炭疽病诊断治疗与处置方案.docx

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炭疽病诊断治疗与处置方案

炭疽病诊断治疗与处置方案

〔2005年版〕

炭疽〔anthrax〕是炭疽杆菌（Bacillusanthracis）引起的动物源性传染病。

炭疽杆菌要紧从皮肤侵入引起皮肤炭疽，使皮肤形成焦痂溃疡与周围脓肿和毒血症，也可引起吸入性炭疽或胃肠炭疽，均可并发败血症。

炭疽杆菌有可能作为生物武器被恐惧分子所利用，因而近年来得到国际社会的普遍关注。

病原学

炭疽杆菌是形体最大的革兰氏阳性杆菌，大小1～1.5⨯3～5μm，两端平截，呈链状排列，镜下形状呈竹节状〔图1〕，链的长短因菌株和细菌所在环境而异。

在人体、动物体内或特定环境条件下〔于碳酸盐琼脂培养基上于5%～25%CO2下培养〕，该菌可形成荚膜〔图2〕，印度墨汁染色可见杆菌周围的透亮环，碱性美蓝染色荚膜呈红色〔图3〕。

在体外环境下可形成芽胞〔图2〕，未游离的芽胞在菌体中央。

此菌无鞭毛，不运动。

该菌在一般培养基生长良好，最适培养温度为35℃～37℃，一般孵箱培养和CO2孵箱培养均可，在厌氧条件下也能生长。

一般营养琼脂平板上形成的菌落为粗糙型，表面潮湿，呈狮子头状，有的菌株在菌落一侧形成尾突〔图4〕。

于血琼脂平板上培养15～24h，分离较好的菌落直径为2～5mm，扁平和微突起的菌落呈不规那么圆形，边缘为波浪状，表面光滑。

培养物为黏性，当用接种环挑取时会形成立起的尾状突起〔图5〕。

炭疽杆菌不造成β-溶血〔图6〕，但在长时刻融合，过度生长区可能见到柔弱溶血现象，不能与β-溶血混淆。

低倍显微镜下菌落边缘呈卷发样，称为狮头样菌落〔图4〕。

该菌在纯培养菌接种肉汤培养的基培养特点为絮状沉淀生长，肉汤培养基不混浊。

图1在血琼脂平板上炭疽杆菌革兰氏染色

〔放大1000倍〕

图2炭疽杆菌

左图为带芽胞炭疽杆菌，革兰氏染色〔⨯1000〕；右图为游离芽胞，为孔雀绿染色。

图3炭疽杆菌感染动物脏器压片

炭疽杆菌排列竹节状，美蓝染色，荚膜为粉红色，菌体为蓝色。

图4炭疽杆菌在一般营养琼脂平板上过夜培养后形成的菌落形状

左图，表面粗糙、有尾状突出部分；右图为典型的〝狮子头〞样菌落，呈卷发样〔⨯100〕。

图5炭疽杆菌在血琼脂平板上形成的黏性菌落

图6炭疽杆菌〔右侧〕和腊肠样芽胞杆菌〔左侧〕

炭疽杆菌生化反应不活跃，卵黄反应、硝酸盐还原和明胶液化以及触酶均为阳性，不分解淀粉和甘露醇。

抗原结构可分为两大组，即菌体抗原和外毒素。

菌体抗原包括荚膜多肽和菌体多糖。

荚膜具有抗吞噬作用，与毒力有关，细菌变异不形成荚膜时，致病性也随之消逝。

多糖抗原与毒力无关。

外毒素复合物由水肿因子、致死因子和爱护性抗原组成。

特异性裂解炭疽杆菌γ噬菌体可用于该菌的鉴定。

但不同来源的菌株对该噬菌体的敏锐性不同，极少数腊样芽胞杆菌对该噬菌体敏锐〔如ATCC4342株〕，也发觉缺失两个毒力质粒的菌株对该噬菌体不敏锐〔如CDC680株〕。

在进行噬菌体裂解鉴定细菌时，应采纳分区划线接种法，在第一、二区滴加一定浓度的噬菌体。

具有两个毒力质粒的强毒株比较敏锐，在平板上第一、二区均可见到裂菌的透亮环，但第二区更明显；缺乏pX01质粒的菌株在第一、二区均可见较大透亮裂菌环；而缺乏pX02质粒的Sterne株在第一区形成更加透亮的裂菌环。

这种现象与质粒的有无并无直截了当关系，试验证实，具有pX01质粒的菌株在血琼脂平板上生长18～20h，比缺失该质粒的菌株可形成更多数量的芽胞，因此，具有pX01质粒的菌株在一般培养平板上生长时，形成大量芽胞，产生大量细胞碎片，当噬菌体加入时，会与细胞碎片上的受体结合而失活；反之，当噬菌体加入缺失pX01质粒的菌株生长物时，大部分噬菌体会感染细菌，使之裂解。

炭疽杆菌繁育力、抗击力与一样细菌相同，但芽胞抗击力较强。

常规消毒剂如石炭酸、煤酚水、新洁尔灭等季铵盐类消毒成效较差；过氧乙酸、甲醛、环氧乙烷、0.1%碘液和含氯制剂杀芽胞成效较好。

高压121℃30min，干热140℃3h可杀死芽胞。

炭疽杆菌对青霉素敏锐，培养试验10U/ml即可抑制细菌生长，对链霉素、四环素、卡那霉素也都敏锐。

流行病学

人类要紧经接触牲畜的毛皮和肉类获得感染，食肉动物也可从食草动物获得感染，并辗转感染人类。

与牲畜接触频繁的人如牧民、兽医和屠宰工人的感染机会较多。

被炭疽杆菌污染的毛、皮进入加工企业，或感染的肉类进入市场，也可能造成暴发流行。

人类感染炭疽杆菌要紧通过接触途径，以皮肤炭疽最为常见。

通常散发，病死率不高，能够完全治愈，部分甚至能够自愈。

然而，由于严峻污染造成的吸入感染，或感染牲畜的肉类引起的食入感染，可能造成吸入性炭疽及胃肠炭疽的暴发流行，病死率甚高。

严峻感染者有时发生炭疽性脑膜炎。

炭疽在我国普遍存在，历年来发病数波动不大，全国的发病数在数百至千余例范畴内。

高发的省区较为固定，在过去的5年中排序为：

贵州、新疆、甘肃、四川和广西。

有几方面的缘故造成这些省区的高发：

畜牧业的进展，群众屠宰病畜的适应，这些都造成土壤污染面积的增加。

此外，诊断率还与医务人员对本病的警觉性有关。

炭疽的诊断时往往需要流行病学证据的支持，但由于炭疽杆菌在自然界存在时刻专门长，这种流行病学证据有时难以获得。

专门是在诊断皮肤炭疽时，不应要求必须具备流行病学证据。

在受到炭疽杆菌作为生物武器的突击情形下，炭疽的流行病学可能与和平条件下完全不同。

病理学及发病机理

一、炭疽发病机理

炭疽杆菌的致病性与其产生的外毒素和多肽荚膜有关，二者分别由2个质粒〔pX01及pX02〕编码。

荚膜有抗吞噬作用，pX02缺失的菌株不能形成荚膜那么易被白细胞吞噬并杀死，因而没有致病作用。

炭疽杆菌的外毒素由3个蛋白组成：

爱护性抗原〔PA〕,致死因子〔LF〕和水肿因子〔EF〕。

PA结合于细胞表面受体，作为另两因子的结合位点。

二者一旦结合，PA受体复合物就会促进LF和EF进入细胞内。

LF和PA结合形成致死毒素〔LT〕，EF和PA结合形成水肿毒素〔ET〕。

LT在细胞内使要紧的丝裂素蛋白活化激酶失活。

干扰细胞内信息传导，开释氧自由基及前炎症细胞因子，引起细胞死亡，并破坏血管屏障。

ET作为一个钙调蛋白依靠性腺苷环化酶可导致细胞内cAMP水平的急剧增加，导致平稳破坏，抑制中性粒细胞，使人体对炭疽杆菌更加敏锐，致局部受染，并发生水肿。

这2个毒素和毒血症状有关，严峻时可导致多器官衰竭死亡。

炭疽杆菌繁育体或芽胞进入人体后，被吞噬细胞吞噬，芽胞即复苏繁育，产生外毒素并形成抗吞噬的荚膜。

外毒素直截了当引起局部组织水肿，出血、坏死，并可引起全身毒血症状。

抗吞噬的荚膜那么使细菌更易于扩散，引起导流的淋巴结出血坏死，甚至侵入血流引起败血症。

如侵犯脑膜，可致脑膜出血、水肿。

二、炭疽的病理学变化

依照感染途径不同，人类炭疽分为皮肤炭疽、吸入性炭疽和胃肠道炭疽3种要紧原发病类型。

〔一〕皮肤炭疽

要紧发生在皮肤暴露部位，如手臂、面颈。

当炭疽杆菌或芽胞从损害的皮肤进入体内后，第一在局部大量繁育，产生外毒素，致局部皮肤水肿、出血、组织坏死。

皮肤炭疽的埋伏期一样为2～3天〔9h～12天〕，第一在局部显现小而痒的丘疹，次日即见疹中心变成小水疱，周围组织肿胀，继之，中心部坏死，形成一无痛性脐形溃疡，直径1～3cm，溃疡周围环以水疱，疱内为浆液血性液体，含大量炭疽杆菌。

溃疡的坏死组织与血性渗出物形成一特点性黑色痂皮，特称结痂〔eschar〕。

病变部神经纤维变性，故局部无痛感。

溃疡周围组织水肿十分明显。

显微镜下，局部显著充血，皮肤表层坏死，真皮水肿、坏死、出血，炎细胞反应轻微，或仅见轻度中性粒细胞浸润，或见血管炎，血管周围单个核细胞浸润。

局部可发生淋巴结肿大、水肿出血、疼痛。

头颈部的皮肤炭疽，水肿常专门快沿着软组织扩散致颈、胸、肩部，甚者可致呼吸困难，这种广泛水肿称为恶性水肿。

一样黑痂形成数日后开始缓慢愈合，2周后水肿可渐吸取，痂皮脱落，80%可自然愈复。

对皮肤炭疽禁忌切除，重症病例可并发败血症或引起炭疽性脑膜炎。

图7皮肤炭疽

左图：

面部炭疽，下眼睑溃疡焦痂形成，眼睑及面部水肿

右图：

下肢炭疽，下肢水肿、溃疡焦痂周围绕以水泡

溃疡的渗出物内有大量炭疽杆菌，取渗出物涂片作细菌染色有助于确诊。

用Steiner染色，炭疽杆菌呈黑色，用革兰氏染色炭疽杆菌呈紫色。

抗生素治疗＜55h，细菌仍较多，治疗超过72h，细菌将明显减少，革兰氏染色可能为阴性，现在可做免疫组化染色。

如应用抗炭疽杆菌细胞壁抗体、抗炭疽杆菌荚膜抗体做免疫组化染色。

免疫组织化学检查除能显示细菌，还能显示细胞内外的细菌碎片或颗粒状抗原，有助于对通过治疗患者的确诊。

〔二〕吸入性炭疽

由吸入炭疽芽胞引起感染，埋伏期尚未完全确定，估量高剂量吸入埋伏期为1～6天，中位数为4天。

吸入的炭疽芽胞在肺内赶忙被肺泡吞噬细胞吞噬，几小时之内，被转运至纵隔淋巴结，肺内不遗留特异性炎症。

早期胸部X线检查均有专门，要紧为纵隔增宽、胸水或有肺部小的浸润灶〔水肿〕。

尸检可见纵隔、肺门和支气管旁淋巴结呈急性充血、出血，有中性粒细胞浸润和细胞碎片，并含有大量炭疽杆菌，有的小血管内可见新奇血栓，这些改变使淋巴结肿大，大者直径达4～6cm，淋巴结周围的脂肪结缔组织也可显现高度水肿、充血、大片出血，使整个纵隔呈胶冻样水肿团块。

胸膜也可水肿增厚，胸腔内见有大量浆液血性积液。

肺泡内可有不同程度的水肿，局灶性透亮膜形成。

吸入性炭疽早期查痰无意义。

一样来说，胸膜表面及胸腔积液内含有大量炭疽杆菌，取胸水检测可助于确诊。

用抗生素治疗3天以上，革兰氏染色常为阴性，现在可取胸水离心，将细胞制成蜡块，用切片作免疫组化染色〔用抗炭疽杆菌荚膜抗体或细胞壁抗体〕，可见杆菌片断和颗粒状抗原。

说明免疫组化染色在确诊中较为重要。

此外，聚合酶链反应〔PCR〕也可证实胸水中的炭疽杆菌。

图8吸入性炭疽的病理改变

A纵隔出血水肿淋巴结出血肿大B纵隔软组织出血

C纵隔淋巴结组织坏死、核固缩D淋巴结可见免疫母细胞及固缩核

吸入性炭疽可发生败血症，脾脏充血肿大，脾髓内含有大量的炭疽杆菌。

在肝窦、枯否细胞、肠浆膜面及肠黏膜下血管内均见炭疽杆菌抗原。

吸入性炭疽也可发生脑膜播散引起出血性脑膜炎，脑脊液〔CSF〕中培养出炭疽杆菌。

〔三〕胃肠炭疽

在自然感染中，胃肠道炭疽较多见，系由于食入炭疽杆菌污染严峻的未熟肉类感染。

胃肠道炭疽分为2型：

口咽型及胃肠型〔腹型〕。

1、口咽炭疽

大多为单侧，多数病变位于扁桃体，也见于悬雍垂及软腭。

早期病变为局部水肿、充血，第一周末黏膜中心坏死，溃疡形成，第二周初溃疡上可见假膜。

所有患者均有颈部肿胀，75%为单侧，淋巴结肿直径可达4cm。

软组织肿胀与淋巴结肿大同时存在可压迫患者的呼吸道。

曾有报道，5例原诊为扁桃体脓肿而行手术探查，但没有化脓。

另有报道，24例中3例死亡〔死亡率13%〕，此3人的埋伏期均小于24h，提示感染更为严峻，血培养可为阴性，咽拭子为阳性，说明咽拭子对口咽炭疽的确诊甚为重要，PCR及免疫组化染色也有助于诊断。

2、胃肠型炭疽

因进食被炭疽杆菌污染的食物而发病，肠道病变通常位于回肠及盲肠，肠壁水肿出血、坏死，肠黏膜有溃疡，肠系膜淋巴结肿大，伴或不伴有血性腹水，沾有血的粪便中可培养出炭疽杆菌。

图9盲肠升结肠水肿出血，肠系膜淋巴结肿大

临床表现

埋伏期：

一样为1～5日，也有短至12h，长至2周者。

随炭疽杆菌侵入途径及部位的不同，临床上要紧分为皮肤炭疽、吸入性〔肺型〕炭疽和食入性〔胃肠型〕炭疽。

部分患者可进展为败血症、脑膜脑炎等重症，预后不行。

一、皮肤炭疽

约占95%～98%，病变多见于手、脚、面、颈、肩等裸露部位皮肤。

最初为皮肤破旧部位〔皮肤破旧轻微时，可无明显伤口〕显现斑疹或丘疹，第2日在皮疹顶部显现小水疱而成疱疹，内含淡黄色液体，周围组织变硬而肿胀。

第3～4日病变中心出现出血性坏死、组织稍下陷，周围有成群小水泡，水肿区连续扩大。

第5～7日坏死区溃破成浅溃疡，血样渗出物结成硬而黑似炭块状焦痂，痂下有肉芽组织生成。

溃疡直径1～5cm不等，其周围皮肤浸润及水肿范畴较大，直径可达5～20cm。

由于局部末梢神经受损而无明显疼感和压痛，有轻微痒感，无脓肿形成，这是皮肤炭疽的特点。

以后随水肿消退，黑痂在1～2周内脱落，肉芽组织增生愈合缓慢。

大多数病例为单灶性发病，但个别病例可因抓挠病变部位而显现多处疱疹，致自身感染。

病程约1～6周。

皮肤炭疽发病同时，多显现发热〔38℃～39℃〕、头痛、关节痛、全身不适以及局部淋巴结和脾肿大等中毒症状和体征。

少数病例皮肤局部无水疱和黑痂形成而表现为大块状水肿，患处肿胀透亮、微红或惨白，扩展迅速，多见于眼睑、颈、大腿及手部等组织疏松处。

全身中毒症状严峻，表现为高热、头痛、恶心、呕吐，假设贻误治疗，预后不良。

图10吸入性炭疽患者的纵隔增宽

二、吸入性炭疽

因暴露于芽胞或吸入污染芽胞尘埃所致。

急性起病。

多在暴露后2～5天显现低热、疲劳和心前区压迫等，连续2～3天后，症状突然加重，轻者表现为胸闷、胸痛、发热、咳嗽、咯带血黏液痰。

重者寒战、高热、由于纵膈淋巴结肿大、出血并压迫支气管造成呼吸窘迫、气急喘鸣、咳嗽、紫绀、血样痰等，并可伴有胸腔积液。

肺部体征与病情常不相符。

听诊肺部仅可闻及散在的细小湿罗音或有摩擦音、呼吸音降低等胸膜炎体征。

X线检查见纵隔增宽、胸水及肺部浸润性阴影。

常并发败血症及脑膜炎，假设不能及时诊断、积极抢救，患者多在急性症状显现1～2天内发生感染中毒性休克、呼吸衰竭或循环衰竭而死亡。

三、胃肠型炭疽

要紧由于食入未煮熟的被炭疽杆菌污染的病蓄的肉类食品而引起，偶而可因饮入被炭疽病菌污染的水或牛奶而患病，与患者一起进食的人可相继发病。

临床上可表现为口咽部炭疽和胃肠道炭疽。

口咽部炭疽：

表现为严峻的咽喉部疼痛，颌下及颈部明显水肿、局部淋巴结肿大，水肿压迫食管引起吞咽困难，压迫气管时可引起呼吸困难。

胃肠道炭疽：

症状轻重不一，轻者恶心呕吐、腹痛、腹泻，但便中无血，里急后重不明显，可于数日内复原。

重者可表现为腹痛、腹胀、腹泻、血样便等急腹症症状，易并发败血症和感染中毒性休克。

如不及时治疗常可导致死亡。

四、其他临床表现

炭疽性败血症：

吸入性炭疽、胃肠型炭疽和严峻的皮肤炭疽可继发败血症，除局部症状加重外，表现为全身毒血症加重，高热、寒战、衰竭等。

炭疽性脑膜炎：

继发于皮肤炭疽的病例小于5%。

极个别病例可继发于吸入性和胃肠型炭疽。

临床表现为化脓性脑膜炎，起病急骤，有剧烈头痛、呕吐、昏迷、抽搐，明显脑膜刺激症状，脑脊液多呈血性，少数为黄色，压力增高，白细胞数及中性粒细胞增多。

病情进展迅猛，常因误诊得不到及时治疗而在发病后2～4日内死亡。

实验室检查

一、血常规检查

要紧为白细胞计数升高。

一样为10～20×109/L，病情严峻时高达60～80×109/L。

分类显示中性粒细胞增高，可达70%以上。

二、病原学检查

炭疽杆菌的病原学操作，应在生物安全二级实验室中进行。

1、涂片及培养：

采集皮肤溃疡的渗出物、排泄物、血、胸腹水及脑脊液等标本进行涂片和培养。

所采标本经涂片、革兰氏及碱性美蓝染色后行显微镜检查，可观看到大量两端平齐、呈长串联状排列的革兰氏阳性杆菌，菌体较大，周围围绕荚膜。

陈旧培养物经孔雀绿芽胞染色可见到大量的细菌芽胞。

荚膜染色：

在玻片上涂组织液，或荚膜菌培养物，自然干燥。

置纯甲醇或乙醇中固定1min，取出晾干。

滴加多色美蓝染料染色3～5min，在次氯酸盐中脱色。

水洗，吸干，油镜观看。

菌体出现蓝色，荚膜出现红色。

所有标本都应赶忙涂片，染色，进行显微镜检查。

随后进行细菌培养。

2、PCR检测：

在正常的无菌标本〔如血液、脑脊液〕涂片镜检中，未发觉大量均一的革兰氏阳性杆菌，而仅依靠细菌分离培养才能获得可疑的炭疽杆菌的细菌时，应尽可能进行PCR检测。

可直截了当使用临床标本进行检测，也应对分离获得的培养物检测，标本可经沸水浴10min处理，或经蛋白酶K消化，并使用碘化钠-玻璃粉吸附以富集DNA。

举荐检测质粒上的爱护性抗原基因〔pag〕，荚膜形成基因〔cya〕和染色体上的炭疽杆菌特异基因〔ropB〕。

举荐的引物序列为：

pag:

F:

5’-ATTTGCGGTAACACTTCACT-3’,R:

5’-AGACCGTGACAATGATGGAA-3’；cya:

F:

5’-CGGATTGTATATGGAGTGGG-3’,

R:

5’-GGGACAGGAATGTTTGGATC-3’；ropb:

F:

5’-GTACGCCAATCGATATCATG-3’,

R:

5’-GATCATCGTCATCTTCCGTA-3’。

PCR反应体系为50µl，包括以下成分：

10×反应缓冲液，5µl；4×dNTP混合物〔每种2.5mM〕，4µl；引物〔上游〕，1µl，引物〔下游〕，1µl；内部对比模板，1µl；待测模板，1µl；无菌去离子水，36.75µl；TaqDNA聚合酶，1ｕl；反应条件：

95℃预变性5min，1个循环，之后95℃1min，55℃1min，72℃1min。

30个循环。

最后72℃延伸5min。

结果分析：

采纳常规琼脂糖凝胶电泳，读胶仪检测。

由于PCR技术有时会显现交叉污染和假阳性反应，应采取抗污染的PCR扩增方法，并对检测结果进行必要的PCR产物序列测定，以排除污染。

【标本采集时本卷须知】

此操作规范应在生物安全二级实验室内进行。

采集的标本不得用解剖的方式猎取。

所需的血液与组织标本，均应以穿刺方式取得。

尽可能在抗生素治疗开始前采取标本。

依照炭疽病例的不同型别酌情采集病灶标本。

1、皮损部位标本的采集：

皮肤炭疽水泡期时，注意无菌操作，以无菌棉签从未破溃水泡内沾取水泡液〔水泡期内以革兰氏染色法较易发觉炭疽杆菌〕；在结痂期时，收集焦痂组织时需小心提起外层的焦痂组织，以无菌棉签取焦痂组织转动棉签2～3s，以保证有足够的标本。

2、血培养：

无菌条件下采集全血5～10ml。

3、粪便：

运送大便标本应注意放置在清洁、干燥，无菌和密闭的容器内，标本应大于5g。

对部分无法收集粪便标本的患者，能够肛试子插入肛门1英寸采取标本。

4、痰培养：

收集痰标本应大于1ml，应以无菌密封容器运送。

无痰液者，应取培养基、打开平皿盖，将积液置于距离患者口鼻10cm处；令患者对平皿咳嗽，然后迅速盖上平皿。

5、其他体液标本：

胸腔积液或脑脊液等标本，按照规定的程序穿刺取得。

6、尸体标本：

患者死于炭疽时，可通过穿刺心脏获得血液或穿刺肝脏等实质脏器获得组织标本。

【标本运输及储存】

1、拭子：

室温直截了当运输至实验室，如运输时刻超过1h，在2～8℃运输。

2、粪便：

1h内运输新奇大便至实验室，如运输时刻超过1h，在2～8℃运输。

3、痰液：

以无菌有盖的容器常温运送，如运输时刻超过1h，在2～8℃运输。

4、血培养标本：

室温直截了当运输至实验室。

【标本培养的操作】

按标准操作程序进行。

所有污染的和陈旧的标本，均应第一制成悬液。

依照标本中含炭疽杆菌量的多少，可将悬液适当稀释，或经自然沉淀除去粗大沉淀物后，再以10000g/min离心5min，取富集的沉淀物。

将所得的悬液沸水浴加热15min后涂布平板。

培养过程：

适宜温度35℃～37℃；环境气体：

洁净空气或少量CO2。

培养周期，至少培养3天，每日观看，在培养18～24h内即可开始观看，少数炭疽杆菌在培养8h后即生长。

菌落特点：

一样在SBA培养平板培养15～24h，生长完好的菌落大约直径2～5mm。

菌落呈平或不规那么的突起，边缘略不规那么，毛玻璃外观，菌落边缘有〝逗号〞形，显微镜下观看边缘呈明显〝狮头样〞菌落。

血平板上炭疽杆菌不溶血，过度生长的菌落有轻微溶血，但与β溶血链球菌有明显区别。

需对比观看在SBA和MAC培养基的生长，因炭疽杆菌在SBA培养基生长良好而在MAC培养基不生长。

炭疽杆菌生长迅速，接种浓度高的局部，6～8h能够看到菌落生长，个别或可在12～15h内看到菌落生长，利用这一特性，能够将炭疽杆菌与其它生长较慢的细菌进行区分。

炭疽杆菌鉴定：

含上述可疑菌落取出，划线接种于平板之上，在划线区内一处滴1滴诊断用炭疽噬菌体，另一处贴一片青霉素纸片。

37℃孵育8～24h后，在噬菌体处有透亮噬菌斑，青霉素纸片周围有明显的抑菌环，便可判定接种物为炭疽杆菌。

三、免疫学检查

在从患者标本中未获得炭疽杆菌阳性和分离结果的情形下，可依据血清学检验结果确定对患者的诊断。

首份血清应在首次检视患者时采取，通常应一次采取血液标本供涂片镜检、细菌分离培养、血清学抗体检查及常规的血液检查使用。

血清分离后置4℃储存，应在5天内完成检测。

如超过5天，应放置于-20℃冰箱储存。

复原期血清应在发病后15天左右采取。

复原期血清应在发病后15日左右采取。

〔一〕酶联免疫吸附试验〔ELISA〕

采纳酶联免疫吸附试验，检测患者血液内炭疽杆菌爱护性抗原的抗体，试验方法如下。

1、滴定板包被：

所用各孔加入炭疽杆菌爱护性抗原〔PA〕液〔0.3μg/ml〕100μl，酶标板贴上封口膜，置4℃过夜。

次日，弃孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100μl，洗涤3次，每次3min。

洗涤缓冲液配方为：

Tris

2.42g

1MHCl

13ml

Tween-20〔0.05％〕

0.5ml

加蒸馏水至

1000ml

2、待检血清：

样本的初筛：

每孔加入100μl待测血清，按倍比稀释〔稀释液为生理盐水〕至1∶8，置37℃60min。

弃孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100μl，洗涤3次，每次3min（同时做空白、正常血清对比）。

复判：

每份阳性血清做双复孔检测其滴度，增加测定结果的可分析性。

3、耦联酶标记：

于各反应孔中加入新奇稀释的工作浓度的辣根过氧化物酶标记SPA或抗人IgG100μl，酶标板贴上封口膜，置37℃60min。

弃孔内溶液，每孔加洗涤缓冲液100μl，洗涤3次，每次3min。

4、显色：

于各反应孔中加入等体积混合的显色底物A、B溶液100μl，酶标板贴上封口膜，置暗处20min。

于各反应孔中加入显色终止液〔0.5MH2SO4〕100μl终止反应。

底物A液〔磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.0〕配方为：

0.2MNa2HPO4（28.4克／L）

25.7ml

0.1M柠檬酸（19.2克／L）

24.3ml

H2O2

0.1%

蒸馏水

50ml

底物B液〔TMB〈四甲基联苯胺〉使用液〕配方为：

TMB

3.90g

柠檬酸

10.52g

EDTA

1.86g

甘油

2000ml

DMSO

300ml

加热溶解后加蒸馏水至

10000ml

5、结果判定：

实验结果可用酶标仪判读，被检孔吸光度〔A〕值达阴性血清对比孔OD值的2.1倍时，可判定为阳性。

注：

技术说明

⑴在从患者标本中未获得炭疽芽胞杆菌阳性和分离结果的情形下，可依据血清学检测结果，确定对患者的诊断。

⑵目前多采纳酶联免疫吸附试验〔ELISA〕进行炭疽特异性抗体检测，一样用捕捉法进行，即酶标板孔用适量炭疽毒素抗原包被，加入100μL待检血清后，经洗涤加入工作浓度的辣根过氧化物酶标记的SPA或抗人IgG，再经洗涤后用酶标仪判读，被检孔A值高于阴性对比孔≥2.1倍时，可判定为阳性。

⑶双份血清标本：

患者首份血清应在首次检视患者时采取，通常应一次采取血液标本供涂片镜检，细菌分离培养，血清学抗体检查及常规的血液检查使用，血清分离后置4℃储存，待获得复原期血清后，一同进行抗体检查。

复原期血清应在患者发病后15日左右采取。

⑷试剂盒：

应有国家有关机构颁发的应用许可证。

诊断

一、流行病学资