveinductiontherapywithhigh-doseorstandard-dosedaunorubicin.Wevalidatedourprognosticfindingsinanindependentsetof104patients.

我们选择年龄小于60岁的AML398例随机分配到高剂量组或标准剂量组，接受柔红霉素的诱导治疗，治疗后对18个基因作突变的分析。

并另选择104例患者进行验证了预后结果

Results

Weidentifiedatleastonesomaticalterationin97.3%ofthepatients.WefoundthatinternaltandemduplicationinFLT3（FLT3-ITD）,partialtandemduplicationinMLL（MLL-PTD）,andmutationsinASXL1andPHF6wereassociatedwithreducedoverallsurvival（P=0.001forFLT3-ITD,P=0.009forMLL-PTD,P=0.05forASXL1,andP=0.006forPHF6）;CEBPAandIDH2mutationswereassociatedwithimprovedover-allsurvival（P=0.05forCEBPAandP=0.01forIDH2）.ThefavorableeffectofNPM1mutationswasrestrictedtopatientswithco-occurringNPM1andIDH1orIDH2mutations.WeidentifiedgeneticpredictorsofoutcomethatimprovedriskstratificationamongpatientswithAML,independentlyofage,white-cellcount,inductiondose,andpost-remissiontherapy,andvalidatedthesignificanceofthesepredictorsinanindependentcohort.High-dosedaunorubicin,ascomparedwithstandard-dosedaunorubicin,improvedtherateofsurvivalamongpatientswithDNMT3AorNPM1mutationsorMLLtranslocations（P=0.001）butnotamongpatientswithwild-typeDNMT3A,NPM1,andMLL（P=0.67）.

我们可以确定97.3%的患者至少有一个细胞发生了改变。

在FLT3基因中存在串联重复（FLT3-ITD），在MLL基因中存在部分串联重复（MLL-PTD），ASXL1，PHF6突变与降低总体生存率相关（P=0.001forFLT3-ITD,P=0.009forMLL-PTD,P=0.05forASXL1,andP=0.006forPHF6）；CEBPA和IDH2突变与总生存率改善相关（P=0.05forCEBPAandP=0.01forIDH2）。

NPM1突变的有利作用仅限于NPM1和IDH1或IDH2同时发生突变患者。

我们确定的改进AML患者危险分层之间遗传因素预测因子，该因子独立于年龄、白细胞计数、诱导剂量和治疗后缓解治疗，并通过独立的队列验证这些预测因子的重要性。

Conclusions

WefoundthatDNMT3AandNPM1mutationsandMLLtranslocationspredictedanimprovedoutcomewithhigh-doseinductionchemotherapyinpatientswithAML.ThesefindingssuggestthatmutationalprofilingcouldpotentiallybeusedforriskstratificationandtoinformprognosticandtherapeuticdecisionsregardingpatientswithAML.（FundedbytheNationalCancerInstituteandothers.）

我们发现DNMT3A和NPM1突变和MLL易位预测高剂量诱导化疗的AML患者的转归改善结果。

研究结果表明，突变谱可能被用于AML患者的危险分层和预后预测和治疗决策

Previousstudieshavehighlightedtheclinicalandbiologicheterogeneityofacutemyeloidleukemia（AML）.1-4。

However,arelativelysmallnumberofcytogeneticandmolecularlesionshavesufficientrelevancetoinfluenceclinicalpractice.5Theprognosticrelevanceofcytogeneticabnormalitieshasledtothewide-spreadadoptionofriskstratification,withpatientsdividedintothreecytogeneticallydefinedriskgroupswithsignificantdifferencesinover-allsurvival.6Morerecently,FLT3,NPM1,andCEBPAmutationalanalysiswasshowntoimproveriskstratificationforpatientswhodonothavekaryotypicabnormalities.7AlthoughprogresshasbeenmadeindefiningprognosticmarkersforAML,asubstantialpercentageofpatientslackaspecificabnormalityofprognosticsignificance.Inaddition,thereisconsiderableheterogeneityintheoutcomeforindividualpatientsineachriskgroup.

以前的研究都强调，急性髓细胞白血病的临床和生物学异质性。

然而，相对较少的细胞遗传学和分子病变具有充分的关联性而影响临床实践。

细胞遗传异常的预后相关性促使广泛采用危险因素分层，患者根据细胞遗传学定义的风险分为三组，其所有生存时间有显著差异。

最近，NPM1，FLT3，和CEBPA突变分析显示没有核型畸形患者改善危险分层。

虽然在确定的预后标记的AML取得了进展，相当比例的患者缺乏特异性预后差异。

此外，各风险组中存在有相当大的异质性结果。

RecentstudieshaveidentifiednovelrecurrentsomaticmutationsinpatientswithAML.TheseincludemutationsinTET2,8,9ASXL1,10IDH1orIDH2,11-13DNMT3A,4,14andPHF6.15RetrospectiveanalysessuggestthatasubsetofthesemutationsmayhaveprognosticsignificanceinAML,4,14,16althoughthesefindingshavenotbeenvalidatedwithdetailedclinicalandmutationalannotationinlarge,homogeneouslytreatedcohortsofpatientswithAML.Inaddition,thequestionofwhethermutationalprofilingofalargersetofgenes,includingthesenoveldiseasealleles,improvesprognosticationinAMLhasnotbeeninvestigatedinaclinicaltrialcohort.

最近的研究发现AML患者存在新的复发性体细胞突变。

这些突变包括TET2，ASXL1，IDH1和IDH2，DNMT3A，4PHF6。

回顾性分析表明，这些突变可能存在预后差异性，尽管这些研究没有经过详细的临床和基因突变的进行验证，也没治疗证实。

此外，是否进行大量的基因轮廓分析，包括这些改善AML的预后疾病新的等位基因，这一问题尚未通过队列研究进行临床验证。

Arecentphase3clinicaltrial（E1900;ClinicalTrials.govnumber,NCT00049517）fromtheEasternCooperativeOncologyGroup（ECOG）showedthatinductiontherapywithcytarabineplus90mgofdaunorubicinpersquaremeterofbody-surfacearea,ascomparedwithcytarabineplus45mgofdaunorubicinpersquaremeter,improvedtheoutcomesinpatientswithnewlydiagnosedAMLwhowere17to60yearsofage17;asimilarstudyinpatientswhowereolderthan60yearsofageshowedthatdose-intensifieddaunorubicinimprovedoverallsurvivalinpatients60to65yearsofage.18Wehypothesizedthatintegratedmutationalanalysisofallknownmolecularalterationsoccurringinmorethan5%ofpatientswithAMLwouldallowustoidentifynovelmolecularmarkersofoutcomeinAMLandtoidentifymolecularlydefinedsubgroupsofpatientswhowouldbenefitfromdose-intensifiedinductionchemotherapy.

最近的来自东部肿瘤协作组（ECOG）的3期临床试验表明，与阿糖胞苷加45毫克每平方米柔红霉素相比，阿糖胞苷加90毫克每平方米体表面积的柔红霉素诱导治疗可改善17至60岁初诊AML患者的预后。

类似研究表明年龄60岁以上病人加大剂量的柔红霉素治疗可以提高60到65岁患者总体生存。

我们假设，所有已知的分子改变发生超过5%的AML患者的基因突变分析，允许我们识别新的结果分子标记，识别受益于增强诱导化疗剂量AML患者的亚组。

Methods

Patients

WeperformedmutationalanalysisondiagnosticsamplesobtainedfrompatientsintheECOGE1900trial.Allpatientsprovidedwritteninformedconsent.Thetestcohort（398patients）comprisedallpatientsintheE1900trialforwhomviablyfrozencellswereavailableforDNAextractionandmutationalprofiling.Thevalidationcohort（104patients）comprisedasecondsetofpatientsforwhomsampleswerebankedinTrizolreagent（Invitrogen）,whichwasusedtoextractDNAformutationalstudies.Theclinicalcharacteristicsofthepatientswestudied,ascomparedwiththecompleteE1900trialcohort,areprovidedinTableS1intheSupplementaryAppendix,availablewiththefulltextofthisarticleatNEJM.org.Themedianfollow-uptimeforthepatientsincludedintheanalysis,calculatedfromthetimeofrandomizationforinductiontherapy,was47.4months.Cytogeneticanalysis,fluorescenceinsituhybridization,andreverse-transcriptase–polymerase-chain-reaction（RT-PCR）assaysforrecurrentcytogeneticlesionswereperformedasdescribedinitiallybySlovaketal.6andasusedpreviously,17withcentralreviewbytheECOGCytogeneticSubcommittee.

我们对从脑电图e1900试验患获得的诊断样本进行了突变分析。

所有患者提供书面知情同意书。

试验组（398例）包括在e1900所有患者可用冷冻细胞允许DNA提取和突变分析。

验证组（104例）组成的第二组病人的样品储存在Trizol试剂（Invitrogen公司），也是用来提取DNA作突变分析。

我们研究的患者的临床特征，如与完整的e1900试验相比，在附录中有表S1可浏览详细信息。

纳入分析患者的中位随访时间为从随机的诱导治疗的时间计算，为47.4个月。

如最初由斯洛伐克等人所进行的研究，由皮层细胞遗传学中心审查委员会审查，通过染色体核型分析，荧光原位杂交，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）进行细胞遗传学损伤检测。

MutationalAnalysis

ThesourceoftheDNAwasbonemarrowinthecaseof55.2%ofthesamples（277of502）andperipheralbloodinthecaseof44.8%（225of502）.WesequencedtheentirecodingregionsofTET2,ASXL1,DNMT3A,CEBPA,PHF6,WT1,TP53,EZH2,RUNX1,andPTENandtheregionsofpreviouslydescribedmutationsforFLT3,NPM1,HRAS,KRAS,NRAS,KIT,IDH1,andIDH2.ThegenomiccoordinatesandsequencesofalltheprimersusedinthisstudyareprovidedinTableS2intheSupplementaryAppendix.PairedremissionDNA（i.e.,DNAfrompatientswhohadacompletere-missionafterinductionchemotherapy）wasavail-ablefrom241ofthe398participantsinthetestcohortandfrom65ofthe104inthevalidationcohort.DataonvariantsthatcouldnotbevalidatedasbonafidesomaticmutationsowingtounavailableremissionDNAandtheabsenceofreportsofthemutationsinthepublishedliteratureofsomaticmutationswerecensoredwithrespecttomutationalstatusforthatspecificgene.FurtherdetailsofthesequencingmethodsareavailableintheSupplementaryAppendix.

DNA来自样本中的55.2%例骨髓（277/502）和44.8%例的外周血（225/502）。

我们测序整个编码区的TET2，ASXL1，DNMT3A，CEBPA，PHF6，WT1基因，TP53，EZH2，RUNX1，和PTEN和先前描述的突变NPM1，FLT3，HRAS，KRAS，NRAS，KIT，IDH1和IDH2基因。

基因组坐标和所有本研究中所用的引物序列在附录中表S2详细列出。

对配对缓解DNA（即，有完整的诱导缓解后化疗患者DNA）是从241的398的参与者在测试队列和从65的104在验证队列获取。

对变异不能由无法缓解的DNA体细胞突变验证，在已发表的文献中的基因突变的报道认为没有通过对特定基因的突变状态方面的数据。

进一步测序方法的细节在附录中详细列举。

StatisticalAnalysis

Themutualexclusivityofpairsofmutationswasevaluatedwiththeuseoftwo-by-twocontingencytablesandFisher’sexacttest.Theassociationbetweenmutationsandcytogeneticriskclassificationwastestedwiththeuseofthechi-squaretest.HierarchicalclusteringwasperformedwiththeuseoftheLance–Williamsdissimilarityformulaandthecomplete-linkagealgorithm.Survivaltimewasmeasuredfromthedateofran