生物技术制药重点及名词解释.docx
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生物技术制药重点及名词解释
生物技术制药
第一章绪论
★生物技术与生物技术药物的概念
生物技术药物的分类
✦按用途分类:
治疗药物、预防药物、作为诊断药物(免疫诊断试剂、酶诊断试剂、器官功能诊断药物、放射性核素诊断药物、诊断用单克隆抗体(McAb)、诊断用DNA芯片)
✦按作用类型分类:
细胞因子类药物、激素类药物、酶与辅酶类药物、疫苗、单克隆抗体药物、反义核酸药物、RNA干扰(RNAi)药物、基因治疗药物
✦按生化特性分类:
多肽类药物、蛋白质类药物、核酸类药物、聚乙二醇(PEG)化多肽或蛋白质药物
★生物技术药物的特性
✦理化性质特性:
相对分子量大、结构复杂、稳定性差
✦药理学作用特性:
活性与作用机制明确、作用针对性强、毒性低、体内半衰期短、有种属特异性、可产生免疫原性
✦生产制备特性:
药物分子在原料中的含量低、原料液中长存在降解目标产物的杂质、制备工艺条件温和、分离纯化困难、产品易受有害物质污染
✦质量控制特性:
质量标准内容的特殊性、制造项下的特殊规定、检定项下的特殊规定(原液、半成品及成品检定等等)
第二章基因工程制药
蛋白类药物的特点:
结构确证不完全性、具有种属特异性、多功能性、免疫原性
临床前安全性评价的特殊性:
蛋白类药物安全性担忧的性质和来源;受试物的纯度;相关动物的选择;给药剂量的选择;免疫原性;遗传毒性和致癌性(一般不进行常规的遗传毒性实验);药代动力学
真核细胞表达制品的安全性问题:
生产细胞DNA残留的影响、生产用血清的影响
基因工程药物稳定性研究的相关问题:
药物浓度、温度、湿度和水分、氧、光照、pH
基因工程药物的缺陷:
生物利用度低,半衰期短;异体蛋白具有免疫原性
基因工程菌的修饰改造方法:
构建突变体、构建融合蛋白、PEG修饰(降低免疫原性、增加水溶性、延长t1/2)
基因工程制药基本环节
♦上游阶段:
制备目的基因→构建重组质粒→构建工程细胞
♦下游阶段:
培养工程细胞→分离纯化产物→除菌→半成品、成品检定→包装
基本工具:
目的基因、各种酶(切割酶、连接酶、修饰酶等)、载体、宿主细胞
Ø酶切结果:
5’粘性末端、3’粘性末端、平头末端
Ø1U核酸内切酶的酶活性:
指在最佳反应条件下反应1小时,完全水解1mg标准DNA所需的酶量
Ø影响限制性内切酶反应的因素:
♦DNA样品的纯度:
♦DNA的甲基化程度:
核酸限制性内切酶不能够切割甲基化的核苷酸序列。
在基因克隆中要使用甲基化酶缺陷型细菌菌株制备质粒DNA。
♦酶切反应的温度
♦DNA的分子结构
♦反应缓冲液组成
♦反应时间、反应体积等
Ø工具酶
✦核酸限制性内切酶:
识别、水解外源的双链DNA分子上特定的核苷酸序列。
主要存在于原核微生物中。
•同裂酶:
指来源不同,识别序列相同的酶;进行同样的切割,产生相同的末端
•同尾酶:
来源不同,识别序列不同,但产生相同的粘性末端
DNA甲基化酶:
具有宿主专一性,对宿主自身DNA上特定核苷酸进行甲基化修饰,避免被自身限制性内切酶水解
✦DNA连接酶
•T4噬菌体连接酶:
连接双链DNA切口,或带粘性末端或平头末端的DNA片段
•大肠杆菌DNA连接酶:
连接双链DNA切口,或带粘性末端的DNA片,不能连接带平头末端的DNA片段
✦聚合酶:
以DNA或RNA为模板,将核苷酸连续加至3’-OH末端,合成方向为5’→3’。
DNA聚合酶、RNA聚合酶
•大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ:
5’→3’DNA聚合酶活性;5’→3’DNA外切酶活性;3’→5’DNA外切酶活性;RNAH酶活性
•Klenow酶:
不具备5’→3’DNA外切酶活性
•T4噬菌体DNA聚合酶:
不具备5’→3’DNA外切酶活性。
外切酶活性比Klenow酶强200倍,对单链DNA作用强于双链DNA
•T7噬菌体DNA聚合酶:
不具备5’→3’DNA外切酶活性
•TaqDNA聚合酶
•反转录酶:
催化以RNA或DNA为模板,合成DNA;具有RNAH酶的活性
•末端脱氧核苷酸转移酶:
催化dNTP沿5’→3’聚合,逐个加于线性DNA分子的3’末端;不需要模板
Ø载体:
(vector)来源于质粒、噬菌体或病毒的DNA分子,可供插入或克隆目的基因或DNA,并具有运载外源DNA导入宿主细胞的能力。
✦质粒载体:
共价闭合环状DNA(cccDNA);开环DNA(ocDNA);线状DNA(lDNA)
•质粒的三个重要性质:
遗传传递的能力;遗传交换的能力;不相容性
•用于克隆的质粒的三个要素:
复制子、选择标记、多克隆位点
•常用质粒载体:
克隆载体、表达载体、突变载体、报告载体
✦λ噬菌体载体:
插入型载体、置换载体
•来源于噬菌体DNA,因可以插入较大DNA片段,常用于构建基因组文库和cDNA文库。
Ø目的基因的常用制备方法
✦化学合成法:
前提:
基因的DNA的序列已知。
小于100bp的片段:
直接合成,最常用固相亚磷酸三酯法。
大片段目的基因:
小片段粘接法、大片段酶促法
✦PCR法:
前提:
已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列,根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。
✦基因文库法:
鸟枪法:
适用于原核细菌目的基因的克隆分离
✦cDNA文库法(与mRNA互补的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA结构;仅限于克隆蛋白质编码基因;mRNA含量少且t1/2短,对酶和碱极为敏感,分离纯化困难
第一链:
mRNA模板,引物(polyT),逆转录酶,dNTPs
第二链:
自身引导法:
取得的双链cDNA5’端会有几对碱基缺失(NaOH,煮沸;Klenow酶,dNTPs;S1内切酶)
引导合成法:
获得的cDNA能保持完整的5’端序列(TdT,Dctp;NaOH;退火;Klenow酶,dNTPs)
♦基因文库的完备性:
指在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示:
N=ln(1–P)/ln(1–f),P=完备性,f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小
♦双酶切产生的粘性末端,最常用,可以确保连接方向的正确性
♦影响连接效率的因素:
连接方式;目的基因与载体的浓度比例摩尔数比大于1;连接温度、时间、酶的活性、反应缓冲体系
Ø重组DNA导入宿主细胞
✦导入大肠杆菌:
CaCl2法;转染法
✦导入酵母:
电转化法;化学转化法;原生质转化法
✦导入链霉菌:
原生质转化法;电穿孔法
✦重组DNA导入哺乳动物细胞:
显微注射法;DEAE葡聚糖转染法;DNA-磷酸钙转染法;阳性脂质体介导法;电穿孔法;细胞融合法;病毒感染法
Ø重组子的筛选与鉴定
✦遗传标记筛选法:
抗生素抗性筛选法;α互补筛选法(蓝白斑筛选——载体含有LacZα基因,X-gal培养基,成功导入的菌落显示为蓝斑);营养缺陷型筛选法;噬菌斑筛选法
✦核酸分子杂交法:
菌落原位杂交法;DNA印迹法;RNA印迹法
✦限制性内切酶图谱法:
琼脂糖凝胶电泳鉴定各片段分子量,含有目的基因的为阳性克隆
✦DNA序列测定法
✦目的基因表达产物测定法
原核细胞表达的特点及选择
✦大肠杆菌(首选,遗传背景研究清楚;适合大规模生产(成本低,周期短,效率高,操作简单)、芽孢杆菌、链霉菌等
✦缺点:
缺乏翻译后修饰系统;容易以包涵体形式存在;外源蛋白容易被宿主酶系统水解
★外源基因表达的调控原件:
复制子、启动子(表达效率的关键因素)和终止子、核糖体结合位点(即SD序列及SD序列到起始密码子AUG的距离)、识别翻译后修饰信号
✦用于原核表达的载体必须具备的条件:
具有复制子、灵活的克隆位点和方便的选择标记、很强的启动子、阻遏子(一般有)、强的终止子,所产生的mRNA应具有翻译起始信号(起始密码子AUG以及SD序列)
★外源基因在大肠杆菌中的表达方式
✦胞内表达:
非融合蛋白表达:
蛋白质接近天然状态,易被降解,易形成包涵体。
有原核多肽基因
融合蛋白表达:
表达效率高;产物稳定;可以切除原核多肽,获得天然外源蛋白
✦分泌表达:
有信号肽基因,形成周质表达或细胞外表达
★外源蛋白表达效率的影响因素
✦外源基因密码子:
大肠杆菌具有偏好密码子和稀有密码子,外源基因应尽量设计成为大肠杆菌的偏好密码子
✦mRNA的结构:
改变一级结构;降低5’端二级结构稳定性;调控3’端非翻译区二级结构
✦表达载体的选择:
表达方式;强的复制子(拷贝数高);强的启动子(转录效率高);高效率的核糖体结合位点;强的终止子(提高mRNA稳定性);适应范围广;稳定性高;产物易纯化。
✦外源蛋白的稳定性:
采用融合蛋白形式表达;采用蛋白酶缺陷的突变菌株
真核细胞表达的特点及选择
Ø常用的真核表达系统:
酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统
大肠杆菌和酵母表达系统的比较
大肠杆菌
巴斯德毕赤酵母
载体
原核载体
穿梭载体
调控序列
原核
原核和真核
表达形式
包涵体、融合蛋白、分泌
分泌
翻译后修饰
基本无
有
生产方式
发酵,操作简单、经济
发酵,操作较简单、较经济
★酵母表达体系的影响因素
✦外源基因的结构
©外源基因5’端非翻译区的序列和长度影响mRNA的翻译效率
©起始密码子两侧若容易形成RNA二级结构,将阻止翻译进行
©富含A-T序列导致转录提前终止
©密码子的偏好性
©高度复杂的胱氨酸结构基序影响表达效率
✦表达形式及信号肽的选择:
无信号肽常胞内表达;有信号肽,胞外分泌型表达
✦启动子:
多数毕赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2启动子
✦转化子的拷贝数:
拷贝数越高,表达水平也越高
✦诱导条件:
甲醇诱导的浓度、时间以及温度的选择
✦外源蛋白的降解:
采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或调节pH值抑制蛋白酶活性,提高外源蛋白的稳定性。
Ø哺乳动物细胞表达系统
✦表达载体:
病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、反转录病毒等);质粒载体
✦表达方式:
瞬时表达、稳定表达、诱导表达
Ø基因重组蛋白的主要分离技术:
离心、沉淀(等电点沉淀法、盐析法)、膜分离、双水相萃取
Ø基因重组蛋白的主要纯化技术:
离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、反相色谱和疏水色谱
Ø选择分离纯化方法的依据
✦根据表达形式选择
♦分泌型:
沉淀和超滤
♦周质表达:
溶菌酶处理+渗透压休克
♦胞内可溶表达:
亲和层析或离子交换层析
♦胞内不溶表达(包涵体):
易与杂蛋白分开,但需要复性形成有活性的蛋白质。
✦根据分离单元之间的衔接选择
♦先采用低分辨、分离规模大的方法,后采用高分辨的方法,最后采用分离规模小、速度慢的方法。
合理选择色谱分离次序
✦根据分离纯化工艺的要求选择
♦具有良好的稳定性、重复性和较高的安全性;尽量较少组成工艺步骤;所用时间尽可能短;工艺和技术必须高效
★基因工程药物的质量控制与小分子药物质量控制相比,不同的方面
✦Mr远大于小分子化学物质,致使适用于小分子药物的鉴别方法无法用于基因工程药物。
如质谱
✦基因工程药物结构复杂,常需多种检测方法
✦两者杂质性质差别较大。
小分子药物杂质主要来源于合成中原料残留、合成副产物和纯化中溶剂残留;基因工程药物多为宿主蛋白残留和宿主基因残留,其检测一般都用专用的试剂盒。
✦药物定量方面,基因工程药物一般采用生化反应的方式
★基因工程药物的质量控制
1、蛋白质含量的测定
✦紫外吸收光谱:
在280nm有最大吸收值。
快速,无破坏性。
不是严格定量,核酸可引起强干扰作用。
✦BCA法:
碱性条件与Cu2+络合同时将Cu2+还原成Cu+(双缩脲反应),再与二辛可宁酸形成紫色复合物,在562nm有最大吸收值。
需短时间10min内完成
✦Lowry法:
碱性条件蛋白质与铜形成复合物可还原磷钼酸-磷钨酸试剂,产生深蓝色。
特点:
灵敏,准确度高;操作步骤多,繁琐;影响因素多(盐酸胍、尿素、EDTA等)
✦考马斯亮蓝法:
灵敏,操作简单,重复性好;抗干扰能力弱
✦SDS-凝胶染色与扫描分析法
2、蛋白质纯度的测定:
电泳(SDS-PAGE)、质谱法、色谱法、末端氨基酸分析法
3、蛋白质分子量的测定:
SDS-PAGE、凝胶色谱、质谱法
4、蛋白质等电点的测定
5、蛋白质序列分析
✦N末端氨基酸序列分析:
鉴定蛋白质的种类;C末端分析:
判断表达、纯化过程中有无加工
6、蛋白质二硫键分析
7、蛋白质活性的测定
8、免疫测定法
9、内毒素分析、宿主蛋白和核酸残留分析
基因工程药物的实例:
干扰素(IFN)、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(CMCSF)、人白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、人生长激素(hGH)
第三章动物细胞工程制药
动物细胞的体外培养
★体外培养动物细胞的形态:
贴壁依赖性细胞,非贴壁依赖性细胞,兼性贴壁细胞
♦贴壁依赖性细胞:
成纤维样细胞型(主要来源于中胚层组织);上皮样细胞型(主要来源于外胚层和内胚层组织)
♦非贴壁依赖性细胞:
又叫悬浮细胞,一般呈圆球形。
主要来源于血液、淋巴组织、杂交瘤细胞
♦兼性贴壁细胞:
如CHO细胞、小鼠L929细胞
动物细胞的生理特点
1)细胞的分裂周期长,一般为12~48h(G1→S→G2→M)
2)细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象
3)正常二倍体细胞的生长寿命是有限的
4)动物细胞对周围环境十分敏感(如渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等的变化耐受力很弱)
5)动物细胞对培养基的要求高(需要12种必需氨基酸、8种以上的维生素、多种无机盐和微量元素、作为主要碳源的葡萄糖,以及多种细胞生长因子和贴附因子,而且不同种类要求又有变化。
)
6)动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同
培养条件要求高、成本贵,产量低;多半是分泌在胞外的,收集纯化方便,得到了较完善的翻译后修饰
★动物细胞培养的条件
(一)环境条件:
直接接触的器材、防止污染(显著地污染标志:
pH值迅速改变,细胞外形模糊,甚至出现细胞集落)、水质、pH(大多是7.2-7.4)、渗透压、温度、通氧量、基本营养物质
(二)营养要求:
水、碳源、氮源、维生素、激素、无机盐等
♦碳源不能为无机物,大多只能利用葡萄糖
♦氮源不能为无机物,主要利用各种氨基酸
♦在多数情况下,需要添加5%-20%的小牛血清,或适量动物胚胎浸出液。
培养基:
天然培养基,合成培养基,无血清培养基
♦天然培养基:
主要见于早期阶段,来源:
血浆凝块、淋巴液、血清(最常用有效)、羊水、腹水等。
分维持液(低或不含牛血清)和生长液(5%-20%牛血清)
♦合成培养基:
主要成分:
糖、氨基酸、核苷酸前体、维生素、激素、缓冲体系、无机盐等
♦无血清培养基
①提高了细胞培养的可重复性,避免了由于血清批之间差异的影响;
②减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险;
③供应充足、稳定;
④细胞产品容易纯化;
⑤避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性;
⑥减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰,便于实验结果的分析
血清的作用:
提供各种生长因子和激素,贴附因子和伸展因子,可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白,必须的脂肪酸和微量元素
★其他常用溶液:
平衡盐溶液;培养基pH调整液;细胞消化液(胰蛋白酶,EDTA);抗生素溶液
动物细胞培养的基本技术和方法★
★动物细胞培养的方法:
原代培养、传代培养、克隆培养
♦细胞的原代培养:
组织块培养法、单层细胞培养法。
取动物组织块→剪碎→分散处理(加胰蛋白酶或胶原蛋白和EDTA)→洗涤纯化→计数稀释→培养
♦细胞的传代培养:
离心或酶消化法收获细胞,计数后,以适当浓度接种到新的培养环境中
♦单克隆培养
动物细胞培养的基本技术:
细胞分离(离心法;蛋白酶消化法);细胞计数;细胞传代;细胞的冻存(慢冻,液氮,-196度)和复苏(快融,投入37℃水浴融化)
♦冻存主要步骤:
活性好的细胞,加保护剂(DMSO等)混合;做好标记(细胞种类、日期等);逐渐降低温度,最后放至液氮中;降温梯度要合适,总的原则是慢冻
生产用动物细胞
©原代细胞:
费钱费力,少用
©传代细胞系:
安全,特点:
2n核型,贴壁依赖,接触抑制,有限传代(50代)
©转化细胞系:
自发转化或人为转化,失去了正常细胞的特点,可=无限增殖传代,适宜大规模工业培养
©工程细胞系:
融合细胞系(仙台病毒融合法、聚乙二醇融合法、电融合法);基因工程细胞系
♦病毒载体:
牛痘病毒。
腺病毒和逆转录病毒载体,杆状病毒载体-昆虫细胞系统
♦基因工程细胞主要的筛选系统,
①HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶)选择系统,筛选tk+、hgprt+的转化细胞
②GPT(HAT、黄嘌呤、甘氨酸、霉酚酸)选择系统,筛选gpt+的转化细胞
③G418(Geneticin)选择系统,筛选Neor的转化细胞
④MTX选择系统,筛选dhfr+的转化细胞
细胞库的建立:
原始细胞库(MCR)→生产用细胞库(MWCR,又称工作细胞库,主细胞库→生产细胞库)
常用生产用动物细胞:
BHK-21,C127细胞,CHO-K1,COS细胞,MDCK细胞,WI-38,MRC-5,Namalwa,Sf-9,Vero,SP2/0-Ag14
动物细胞大规模培养
★动物细胞的大规模培养方法
•悬浮培养:
适用于非贴壁依赖细胞或兼性贴壁细胞
优点:
操作简便,培养条件均一,传质传氧较好,容易扩大培养,可以借鉴细菌培养的经验。
缺点:
细胞培养密度较低。
•微载体培养:
用于培养贴壁细胞。
充分发挥悬浮培养的一切优点。
理想的微载体应具备:
生物相容性、无毒性、表面惰性、比重适当(1.030~1.045g/ml)、粒径均一,在60~250m之间(溶胀后)、光学透明、柔软、耐高压灭菌温度、反复多次使用、制备简单、原料充分
•多孔载体培养:
可用于悬浮细胞及贴壁细胞。
细胞在网格内,能避免受到剪切力的损伤,因此培养体系可以提高搅拌速度和通气量。
多孔载体的一般条件:
具备生物相容性、机械稳定性和热稳定性
•微囊化培养:
避免剪切力对细胞造成的损伤;获得较高细胞密度107-108个/ml;利于纯化;可采用多种生物反应器进行培养
•中空纤维培养:
把细胞接种在中空纤维的外腔,利用中空纤维模拟毛细血管提供营养。
理想的动物生物反应器必须具备的基本要求:
1体系中的各种材料,对细胞必须无毒性。
2生物反应器结构的传质、传热和混合性能好。
3密封性能良好,可避免一切外来微生物的污染。
4培养环境多种物化参数可自动检测和调节控制,控制的精确度高,且能保持环境质量的均一。
5可长期连续运转,尤其对于动物细胞而言。
6容器加工制造时要求内面光滑,无死角。
7拆装、连接和清洁方便,耐高压蒸汽消毒便于操作消毒。
8设备成本尽可能低。
★动物细胞生物反应器
✦规模:
实验室规模:
<20L;中试规模:
20-100L;生产规模:
>100L
✦类型:
搅拌罐式;气升式;中空纤维式;透析袋或膜式;固定或流化床式;一次性摇袋式细胞培养
✦主要操作方式:
♦分批式操作:
能够控制的参数只有PH、温度和通气量
♦补料-分批(或流加式)操作:
不断地向系统中补充新的营养成分
♦半连续式操作
♦连续式操作和灌流式操作:
后者取出部分条件培养基时,绝大部分细胞仍保留在反应器内,而连续式培养则同时也取出了部分细胞。
转基因动物
基本原理及步骤:
外源目的基因的制备→外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞→选择获得携有目的基因的细胞→选择合适的体外培养系统和宿主动物→转基因细胞胚胎发育及鉴定→筛选所得的转基因动物品系
转基因动物制作方法
✦经典的技术路线 :
基因显微注射法,最常用、成功的方法,成功率低
✦整合胚胎移植的技术路线:
受精卵的成活率高达90%以上,外源基因整合率高,提高受孕率
✦核移植(克隆)的技术路线:
体细胞核移植;核移植前导入目的基因。
✦整合卵受精的技术路线:
卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。
✦具体方法:
基因显微注射法、反转录病毒感染法、胚胎干细胞方法,精子载体导入法、基因打靶法、人工酵母染色体法★
转基因动物研究出现的问题:
制作转基因动物效率低;外源基因在宿主基因组中的行为难以控制;转基因表达水平低
转基因动物反应器:
(bioreactor)目的片段在器官或组织中表达的转基因动物。
如乳腺、膀胱、血液等
动物细胞产品制造实例:
类淋巴细胞干扰素、组织型纤溶酶原激活剂、单链尿性纤溶酶原激活剂-尿激酶原、促红细胞生成素(EPO)、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗
第四章抗体工程制药
概述
抗体工程应用于医学领域:
研究,以免疫转印法检测特定抗原;医疗,以毒素连结抗体攻击病变細胞;检验,以ELISA侦测特定病原体;
多克隆抗体(polyclonalantibody,pAb)简称多抗。
如:
免疫血清(含多种特异性抗体)
实际意义:
预防、治疗感染性疾病,如:
破伤风抗毒素血清(抗破伤风);胎盘球蛋白(抗病毒感染)。
副作用:
超敏反应。
临床诊断,如:
肥达氏反应(伤寒、副伤寒)。
缺点:
特异性差
单克隆抗体(monoclonalantibody,mAb)简称单抗★
优势:
特异性高:
只识别某一个特定的抗原决定簇。
均一性好:
其H链、L链及V区独特性其完全一致,所得到的抗体结构和生物学性状完全一致。
杂交瘤细胞:
既能产生单一抗体,又能无限增殖
抗体分子的结构和功能★
Ø基本结构:
四肽链结构
Ø重链(H链)和轻链(L链)天然Ig分子中,重链同类,轻链同型。
重链可分为五类:
μ、γ、α、δ、ε链——IgM、IgG、IgA、IgD、IgE;轻链可分为κ、λ型。
Ø可变区(V区)、恒定区(C区)和铰链区(木瓜蛋白酶、胃蛋白酶)
♦VL、VH区各有3个超变区(也称互补决定区,CDR1-3),共同组成Ig的抗原识别部位,形成与抗原决定簇互补的表位。
可变区中的其它部分变化较小,称为骨架区(FR)
♦C区决定Ig分子的异种抗原性,主要发挥抗体分子的效应功能。
Ø抗体分子的价位:
指抗体分子能结合的抗原表位数的多少。
VH和VL的CDR区共同构成抗原的结合位点,因此一个单体免疫球蛋白分子有两个抗原结合点,故习惯将单体抗体分子称为2价分子。
单克隆抗体的制备
产生杂交瘤细胞的三个关键点:
B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的特性、细胞融合技术、杂交瘤细胞的筛选
单克隆抗体制备的基本过程(理解):
抗体与动物免疫,提取能够产生抗体的B淋巴细胞,B淋巴细胞与小鼠的骨髓瘤细胞在灭活的仙台病毒/聚乙二醇的诱导下融合,并在特定的选择培养基下筛选出杂交瘤细胞。
在体外条件下做大规模培养/注射到小鼠腹腔内增殖。
再提取出大量的单克隆抗体,最后进行纯化。
Ø抗原和免疫:
抗原的制备(通常和佐剂混合,增强免疫应答)、免疫动物(体内/体外免疫方法;动物的选择:
一般采用与骨髓瘤供体细胞同一品系的动物)
Ø细胞的融合和杂交瘤细胞的筛选
©细胞的融合:
制备脾细胞悬液:
最后一次免疫后三天,1×108个;制备骨髓瘤细胞悬液:
对数生长期细胞,(2~3)×107个;融合:
40-50%PEG(MW4000),37℃,5min
©★HAT培养基筛选杂交瘤细胞
HAT培养基筛选原理:
H(次黄嘌呤);A(氨基蝶呤);T(胸腺嘧啶)。
骨髓瘤细胞不具备HGPRT和TK,B淋巴细胞寿命短。
影响细胞DNA的合成:
H促进了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)途径;T促进了胸腺嘧啶激酶(TK)途径;内源性途径(谷氨酰胺、鸟核苷酸单磷酸,二氢叶酸还原酶途径)被A
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