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宏基因组实验计划
宏基因组实验计划
———————————————————————————————— 作者:
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宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划
起草人:
李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究:
环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。
发掘:
环境应激和应答基因的多态性。
探究:
多态性基因的功能。
实验大体步骤:
I.环境样品的采集:
1)避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。
2)样品的迅速处理保存。
有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。
带回实验室之后要尽快处理,特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液(多为PBS)重悬,离心收集沉淀。
分装成小份,冻存于液氮或者‐80℃冰箱中,避免反复冻融。
3)如果后续用间接法提取总DNA的话,此处需要收集菌体,采取的策略是稀释之后的差速离心,一般适用于水样。
II.DNA提取方法的选择:
总DNA的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解,释放其中的DNA。
间接提取法则是先分离样品中的微生物,后对微生物进行裂解。
两种方法的适用范围不同,各自都有优缺点。
直接提取法的优缺点:
直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA的试验中。
其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。
造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DNA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。
在样品较珍贵时多采用此法。
其缺点同样明显,所得DNA 的纯度远不及间接提取法所得,基质中含的腐殖质一并被保留下来,使得所得DNA 呈现黄褐色甚至黑色。
可以考虑MoBio和Epicentre的DNA提取的商业试剂盒(主要用于提取土壤样品)。
间接提取法的优缺点:
间接提取法则既可以用来提取固相样品总DNA 也可以用来提取液体样品总DNA。
在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA时,需要用抽滤的方式浓缩。
与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取DNA纯度高,既使在提取固体样品微生物总DNA时,也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。
其缺点是DNA得率低。
ﻫ
土壤DNA直接提取法:
(1) 从超低温冰箱中取出保存样品(5g);
(2)于室温融化;
(3) 加入13.5 mlCTAB 抽提缓冲液和50μl蛋白酶K贮存液;
(4)离心管于37oC225rpm水平振荡30min;
(5)加入1.5mL20%SDS;
(6)65oC水浴2h,每隔15min轻轻颠倒数次;
(7)室温6,000g离心10 min,收集上清液,转移至一个新的50 ml离心管中;
(8)沉淀中再加入4.5ml提取液和0.5ml20%SDS,轻轻涡旋至混匀;
(9) 浸入液氮中冷冻3min 后,于沸水中煮沸3min;
(10) 室温6,000g 离心10min,收集上清液,与上次上清液合并;
(11) 重复(8)、(9)、(10)一次;
(12)将三次提取所获上清液与等体积的苯酚:
氯仿(1:
1v/v)混合,摇匀后于4℃
12,000g离心10min;
(13)将上层水相转移至一新的50ml离心管中,加入等体积的氯仿:
异戊醇(24:
1),
混匀后于4 ℃12,000g离心10min;
(14) 再次转移上清至一新的离心管中,加入0.6 倍体积的异丙醇于室温沉淀1h;
(15)室温12,000g离心20min;
(16)收集沉淀,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀;
(17)向离心管中加入1mlTE,于4℃放置过夜,分装保存于‐20 ℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧:
ﻫﻫ
(1)整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。
ﻫ
(2)用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。
ﻫ(3)酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到,宁可多丢弃一些。
(4) 异丙醇沉淀时不要放在低温,0.7倍体积室温沉淀足够了。
(5)DNA 溶解时可以放在4℃静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。
ﻫ(6) 水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。
水样DNA间接提取法:
(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。
(2)采取差速离心取得水样中的菌体。
(3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中,具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如:
用多少的水样进行浓缩,差速离心的转速选择。
会不会有DNA的丢失等等。
Epicentre推出了宏基因组DNA分离试剂盒(MetagenomicDNAIsolationKitfor Water),能从水样中分离已随机剪切的,可直接用于fosmid克隆的DNA片段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物(包括革兰氏阳性菌)中提取40kb大小的DNA。
提取的DNA可立即进行末端修复,并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Epicentre的PCC1FOS载体上。
优势:
1.无需化学剪切,琼脂糖块或大小选择。
2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。
3.产量更高,从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。
4.Fosmid载体与DNA的克隆只需要90分钟。
下图为方法与流程:
粗提DNA的纯化
采用直接提取法提取的总DNA 或多或少都含有腐殖质的存在。
它的存在对后续的分子生物学操作会有影响,时常会导致PCR扩增不出来,酶切困难,连接转化率低。
需要进行纯化。
纯化的方法包括:
胶回收,柱纯化,电泳/电洗脱,梯度离心。
a胶回收
胶回收最大的优点在于快捷,可以在很短的时间内完成。
纯化后的DNA 往往能够满足PCR 要求。
但其缺点在于,膜截留式的纯化方式难免会对DNA 分子造成机械损伤,使得DNA弥散,完整度下降。
如果后续的实验室分析16SrDNA,则这种纯化方式不失为一种好方法。
ﻫ
b 柱纯化
柱纯化相对于胶回收来说更为快速,十几分钟内可完成。
与胶回收相比,其纯化效果要差一些。
但通常情况下,纯化之后的DNA 也能够满足PCR需求。
这种方法也会造成DNA分子的机械损伤,使得DNA弥散,完整度下降。
ﻫ
c电泳/电洗脱
电泳/电洗脱法相对于前两种有很多优点:
其一,其价格低;其二,整个过程都很温和,能够保证DNA的完整性;其三,纯化后的DNA纯度较之前两种要好一些。
但是其亦有些许不便:
其一,过程耗时长,包括透析袋的准备,电洗脱,洗脱液的浓缩等;其二,DNA损失量较前两种大,透析袋上会残留DNA。
如果样品不是很珍贵,并且后续要进行Metagenomic研究,这种方法不失为一种好方法。
如果有脉冲场凝胶电泳系统,用此方法可以得到高纯大片段DNA,可以满足后续的metagenomic C/Fosmid 文库构建。
d蔗糖/氯化铯密度梯度离心
如果实验室有超速离心机(100,000g以上),那么这种方法无疑也是一种好方法。
与电泳电洗脱法相同,这种方法在连续介质中对DNA及杂质进行分离,可以很好的纯化DNA。
纯化得到的DNA经过低熔点凝胶电泳切胶回收,可以得到高纯度大片段的DNA,可以满足后续的metagenomicC/Fosmid文库构建。
纯化质量的检测
DNA纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断,主要包括两方面:
其一,完整度判断;其二,纯度判断。
a 完整度判断
完整度判断同前所述,千万要记得的是加纯化之前的DNA 样品做对照。
结果可以告诉我们纯化得率及完整度。
同样,最好能跑脉冲场凝胶电泳。
b纯度判断
纯度判断通常可以采用两种方法:
分光光度计法和PCR扩增法。
分光光度计可以测定双链DNA在260nm处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。
通过不同波长吸收值的比,可以对DNA 纯度做出判定。
通常这种方法由于灵敏性较高,所以在存在杂质时误差较大。
III.所提DNA完整性检测
DNA的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。
最好采用0.8%琼脂糖凝胶电泳,低电压长时间跑。
至少要用lambdaDNA/Hind III做marker,如果在23kb处有一条完整或略拖尾的带,则证明DNA完整性尚好。
如有条件,可以采用脉冲场凝胶电泳对提取DNA 的完整度进行分析。
用脉冲场凝胶电泳分析时,除了上面提及的那个maker,至少还应该有完整lambdaDNA(约48kb)充当另一个maker。
以上为送测序前样品的采集,DNA的提取,验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。
Illumina所进行的测序是由GenomeAnalyzer测序仪所完成的:
以上为Genome Analyzer技术的基本原理
IV.在DNA提取,检验完成后送BGI进行后续测序。
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- 关 键 词:
- 宏基 实验 计划