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仪器分析复习指导
第一讲色谱法的理论与实践
1色谱分析概论
1.1色谱分析简史
色谱法早在1903年由俄国植物学家Цвет分离植物色素时采用。
后来不仅用于分离有色物质,还用于分离无色物质,并出现了种类繁多的各种色谱法。
许多气体、液体和固体样品都能找到合适的色谱法进行分离和分析。
目前色谱法已广泛应用于许多领域,成为十分重要的分离分析手段。
但不管属于哪一类色谱法,其共同的基本特点是具备两个相:
不动的一相,称一为固定相;另一相是携带样品流过固定相的流动体,称为流动相。
当流动相中样品混合物经过固定相时,就会与固定相发生作用,由于各组分在性质和结构上的差异,与固定相相互作用的类型、强弱也有差异,因此在同一推动力的作用下,不同组分在固定相滞留时间长短不同,从而按先后不同的次序从固定相中流出。
1.3色谱法的特点
优点
①分离效率高②应用范围广
③分析速度快④样品用量少
⑤灵敏度高⑥分析和测定一次完成
⑦易于自动化
不足对分析对象的鉴别能力差。
可以通过与质谱、红外等一起联用解决。
1.4.1按两相状态分类
气体为流动相的色谱称为气相色谱(GC)
根据固定相是固体吸附剂还是固定液(附着在惰性载体上的一薄层有机化合物液体),又可分为气固色谱(GSC)和气液色谱(GLC).
液体为流动相的色谱称液相色谱(LC)
液相色谱亦可分为液固色谱(LSC)和液液色谱(LLC).超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱(SFC)。
随着色谱工作的发展,通过化学反应将固定液键合到载体表面,这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱(CBPC)。
1.4.2按分离机理分类
利用组分在吸附剂(固定相)上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法,称为吸附色谱法。
利用组分在固定液(固定相)中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。
利用组分在离子交换剂(固定相)上的亲和力大小不同而达到分离的方法,称为离子交换色谱法。
利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法,称为凝胶色谱法或空间排阻色谱法。
最近,又有一种新分离技术,利用不同组分与固定相(固定化分子)的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法,常用于蛋白质的分离
1.4.3按固定相的外形分类
固定相装于柱内的色谱法,称为柱色谱。
固定相呈平板状的色谱法,称为平板色谱,它又可分为薄层色谱和纸色谱。
1.4.4按使用领域不同对色谱仪的分类
分析用色谱仪
制备色谱仪
流程色谱仪
根据以上所述,将色谱法的分类总结于图1.l中。
对色谱方法两相更进一步的认识:
流动相:
色谱工作时,流过色谱柱的物质。
它既可以是气体,也可以是液体,还可以是超临界体。
既可以是单质或单一化合物,也可以是一定比例的混合物。
固定相:
色谱工作时,固定相在色谱柱中固定不动。
通常其核心是一类惰性物质,如硅胶、硅藻土等。
对于气固、液固色谱法来说,固定相既是惰性物质;对于气液、液液色谱法固定相=惰性物质(载体)+固定液(粘稠的液体或固体有机物)。
在载体和固定液之间有物理的涂裹,现多为化学键合。
固定液是固定相的一部分,在毛细管色谱柱中只有固定液而没有载体。
色谱流出曲线及主要术
1.7.1流出曲线和色谱峰
如果进样量很小,浓度很低,色谱峰如果对称,可用Gauss正态分布函数表示:
式中:
C—不同时间t时某物质的浓度,C0—进样浓度,tr—保留时间,σ—标准偏差。
1.7.2基线是柱中仅有流动相通过时,检测器响应讯号的记录值,即图中O—t线.稳定的基线通过电子线路的衰减表面上看似“一条水平直线”.
1.7.3峰高色谱峰顶点与基线之间的垂直距离,以h表示,如图中B′A
1.7.4.1死时间tM不被固定相吸附或溶解的物质进入色谱柱时,从进样到出现峰极大值所需的时间称为死时间,如图O′A′。
因为这种物质不被固定相吸附或溶解,故其流动速度将与流动相的流动速度相近.测定流动相平均线速ū时,可用柱长L与tM的比值计算。
1.7.4.2保留时间tR
试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间,称为保留时间,如图O′B.它相应于样品到达色谱柱末端的检测器所需的时间.
1.7.4.3调整保留时间tR′
某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留时间,即tR′=tR-tM
由于组份在色谱柱中的保留时间tR包含了组份随流动相通过柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间,所以tR′实际上是组份在固定相中停留的总时间.保留时间通常用时间单位(如min)表示;很少用距离单位(如cm)表示。
保留时间是色谱法定性的基本依据,但同一组份的保留时间常受到流动相流速的影响,因此色谱工作者有时用保留体积、相对保留指数等参数进行定性检测。
1.7.4.4死体积VM
指色谱柱在填充后,柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。
当后两项很小而可忽略不计时,死体积可由死时间与流动相体积流速F0(L/min)计算:
VM=tM·F0
1.7.4.5保留体积VR
指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。
保留体积与保留时间tR。
的关系如下:
VR=tR·F0
调整保留体积VR′
某组份的保留体积扣除死体积后,称该组份的调整保留体积,即VR′=VR-VM
1.7.4.6相对保留值γ2.1
某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比,称为相对保留值:
由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关,而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关,因此,它是色谱法中,特别是气相色谱法中,广泛使用的定性数据.
必须注意,相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积之比.
1.7.5选择因子
在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(s),然后再求其它峰(i)对这个峰的相对保留值.此时,ri/s可能大于1,也可能小于1.在多元混合物分析中,通常选择一对最难分离的物质对,将它们的相对保留值作为重要参数.在这种特殊情况下,可用符号α表示:
式中tR2′为后出峰的调整保留时间,所以这时α总是大于1的。
1.7.6区域宽度
色谱峰的区域宽度是组分在色谱柱中谱带扩张的函数,它反映了色谱操作条件的动力学因素。
度量色谱峰区域宽度通常有三种方法:
1.7.6.1标准偏差σ
即0.607倍峰高处色谱峰宽的一半,如图中EF距离的一半。
1.7.6.2半峰宽W1/2
即峰高一半处对应的峰宽,如图中GH间的距离.它与标准偏差σ的关系是:
W1/2=2.354σ
1.7.6.3基线宽度W
色谱峰两侧拐点上的切线在基线上的截距,如图中IJ的距离.它与标准偏差σ的关系是:
W=4σ
从色谱流出曲线上,可以得到的重要信息:
◎根据色谱峰的个数,可以判断样品中所合组份的最少个数.
◎根据色谱峰的保留值(或位置),可以进行定性分析.
◎根据色谱峰下的面积或峰高,可以进行定量分析.
◎色谱峰的保留值及其区域宽度,是评价色谱柱分离效能的依据.
◎色谱峰两峰间的距离,是评价固定相(和流动相)选择是否合适的依据.
1.8色谱分析的基本原理
色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离,组分要达到完全分离,两峰间的距离必须足够远,两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的,即与色谱过程的热力学性质有关。
但是两峰间虽有一定距离,如果每个峰都很宽,以致彼此重叠,还是不能分开。
这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的,即与色谱过程的动力学性质有关。
因此,要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。
1.8.1两个组分完全分离的条件
●两组分的分配系数必须有差异
●区域扩宽的速率应小于区域分离的速度
●在保证快速分离的前提下,提供足够长的色谱柱。
1.8.2分配系数K和分配比k
分配系数K
如前所述,分配色谱的分离是基于样品组分在固定相和流动相之间反复多次地分配过程,而吸附色谱的分离是基于反复多次地吸附一脱附过程。
这种分离过程经常用样品分子在两相间的分配来描述,而描述这种分配的参数称为分配系数。
它是指在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,即
1.8.3分配比k
分配比又称容量因子,它是指在一定温度和压力下,组分在两相间分配达平衡时,分配在固定相和流动相中的质量比。
即
k值越大,说明组分在固定相中的量越多,相当于柱的容量大,因此又称分配容量或容量因子。
它是衡量色谱柱对被分离组分保留能力的重要参数。
k值也决定于组分及固定相热力学性质。
它不仅随柱温、柱压变化而变化,而且还与流动相及固定相的体积有关。
式中CS,Cm分别为组分在固定相和流动相的浓度;Vm为柱中流动相的体积,近似等于死体积。
Vs为柱中固定相的体积,在各种不同的类型的色谱中有不同的含义。
例如:
在分配色谱中,Vs表示固定液的体积;在尺寸排阻色谱中,则表示固定相的孔体积。
1.8.4滞留因子Rs分配比k值可直接从色谱图测得。
设流动相在柱内的线速度为u,组分在柱内线速度为us,由于固定相对组分有保留作用,所以us<u.此两速度之比称为滞留因子Rs。
1.8.5分离度
相邻两组色谱峰保留值之差与两个色谱峰峰底宽度总和之半的比值。
1.9塔板理论
最早由Martin等人提出塔板理论,把色谱柱比作一个精馏塔,沿用精馏塔中塔板的概念来描述组分在两相间的分配行为,同时引入理论塔板数作为衡量柱效率的指标。
塔板理论为半经验理论。
式中:
n–理论塔板数L–色谱柱长H–每块塔板的高度
塔板理论假定:
(i)在柱内一小段长度H内,组分可以在两相间迅速达到平衡。
这一小段柱长称为理论塔板高度H。
(ii)以气相色谱为例,载气进入色谱柱不是连续进行的,而是脉动式,每次进气为一个塔板体积(ΔVm)。
(iii)所有组分开始时存在于第0号塔板上,而且试样沿轴(纵)向扩散可忽略。
(iv)分配系数在所有塔板上是常数,与组分在某一塔板上的量无关。
为简单起见,设色谱柱由5块塔板(n=5,n为柱子的塔板数)组成,并以r表示塔板编号,r=1,2…,n-l;某组分的分配比k=1.根据上述假定,在色谱分离过程中,该组分的分布可计算如下:
开始时,若有单位质量,即m=1(例1mg或1μg)的该组分加到第0号塔板上,分配平衡后,由于k=1,即ns=nm故nm=ns=0.5。
当一个板体积(lΔV)的载气以脉动形式进入0号板时,就将气相中含有nm部分组分的载气顶到1号板上,此时0号板液相(或固相)中ns部分组分及1号板气相中的nm部分组分,将各自在两相间重新分配。
故0号板上所含组分总量为0.5,其中气液(或气固)两相各为0.25而1号板上所含总量同样为0.5.气液(或气固)相亦各为0.25。
以后每当一个新的板体积载气以脉动式进入色谱柱时,上述过程就重复一次(见下表)。
由流出曲线方程可推出:
式中:
n-理论塔板数;tr-保留时间;w-峰底宽
而理论塔板高度(H)即:
从以上两式可以看出,色谱峰W越小,n就越大,而H就越小,柱效能越高。
因此,n和H是描述柱效能的指标。
通常填充色谱柱的n>103,H<1mm。
而毛细管柱n=105--106,H<0.5mm
由于死时间tm包括在tr中,而实际的tm不参与柱内分配,所计算的n值尽管很大,H很小,但与实际柱效能相差甚远。
所以,提出把tm扣除,采用有效理论塔板数neff和有效塔板高Heff评价柱效能。
●例题1已知某组分峰的峰底宽40s,保留时间为400s,计算此色谱柱的理论塔板数。
塔板理论用热力学观点形象地描述了溶质在色谱柱中的分配平衡和分离过程,导出流出曲线的数学模型,并成功地解释了流出曲线的形状及浓度极大值的位置,还提出了计算和评价柱效的参数。
但由于它的某些基本假设并不完全符合柱内实际发生的分离过程,例如,纵向扩散不能解释造成谱带扩张的原因和影响板高的各种因素,也不能说明为什么在不同流速下可以测得不同的理论塔板数,这就限制了它的应用。
1.10.4影响柱效率的因素
因素
变化
柱效率
担体粒度
变大
?
填充均匀
提高(H下降)
载气
密度提高
提高(H下降)
压力提高
提高(H下降)
流速提高
在某一流速下H极小
温度
升高
?
固定液
液量下降
提高(H下降)
粘度下降
提高(H下降)
填充柱的气液色谱的速率方程:
毛细管柱的气液色谱的速率方程:
液液分配色谱的速率方程:
1.11.2内标法测定化合物A的有效成分含量
⏹称取化合物A标准品(含量为99%)0.1012克,在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解,加入内标物为邻苯二甲酸二丁酯(500mg/L)5mL,定容至刻度。
⏹称取化合物A样品0.1120克,在100mL容量瓶中用二甲基甲酰胺溶解,加入内标物邻苯二甲酸二丁酯(500mg/L)5mL,定容至刻度。
⏹仪器条件:
灵敏度:
1.5衰减:
7纸速:
4波长:
254nm,进样量皆为10L
⏹测定结果:
化合物A标准品平均峰面积为15780,内标物平均峰面积为16890;化合物A样品平均峰面积为13550,内标物平均峰面积为16870。
求化合物A样品的有效成分百分含量。
⏹解:
将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中,化合物A与内标物峰面积之比,分别进行平均。
以质量百分数表示的化合物A含量X,按下式计算:
⏹式中:
⏹—标样溶液中,化合物A与内标物峰面积比的平均值;
—试样溶液中,化合物A与内标物峰面积比的平均值;
m1—化合物A标样的质量,g;2—试样的质量,g;P—标样中化合物A的质量百分含量。
化合物A的百分含量:
1.11.3外标法
测定化合物B的有效成分含量
称取化合物B标准品(含量为99.8%)0.1008克,在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解,定容至刻度。
称取化合物B样品0.2053克,在100mL容量瓶中用三氯甲烷溶解,摇匀定容至刻度。
仪器条件:
FID。
温度(℃):
气化室240柱箱200检测器250。
进样量皆为1L。
测定结果:
化合物B标准品平均峰面积为33986;化合物B样品平均峰面积为24399。
求化合物B样品的有效成分百分含量。
⏹解:
将测得的两针试样溶液以及试样前后两针标样溶液中,化合物B,分别进行平均。
以质量百分数表示的化合物B含量X,按下式计算:
⏹式中:
—标样溶液中,化合物B峰面积的平均值;
—试样溶液中,化合物B峰面积的平均值;m1—化合物B标样的质量,g;m2—试样的质量,g;P—标样中化合物B的质量百分含量。
化合物B的百分含量:
第二节气相色谱分析
考试要点:
Ø气相色谱仪流程图。
各主要部件的功用及操作注意事项。
Ø气相色谱法的基本原理和特点。
Ø气相色谱仪的工作过程
Ø填充柱色谱法和毛细管柱色谱法的异同点和用途。
Ø常见的载体和固定相种类、品牌。
用途和使用注意事项。
Ø气相色谱仪常用的检测器。
性能、构造、基本原理和使用注意事项。
Ø分流、吹扫、尾吹、程序升温、保留时间、分离度、分配系数等重要名词概念。
Ø常用的定量计算方法及简单的计算实例。
2气相色谱分析GasChromatography
气相色谱仪流程气相色谱仪通常由五大系统构成:
◎供气系统(高压钢瓶或气体发生器、气体净化器压力表)
◎进样系统(气化室、进样辅助系统)
◎分离系统(色谱柱、连接密封部件)
◎检测系统(检测器、电子放大器)
◎计算机控制及数据处理系统(个人电脑、工作站软件)
2.1供气系统
◆气源分高压钢瓶、气体发生器两大类。
各有优缺点,高压钢瓶气体压力输出相对稳定,一般不需要维护;气体发生器需要耗材、维护,输出压力较低,安全性能高。
高压钢瓶可提供小于15MPa的气体压力,旋转手柄顺时针开,逆时针关。
(氢气,瓶体绿颜色红字;氮气,瓶体黑颜色黄字等)
气体发生器包括:
氮氢空一体机,氢空一体机,高纯氢发生器,高纯氮发生器等。
可提供0~0.4MPa的气体压力(氢气发生器,电解水、氮气发生器等)
◆减压阀调节气体压力使之输出合适的压力保证气相色谱仪正常工作。
载气通常为0.5MPa,其他为0.3MPa左右。
主表:
指示高压钢瓶内的压力;
次级表:
指示输出的压力。
旋转手柄可调节输出的压力。
顺时针大,逆时针变小直至关闭输出。
◆气体净化器
内装:
变色硅胶、颗粒活性炭、分子筛
注意安装,自制的出口塞石英棉。
◆转子流量计红色浮子旋转高度保持洁净
◆电子流量控制器(EFC)
气化室的;检测室的
形状:
仪器的型号不同而不同
规格:
大小之分
ä进样橡胶隔膜
性能:
一般和耐高温的两种。
用前要处理;有的可以用硅胶板打孔自制。
ä吹扫:
克服记忆效应
ä分流:
防止过载
分流比:
样品气化后放空的体积与进入色谱柱体积之比。
ä尾吹:
克服检测器的死体积,使色谱峰形状尖锐。
2.3分离系统
2.3.1柱温箱
ä分析结果重现性好
ä保证检测稳定性
2.3.2色谱柱
2.3.2.1填充柱:
柱管材料:
玻璃、不锈钢、铜管、铝管
形状:
U形、圆形
口径:
3~4mm长度:
0.5~3m
2.3.2.2毛细管柱
柱管材料:
熔融石英管
形状:
圆形
口径:
180~530m长度:
15m~60m
2.3.3载体
ä惰性硅藻土等
1外观红色
2外观白色,GasChromQ,ChromsorbHP等
2.3.4固定相
ä化学键合固定相,交联
1非极性甲基硅酮SE-30,二甲基硅油OV-101等
2中性苯基甲基硅酮OV-17,氟烷基硅酮QF-1等
3极性聚乙二醇-20M,二乙二醇丁二酸酯DEGS等
2.4检测系统
2.4.1检测器的分类
气相色谱检测器是把载气里被分离的各组分的浓度或质量转换成电信号的装置。
目前检测器的种类多达数十种。
根据检测原理的不同,可将其分为浓度型检测器和质量型检测器两种:
1浓度型检测器测量的是载气中某组分浓度瞬间的变化,即检测器的响应值和组分的浓度成正比。
如热导检测器和电子捕获检测器。
2质量型检测器测量的是载气中某组分进入检测器的速度变化,即检测器的响应值和单位时间内进入检测器某组分的量成正比。
如火焰离子化检测器和火焰光度检测器等。
按照检测化合物的范围和种类可分为通用型、选择性检测器。
通用型检测器:
热导池检测器TCD、氢火焰离子化检测器FID。
选择性检测器:
电子捕获检测器ECD,测含电负性的物质;焰光度检测器FPD,测含硫磷的
化合物;氮磷检测器NPD,测含氮磷的化合物。
2.4.2检测器的性能
•灵敏度、检出限和最小检出量检测器的灵敏度,亦称响应值或应答值。
一定浓度或质量的试样进入检测器后,就产生一定的响应信号R。
直线的斜率就是检测器的灵敏度S。
检测限与最小检出量或最低检出浓度的区别:
后者与柱效率及操作条件有关。
▪线性范围:
指试样量与信号之间保持线性关系的范围,用最大进样量与最小检出量的比值来表示。
范围愈大,愈有利于准确定量。
▪响应时间:
指物质通过检测器时,响应值随着物质浓度变化滞后的时间。
响应速度越快越好。
▪基流(本底电流或零电流):
没有任何样品加载到流动相中时,检测器所产生的信号的瞬间值。
▪稳定性:
指对色谱操作条件的变化的响应,如流速、压力、温度的变化。
2.5计算机控制及数据处理系统
ä个人计算机色谱数据处理器
ä工作站软件
2.6故障诊断与排除
无峰或峰很小
◆色谱柱是否与进样口和检测器正确连接?
进样口是否漏?
1更换进样垫2检查进样衬管是否损坏
◆柱是否与进样口连接?
?
◆是否使用自动进样器
1检查进样针2更换进样针推杆
3样品瓶中是否有足够的样品,以便进样针能吸到样品?
◆点火了吗?
(FID)
◆柱中是否有载气
寻找色谱峰的方法
(多数的情况是有漏或堵塞)
◆火点着了吗?
1用一个玻璃片放在FID出口有水蒸汽冷凝
2检测仪器的输出值--数值是否大于0.0?
◆柱中是否有载气?
1拆开柱到检测器一端
2用流量计(或皂沫流量计)测量有流量
◆综合1已点火2柱出口有流量
3检测器喷嘴可能被堵塞
◆检查FID组件(注意—请记录零件的安装顺序)
1检查喷嘴本身--
2被石墨碎屑堵塞(拆下柱子时,石墨垫的外型有变化)
3用旧的进样针清除堵塞物
4重新安装FID组件5再次进样
◆基线不好的问题
(检查气源的质量)
使用气体过滤器
色谱柱故障的诊断与排除
◆峰型不好(拖尾)
1.柱过载
减少进样量或将样品稀释10倍
稀释样品可以得到较好的结果
2.试一下较厚液膜的其他色谱柱
前面介绍的所有内容均适用前伸峰和拖尾峰均说明是非线形的分配即色谱柱与样品不匹配使用不同选择性的色谱柱可以解决这个问题
◆分析过程中基线位置突然变化
o基线偏离或漂移
o基线偏离
不规律地升高或降低
在整个色谱过程中基线不规律地升高或降低
o偏离或漂移是由于下列原因产生的
温度流速
o确保在两次进样之间有足够的平衡时间
o检查体系是否有漏
主要检查进样口部分柱前
o上次色谱过程中的残余的低挥发性流出物
基线漂移
o正确地使用高纯度的载气
o色谱柱老化
o色谱柱的最高使用温度不能超过该柱所规定的最高温度极限
o进样口温度与检测器温度要高于色谱柱的最高使用温度
◆基线噪音
1色谱图的基线噪音太高
2进样垫流失
3密封垫的类型不对或使用时间过长,需要更换
4新的密封垫在柱温箱中老化过夜,以除去易挥发性化合物
5vespel密封垫不能超过使用温度(350℃)
6衬管被污染
7较脏的样品每进样15—20次后,更换新的衬管
8气源可能被污染
9选择正确的在线气体净化器(traps)
10每使用四瓶气体,至少要更换一次气体净化器
检测器可能已被污染——清洗检测器
实验室是否有异常的气体
◆色谱柱密封垫
通用技术
o使用轻触点--不能过紧.
o保持清洁.
o在使用前烘焙密封垫.
o避免污染--指纹、油脂等.
o检查使用的密封垫是否有裂纹、碎片、或其它的损坏.
◆柱故障的诊断与排除
◆附加峰
有两种类型的附加峰
1即使不进样也会出现的峰(鬼峰),并且在色谱分析
过程中也会出现在真实的峰之中
2由样品产生的附加峰
◆鬼峰
1.柱头污染
2.烘焙色谱柱,然后做空运行(无样品)
3.进样垫流失使用高质量的产品
4.载气不纯
使用高纯度的载气及高质量的气体净化器,并定期更换
5.载气中杂质与固定相发生反应
6.若使用分流/无分流进样口
进样口底部的密封垫可能会与样品反应
◆柱故障的诊断与排除
一、色谱峰丢失
1.色谱图中没有出现你希望得到的样品组分峰
◆柱故障的诊断与排除
峰型不好
◆柱过载将样品稀释10倍重新进样
◆使用较厚液膜但固定液相同的色谱柱
◆减少进样量
◆小体积进样
◆增加分流
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