蛋白质组学整理修改版.docx
- 文档编号:26656364
- 上传时间:2023-06-21
- 格式:DOCX
- 页数:30
- 大小:773.29KB
蛋白质组学整理修改版.docx
《蛋白质组学整理修改版.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《蛋白质组学整理修改版.docx(30页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
蛋白质组学整理修改版
第1章绪论
(名词解释8个5分简答3个十分论述2个15分)
名词解释:
1.蛋白质组:
指的是由一个细胞、一个组织或是一种生物的基因组所表达的全部相应的蛋白质。
是一个整体概念。
2.蛋白质组学:
旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式和功能模式,其内容包括蛋白质的表达与存在方式(修饰方式),结构与功能,以及各个蛋白质之间相互作用等。
3.可变剪接:
是指同一基因转录形成的RNA前体可经过一种以上剪接方式产生多种不同的mRNA的过程。
可将同一基因中的外显子以不同的组合方式来表现,使一个基因在不同时间、不同环境中能够制造出不同的蛋白质。
从而使蛋白质组的复杂性远远高于基因组。
4.蛋白质翻译后修饰(PTM):
是指对新合成的多肽链或蛋白质进行的化学修饰,主要是磷酸化、糖基化、酰基化、硝基化、磺基化、脂化、泛素化和水解修饰等。
使数量有限的编码基因产生数量巨大的蛋白质。
简答题:
1.基因组与蛋白组的区别与联系
(1)同一性与多样性:
同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的;对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下,蛋白质组的构成是不同的
(2)有限性与无限性:
基因组无论大小,其核苷酸的数量和序列是一定的,对基因组序列的测定是一种“有限”的工作;由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰,包括磷酸化、糖基化、酰基化等,很难确定蛋白质组的蛋白质数量;对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。
(3)静态与动态:
一个个体的基因组自个体诞生到死亡,始终保持不变;个体的蛋白质组,作为新陈代谢的主要执行者,在个体的生命活动中却总是变动的。
(4)周期性与空间性:
基因组通常位于细胞核内,比较稳定,序列和功能一般不受空间的影响,但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期,mRNA的表达是不一样的;不同的蛋白质分布在细胞的不同部位,它们的功能与其空间定位密切相关;许多蛋白质在细胞内不是静止的,他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。
2.重点:
基因组与蛋白组的区别与联系:
区别/联系
基因组
蛋白质组
同一性与多样性
同一个体的基因组不论是在不同的发育阶段或不同种类的细胞里都是一样的;
对于不同类型的细胞或同一个细胞在不同的生理状态下,蛋白质组的构成是不同的。
有限性与无限性
基因组无论大小,其核苷酸的数量和序列是一定的,例如人类基因组长度为32亿个碱基对;对基因组序列的测定是一种“有限”的工作。
由于细胞内大部分蛋白质存在翻译后修饰,包括磷酸化、糖基化、酰基化等,很难确定蛋白质组的蛋白质数量;对蛋白质组的蛋白质种类的确定是一种“无限”的工作。
静态与动态
一个个体的基因组自个体诞生到死亡,始终保持不变;
个体的蛋白质组,作为新陈代谢的主要执行者,在个体的生命活动中却总是变动的。
周期性与空间性
基因组通常位于细胞核内,比较稳定,序列和功能一般不受空间的影响,但是在发育的不同阶段和不同的细胞周期,mRNA的表达是不一样的;
不同的蛋白质分布在细胞的不同部位,它们的功能与其空间定位密切相关;许多蛋白质在细胞内不是静止的,他们常常在不同的亚细胞环境里运动而发挥作用。
孤立作用与相互作用
基因组表达的各种mRNA是彼此孤立的,互不干扰;
蛋白质组中的各种蛋白质却是彼此间有着广泛的相互作用。
单一手段与多种技术
在基因组研究中,DNA测序技术是最基本和最主要的工具,因为基因组的均一性和简单性使得一种单一的技术就能胜任基因组的研究任务;
在蛋白质组研究中,需要的研究技术远远不止一种,并且技术的难度也远远大于基因组的研究技术。
第2章蛋白质概述
名词解释:
1.等电点:
在某一pH的溶液中,氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等,成为兼性离子,呈电中性。
此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。
2、蛋白质是一切生物体中普遍存在的,由20种左右天然α-氨基酸通过肽键相连形成的高分子含氮化合物;
简答题
3、氨基酸的分类、光学性质、重要化学反应
1)非极性(疏水性)氨基酸(8种)A丙氨酸Ala、V缬氨酸Val、L亮氨酸Leu、I异亮氨酸Ile、F苯丙氨酸Phe、W色氨酸Trp、M甲硫氨酸Met、P脯氨酸Pre
2)极性(亲水)中性氨基酸7种G甘氨酸Gly、S丝氨酸Ser、T苏氨酸Thr、C半胱氨酸Cys、Y酪氨酸Tyr、N天冬酰胺Asn、Q谷氨酰胺Gln
3)碱性氨基酸3种H组氨酸His、K赖氨酸Lys、R精氨酸Arg
4)酸性氨基酸D天冬氨酸Asp、E谷氨酸Glu
2、光学性质
1)除甘氨酸外,所有天然α-氨基酸都有不对称碳原子,这其四个不同的取代基可有两种不同的空间排列方式,L型和D型。
它们具有相反的旋光性,也称分子手性。
蛋白质分子中的氨基酸一般为L-型。
2)参与蛋白质组成的20种氨基酸中色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的R基团中含有苯环共轭双键系统,在紫外光区(220-300nm)显示特征的吸收谱带,最大光吸收(λmax)分别为279、278、和259nm。
由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基,因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。
3、重要化学反应
1)与茚三酮反应:
用于氨基酸定量定性测定.
2)与2,4一二硝基氟苯(DNFB)的反应(sanger反应),用于蛋白质N-端测定.
3)与苯异硫氰酯(PITC)的反应(Edman反应),用于蛋白N-端测定,蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。
(初级蛋白质测序)除脯氨酸与羟脯氨酸外,可与其它氨基酸生成蓝紫色化合物。
脯氨酸与羟脯氨酸为黄色化合物。
第3章蛋白质样品的制备
可能会出论述题:
蛋白质样品的制备包含蛋白质分离、提取与纯化3个过程。
简答题:
1.样品制备的原则
(1)全息性,尽可能采用简单方法进行样品处理,以避免蛋白丢失,尽可能获得所有的蛋白质。
(2)应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态(包括多数疏水性蛋白),且制备方法应具有可重现性。
(3)细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解,低温和蛋白酶抑制剂以防止蛋白的降解。
(4)防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。
(5)样品裂解液应该新鲜配置,并且分装冻存于-80℃。
勿反复冻融已制备好的样品。
(6)通过超速离心清除所有的非蛋白杂质,尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白,从而保证待研究蛋白的可检测性。
(7)防止发生人为的蛋白质样品化学修饰,如加入尿素后加温不要超过37℃,防止氨甲酰化而修饰蛋白。
2.制备流程
分为组织活细胞破碎、分离或沉淀蛋白质、纯化蛋白质。
后两步往往是结合在一起进行的。
1)组织活细胞破碎的原则是,在整个过程中最大限度的限制蛋白质的水解和其他形式的蛋白质降解。
2)沉淀溶液样品中的蛋白质,清除杂质是可选择的步骤,主要依赖于样品本身和研究目的,通常建议采用最简单的样品制备方法。
3)蛋白质的纯化是对沉淀的蛋白质进行再溶解,重复沉淀的过程,通常利用冲泡胀溶液稀释样品。
样品破碎与分离蛋白质
3.组织与细胞破碎
(一)温和的裂解方法
通常应用于组分比较简单的样品,例如组织培养的细胞、血细胞和一些微生物,或者用于分析某一特定的细胞器,例如只需要裂解胞质蛋白、完整的线粒体或其它的细胞器。
(二)剧烈的蛋白裂解
常用于难于破碎的细胞,如固体组织内的细胞,或具有坚硬细胞壁的细胞,如酵母细胞,这种方法可以使细胞完全破碎裂解。
4、蛋白质沉淀
这是一种可选择的方法。
如果样本十分重要,想得到完整而精确的样本蛋白质谱,应避免使用沉淀和重溶的方法。
蛋白质裂解
5、裂解液(各组分及其作用)
组成成分及作用:
⑴离液剂:
通过改变或破坏溶液中的氢键等次级键使蛋白质充分伸展,将其疏水中心完全暴露,降低接近疏水残基的能量域。
尿素是常用的离液剂。
⑵还原剂:
还原剂主要是用来断裂蛋白分子中Cys残基之间形成的二硫键,让大多数蛋白完全展开,增加蛋白的溶解性。
⑶表面活性剂:
表面活性剂主要是通过破坏蛋白之间的疏水相互作用,以确保蛋白完全溶解和防止通过疏水相互作用导致蛋白聚合。
(4)起载体作用的两性电解质:
即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下,某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态,否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。
样品预分级
6.分步裂解提取
1.目的与原理
由于蛋白质在细胞中存在部位不同,而不同蛋白质的溶解性亦不相同,为了提高双向电泳的分离效果,有时需要采取分步提取的方法来尽可能的提取更多的蛋白质。
2.方法:
分步提取法所采用的裂解液的溶解性能是逐渐增加的。
第一步裂解液只含有40mmol/LTris,其余为去离子水,只溶解偏亲水性的蛋白。
第二步裂解液属传统的裂解方法,含有表面活性剂CHAPS、还原剂DTT、解聚剂Urea等成分,由于具有良好的溶解能力,可以溶解亲水性、中性和较疏水性的蛋白。
第三步裂解液中添加了能够促进疏水蛋白质溶解的成分,如表面活性剂SB3-10、还原剂DTT、解聚剂thiourea,主要溶解偏疏水性的蛋白。
在多数情况下,大部分蛋白质在第一步和第二步中可被提取。
清除影响电泳的图谱的杂质
样品中的非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白的分离及二维电泳图谱的质量,因此,在样品制备中需考虑清除这些杂质。
第四章蛋白质分离技术
1.双向凝胶电泳(2-DE):
利用蛋白质的等电点和分子量,结合凝胶化学特性,分离各种蛋白质的方法。
基本原理:
第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
2.聚丙烯酰胺凝胶
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel,PAG)是通过丙烯酰胺(acrylamide)单体和双功能团交联剂如N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide)按一定的比例混合,在引发剂和增速剂存在下聚合而成的交叉网状结构,使其产生分子筛效应。
聚丙烯酰胺凝胶的优点
1机械强度高,弹性好,透明,无电渗作用,吸附作用极小;
2化学性质稳定,与待分离的物质不起任何化学反应;
3样品不易扩散,用量小;
4凝胶孔径可通过改变单体和交联剂浓度调节
5分辨率高。
3、IEF原理
等电聚焦电泳(IEF)是利用蛋白质分子或其他两性分子的等电点的不同,在一个稳定的、连续的、线性pH梯度中进行蛋白质的分离和分析。
所以利用等点聚焦技术分析的对象只限于蛋白质和两性分子。
分析的条件是凝胶中有稳定的、连续的和线性的pH梯度。
pH值梯度的存在对等电聚焦技术相当重要。
在pH梯度凝胶内,在电场作用下,蛋白质分子能向使它们所带净电荷为零的点移动。
这就是等电聚焦效应。
1)pH梯度的形成
在电场下载体两性电解质的变化
天然pH梯度法:
在没有电场时,载体两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH范围的平均值(如pH3-10的载体两性电解质溶液,其pH约为6.5左右)。
所有载体两性电解质分子都带有电荷,只是在溶液中的正电荷和负电荷数目相等,净电荷为零。
引入电场时,载体两性电解质分子分别向阴极和阳极移动,最终在分子净电荷为零的位置停止迁移。
2)pH梯度的形成过程
pH梯度形成的时间,视正负电极之间的距离和凝胶的厚度而定。
一般一块长12cm的玻璃,电极间的有效距离为10cm,凝胶的厚度为1mm,使用Ampholine为载体两性电解质,电泳1小时后pH梯度基本形成,2小时后无多大变化,如图
3)载体两性电解质的缺点
利用了合成载体两性电解质(SCA)来生成pH梯度,合成过程复杂,重复性小。
SCA的pH梯度不稳定且分子小易漂移,难以固定在IEF胶内,由于水合正离子引起的电渗流导致阴极漂移现象,是pH的不稳定性增加。
负极漂移作用对碱性区蛋白质的影响很大。
3.固相pH梯度(IPG)原理:
它利用一系列具有弱酸或弱碱的丙烯酰胺衍生物滴定时,在滴定终点附近形成pH梯度,然后将其共价键合在介质上,成为凝胶介质的一部分,从而形成固定的,不随环境电场等条件变化的PH梯度。
4.SDS-PAGE电泳:
原理:
1)蛋白质分子解聚成亚基,解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束,所带的电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量,这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。
2)缓冲系统的选择:
一般来说,在被分析的蛋白质稳定的PH范围,凡不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用。
3)凝胶浓度的选择:
由于SDS电泳分离并不取决于蛋白质的电荷密度,只取决于分子解聚后SDS-蛋白质胶束的大小,因此凝胶浓度的正确选择尤为重要。
不同分子质量范围的蛋白质应选用不同的凝胶浓度。
5.双向电泳的局限性:
(1)SDS等去污剂对蛋白质的变性作用是不可逆的。
(2)疏水性蛋白质因不能溶于SDS而不适合作2-DE;PI值<3或>11的蛋白质;分子量过大或过小的蛋白质;低丰度蛋白质<1ng,都很难被检测到。
(3)样品上样量相对少,使检测的灵敏度受到限制。
(4)电泳结果需经染色处理,不能直接分析,不同蛋白质与染料的结合差异较大。
(5)不能高通量分析,且耗时。
(6)目前尚不能实现完全自动化处理。
第六章层析技术
名词解释:
1、层析法基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理、化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等),使各组分在两相(一相为固定的,称为固定相;另一相流过固定相,称为流动相)中的分布程度不同,从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
吸附层析技术包括吸附柱层析、薄层层析、聚丙烯酰胺层析和疏水层析等。
2、吸附柱层析层析的原理:
利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解度的差异进行分离。
3、薄层层析(Thinlayerchromatography)采用的机制及按固定相的分类
薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相,以液体为流动相的一种层析方法。
薄层层析可根据固定相的种类分为吸附薄层层析(吸附剂为固定相)、分配薄层层析(固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为固定相)和离子交换薄层层析(离子交换剂为固定相)等。
4、聚酰胺薄膜层析的原理:
聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键,对极性物质有很强的吸附作用。
这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。
被分离物质与酰胺基团形成氢键能力的强弱,确定了吸附能力的差异。
在层析过程中,展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键,选用适当的展层溶剂,使被分离的各种物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异经过吸附与解吸的展层过程,形成一个分离顺序,彼此分开。
5、疏水层析的原理:
在高离子强度的盐水溶液淋洗条件下,蛋白质的疏水部分与填料表面的疏水基团相互作用而被吸附。
淋洗液的离子强度降低,蛋白质依疏水性特征依次被洗脱。
即高盐浓度吸附,低盐浓度洗脱。
6、分配层析技术原理
利用混合物在两种不相混溶的液相(固定相和流动相)之间的分配系数的不同而达到分离各组分的目的。
固定相液体均匀覆盖于载体表面,流动相流过固定相。
7、凝胶过滤层析原理
凝胶颗粒内部具有多孔网状结构,被分离的混合物流过层析柱时,比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内,在凝胶颗粒之间的空隙向下移动,并最先被洗脱出来;比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外,在柱内经过的路程较长移动速度较慢,最后被洗脱出来。
8、离子交换层析的原理
原理:
是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
9、亲和层析原理
利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生物大分子,如:
抗原和抗体;酶和底物或辅酶或抑制剂;激素和受体等。
10.高压液相层析分类
正相色谱法:
共价结合到载体上的集团都是极性的基团,流动相的极性比固定相的极性弱;在这种层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子移动的速度快,先从柱中流出来。
反相色谱法共价结合到载体上的基团是一些直链碳氢化合物,流动相的极性比固定相的极性强。
在这种层析过程中,极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。
第七章生物质谱技术和蛋白质鉴定
名词解释:
1.软源:
离子化能量低,产生的碎片少,谱图简单,可得到分子离子峰,即得到分子量信息。
硬源:
离子化能量高,伴有化学键的断裂,谱图复杂,可得到分子官能团的信息。
2.质谱图:
以质荷比m/z为横坐标,以对基峰(最强离子峰,规定相对强度为100%)相对强度为纵坐标所构成的谱图。
3.生物质谱技术
1)衰变
A.源内衰变技术(insource-decay,ISD),发生在离子源区域内,时间为激光撞击之后的几百纳秒之内,是离子的“即刻片段化”。
可以通过线性时间飞行质谱中检测到;可用于鉴定蛋白质;
B.源后衰变技术:
样品分子首先发生离子源内活化,在激光照射的第一秒内发生解吸附的离子与基质之间会发生低能碰撞,使样品离子活化,进入第一级无电场漂移区时有可能发生裂解。
这一过程发生在源内离子化之后,被称为源后衰变。
2)碰撞诱导解离:
是通过惰性气体撞击,使得多肽的肽键断裂的过程。
大分子肽延肽链在酰胺键处断裂成肽离子片段,电荷保留在N端的碎片上定名为a,b,c离子;电荷保留于C端的碎片上时称之为x,y,z离子。
主要产生含N端的b型和含C端的y型片段离子。
3)串联质谱:
串联质谱主要由离子源、多级质量分析器及碰撞室组成。
第一级质量分析器起质量过滤器作用,即从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子进入碰撞室,母离子在高速惰性气体碰撞诱导解离产生碎片即子离子,由第二级质量分析分析子离子的质荷比。
通过分析母离子与子离子的质量,研究二者关系及母离子的裂解规律,可以获得母离子的结构信息。
4、肽质量指纹谱PMF:
是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。
由于每种蛋白的氨基酸序列(一级结构)都不同,当蛋白被水解后,产生的肽片段序列也各不相同,因此其肽质量指纹图也具有特征性。
5、肽序列标签(peptidesequencetag,PST)由一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量等组成。
数据库检索鉴定蛋白质时,可用读出的部分氨基酸序列,结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子质量,在数据库中查询,对肽段进行鉴定。
简答题:
1.电喷雾电离
原理:
样品溶解在溶剂中,溶液从毛细管流出时,在电场及辅助气流作用下喷成雾状的带电微液滴,在加热气体作用下,液滴中溶剂被蒸发,导致液滴直径逐渐变小,表面电荷密度增加。
当表面电荷产生的库仑排斥力与液滴表面张力大致相等,液滴炸碎,产生带电的更小微滴;这些液滴中溶剂再蒸发,重复直至样品以离子方式从液滴表面蒸发,进入气相。
这些样品离子通过锥孔、聚焦透镜进入质谱仪分析器后被检测。
优点:
测定分子质量高;灵敏度极高(10-15mol);软电离,可观察生物分子非共价反应;
易于和LC串联,直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液;没有基质干扰;适于四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析;带多电荷,允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子,通过计算平均值给出更精确的质量数;特别适于测多肽的修饰;样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。
缺点:
耐盐能力低;对某些化合物特别敏感,污染难清洗;样品需先气化;带多电荷,在分析混合物时,产生混乱;定量时需内校准。
2.基质辅助激光解析电离:
原理:
MALDI是将样品均匀包埋在固体基质中,基质吸收激光提供的能量而蒸发,携带部分样品分子进入气相,并将一部分能量传递给样品分子使其离子化。
离子化后的分子被电场加速进入飞行时间质量分析器而被检测。
基质在MALDI-TOFMS的方法中的作用主要是从激光脉冲中吸收能量并使被测分子分离成单分子状态。
优点:
质量数可达300,000Da;10-15至10-18级灵敏度;软电离方式,无或极少碎片离子;
耐盐(样品含盐可达毫摩尔浓度);适于分析复杂混合物。
缺点:
分辨率低;1000Da以下基质峰干扰;激光解吸附离子化有可能使样品光降解;不能分析非共价键相互作用;定量时需要内校准;如没有反射飞行装置,不能分析多肽修饰。
MALDI的进样是固相方式,不像ESI的液相进样容易受溶液性质的影响,因此对杂质的忍耐性较好。
3、
3.飞行时间质量分析器为什么加离子镜反射?
即增加了一个反射电场,起到能量聚焦作用,使质量相同能量不同的离子进入反射器后,能量大的离子速度快,但走的距离远,能量小的离子速度慢,但走的距离近,经过反射后,二者同时到达检测器,这样就消除了由于能量分散造成的分辨率降低;且离子改变了飞行方向,延长了飞行距离,提高分辨率和准确度。
4.串联质谱测定多肽序列的原理:
多肽碰撞诱导解离时的碎裂作用优先发生在酰胺键上,生成专一的序列离子。
电荷保留在N端的碎片上定名为a,b,c离子;电荷保留于C端的碎片上时称之为x,y,z离子。
y、b系列相邻离子的质量差,即为氨基酸残基质量,根据完整或互补的y、b系列离子可推算出氨基酸的序列。
第八章蛋白质功能研究
蛋白质相互作用研究策略和方法
(一)生化方法
GST(谷胱甘肽巯基转移酶)pull-downassay,亲和印迹,免疫共沉淀,化学交联,荧光共振能量转移FluorescentResonantEnergyTransfer(FRET),表面等离子共振技术(SurfacePlasmonResonance,SPR),生物传感器技术(Biosensor)
1.GSTpull-downassay
基本原理
细菌表达的谷胱甘肽s-转移酶(GST)融合蛋白主要用于蛋白的亲和纯化,也可以将GST融合蛋白作为探针,与溶液中的特异性搭档蛋白结合,然后根据谷胱甘肽琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。
一般在得到目标蛋白的抗体前,或发现抗体干扰蛋白质-蛋白质之间的相互作用时,可以启用GST沉降技术。
该方法只是用于确定体外的相互作用。
两种应用:
1)确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间的新的相互作用
2)证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用
2.亲和印迹
蛋白质用PAGE胶分离后,转移到硝酸纤维素膜上,然后用特异性的蛋白质、肽段或配体来检测膜上的蛋白质。
3.免疫共沉淀
在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的固化于Agarose珠上的ProteinA或G,若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:
“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—ProteinA或G”,通过离心分离,经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,复合物又被分开。
然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
4、化学交联
使用一种交联试剂,并且在交联试剂的光激活部分带有标记,将该试剂耦联到一蛋白质上,耦联体与抽提物温育在一起。
如果抽提物中的A蛋白能与耦联蛋白质发生相互作用,用光激活后交联剂的一部分就结合到A蛋白上。
加入还原剂,切割交联试剂,使A蛋白上带有交联剂上有标记的部分,然后用凝胶电泳等方法分析蛋白质。
5.荧光共振能量转移(FRET)
FRET是一个无辐射、量子级能量转移现象,它指的是当一个荧光分子(及供体)受到激发时,能量向邻近的另一荧光基团(即受体)转移的过程。
但仅当受体和供体的距离小于10nm,且激发光谱相重叠时,FRET才能发生。
并且随着光谱重叠的增加,FRET的效
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 蛋白质 整理 修改