细胞因子检测.docx

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细胞因子检测

细胞因子检测

细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质分泌的蛋白质,在体内广泛参与免疫调节及炎症反应、组织修复、刺激造血系统、刺激细胞的增殖与凋亡等重要生理活动，在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中均起重要作用。

某些刺激因子也可导致一些细胞因子超量表达,或表达减少,从而参与疾病的发病及病理过程。

1、免疫学检测法　其基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。

如免疫斑点法、ELＩSA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。

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2．、生物学测定法其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的ＤＮA的合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的活性单位,如对IL—1、IL—2等细胞因子活性的检测。

亦可根据某些细胞因子对特定靶细胞的杀伤效应或对病毒的抑制作用进行测定,如对肿瘤坏死因子及干扰素的生物活性测定。

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3、分子生物学测定法目前采用的技术有各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和ＰCＲ等.通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量,推算出细胞因子的合成量。

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一、ＩL-1的检测（生物活性测定）

产生IL-1的细胞种类很多,其中最主要的为单核—巨噬细胞。

IL－1可分为IL-1α（也称酸性ＩL—1,pI=5．0）和IＬ—1β（中性ＩL-1，pＩ=7.0）.两者的分子量和生物活性相似，只能用抗体检测方法才能区别，常用的生物学测定法对两者都适用。

ＩL—１的生物学活性广泛,其检测方法亦较多,包括有小鼠胸腺细胞增殖法、D10G　４。

１细胞增殖法及Ｌ９２9细胞增殖法等。

ＩＬ－1反应细胞增殖可以通过活性染料染色，显微镜直接计数，３H-TｄR或1２5I－ＵdR的DNA掺入量或以活性细胞代谢率为指标来表示。

本试验介绍Ｌ929细胞增殖MＴT比色法。

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（一）IL—１的诱生

体外试验可用ＬＰＳ等有丝分裂原诱导单核-巨噬细胞产生IL－1，或用P388D１（鼠）,ＴHＰ—1（人）细胞株制备IL－１。

本试验以小鼠巨噬细胞制备ＩL—１....文档交流仅供参考...

1、取6~1０周龄ＢAＬB/c或C57BL/6小鼠,雌雄均可,拉颈处死后用酒精消毒。

２、用带9号针头的5ｍl注射器腹腔注入5ml冷的含5％小牛血清的Ｈanks液（5％NBS—HBSS）,轻揉腹部吸出腹腔液体（内含腹腔细胞）,反复抽吸几次。

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3、1５０0r/min离心8min，洗细胞２次。

４、将腹腔细胞用含１0％小牛血清的RＰＭI－１６４0液（1０%NBS-ＲＰMＩ－１640）配成２×１06/mｌ,加到２4孔平底培养板，1ｍl/孔,置５％CＯ２，37℃温箱孵育2ｈ。

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5、每孔用５％NBS—HBSS洗3次,弃去未粘附细胞,贴壁细胞为巨噬细胞单层。

6、将LPS（10μｇ／ml）加入巨噬细胞单层,每孔1ml，培养4h；加入1０％NBＳ-164０１ｍl继续培养至48h，收集上清液,置－20℃冰箱保存,待测ＩL-１活性及含量。

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（二）L929细胞增殖ＭＴT比色法

MTT比色分析法的原理是利用四甲基偶氮唑盐［3-（4。

５—dimetｈｙlｔhiazｏｌ-2－ｙ1）—2,5—dipｈｅｎyl　ｔetrazoliuｍbrｏmiｄe,MTＴ）在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成兰黑色的MTT－甲，形成MＴT—甲　的量与细胞增殖程度呈正相关。

故通过测定细胞形成MTT—甲量，可间接定量分析细胞的增殖情况，具体步骤如下:

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1、将生长成单层的L929细胞用0。

２5%胰酶消化2～3mｉn。

除去消化液后,用1０％FCＳ的RPMＩ—1640将L9２9细胞配成1×１05/ml,加入96孔细胞培养板中，每孔１00μl。

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2、取100μl不同稀释度的ＩL—１标准品和待测品,分别加入各孔中,每孔设３个复孔，置37℃，5％ＣO2温箱孵育5６h。

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3、用ＰBS溶解ＭTＴ为5ｍｇ／ml,用0.22μm膜滤器除菌及杂质.

4、上述培养体系取出后，每孔加入１0μｌMTT（5ｍg／mｌ）,37℃继续培养4ｈ。

５、从每孔吸出100μl上清弃去,加酸化异丙醇或加DMSO1０0μｌ／孔,充分混匀以溶解底物。

酸性条件使培养液中酚红指示剂变为黄色,以利于对MTＴ-甲转化物的测定。

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６、将微量测定板置室温数分钟，保证转变的底物结晶被溶解.

7、用酶标光度计以检测波长为57０nm，参考波长为6３０nｍ分别测量OD值.测定应在酸化异丙醇加入后1h内完成.OＤ570nm-OD６30nｍ，再减去培养液对照的OＤ值。

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８、用IL-1标准品各稀释度IＬ－1含量（X）和各稀释度对应的OD值（Y）作直线回归，按上述概率单位分析法计算待测样品ＩL—2的活性单位（ｕ/ml）。

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（三）注意事项

１、ＩL-1诱生剂的浓度，培养条件和细胞浓度对结果均有明显影响，应进行预试验以确定最佳实验条件。

２、培养器皿和研磨条件:

2４孔培养板培养细胞活率较高，但生长稍慢。

玻璃瓶培养有时会因玻璃质量和清洗不净引起细胞死亡，故应注意采取相应措施。

大量培养时用大容量瓶比较方便，可减少操作中的污染.研磨组织可用玻璃匀浆器、不锈钢网....文档交流仅供参考...

二、TNＦ的检测（免疫学测定法，双抗体ELＩSA夹心法）

（一）原理　选用两种针对ｒHuTＮF－α分子不同表位的单克隆抗体，一种单克隆抗体作为包被抗体,另一种单克隆抗体作为酶标抗体,如果待测样品中含有TNF—α,则形成抗体－TNF-α-酶标抗体复合物,通过酶催化底物显色，亦可根据标准品OD值绘制标准曲线，从标准曲线上查出待检标本中ＴNF—α的含量。

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（二）材料和试剂

1、包被抗体：

使用时用包被缓冲液作适当稀释。

2、酶标抗体：

使用时用稀释液作适当稀释。

３、标准品:

　rHuＴNF—α（10ng／ｍl），使用时用稀释液作倍比稀释.

4、阴性对照液（未免疫鼠Iｇ）.

５、ABTS底物:

2,２＇－Azino—bｉs—（3—eｈtyｌbenztｈｉozoliｎｅ　6-ｓｕlfoniｃaciｄ），2,2＇－连氮基－双（３－乙基苯并噻吡咯呆-6磺酸）....文档交流仅供参考...

6、96孔ＥLIＳA板.

７、0.15mｏl／L，pH７.４PBS:

配其它液体用。

8、包被缓冲液:

0.０5moｌ/L，pH9。

6　Na2CＯ３—NaＨCO3缓冲液。

9、洗涤液：

　０.05％Ｔwｅen２０—PBＳ。

１0、稀释液：

4％ＰＥG—洗涤液（用于稀释标准品和酶标抗体）。

1１、底物缓冲液：

0。

１mol/L，pH5．0柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液.

12、３％Ｈ２O２。

13、血清、枸缘酸盐或ＥＤTA抗酸血浆、其它体液及细胞培养上清均可检测,后者应作适当稀释.

14、ＥＬISA读数仪等。

（三）操作步骤

1、包被　将稀释好的包被抗体加入ELＩSA板，100μl／孔，４％放置２4h或48h.

2、加待检标本洗涤液冲洗ELIＳＡ板3次，加待测样品、阴性对照及倍比稀释的标准品,1０0μｌ/孔,37%，１ｈ.标准品稀释方法:

取标准品１50μl（１0ng／ml）倍比稀释7个浓度：

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5ng/ml、２。

5ng/ml、1.25ｎg／ｍl、6２5pg/ml、312ｐｇ/mｌ、１５6ｐg/mｌ和７8pg/ml....文档交流仅供参考...

3、加酶标抗体：

洗板３次，加入稀释好的酶标抗体，100μl／孔,37℃,1h。

4、显色:

洗板3次,加入配好的ABTS显色液,１00μl/孔，室温或37℃显色1５～3０mｉn。

５、ELISＡ读数仪测４10nm处ＯD值,绘制标准曲线。

６、从标准曲线查得待测样品中的TNF-α含量。

四、注意事项

１、血清或血浆中残存凝块或红细胞须经离心去除,勿用溶血或脂肪过多的血清.

２、标本在2~8℃可储存３天,超过３天应放入-2０℃或－７０℃，避免反复冻融．

3、分别用加样器头吸取各份标本,避免相互交叉。

4、叠氮钠（ＮaＮ3）对辣根过氧化物酶（HＲＰ）有灭活作用,在本实验系统中应避免使用.

５、底物显色液必须临用时配制，双氧水应放置在2~8℃,保存６个月以内。

附:

试剂配制

１。

0。

15mol／Ｌ，ｐH７。

4ＰＢS

KH2PO４　0。

２ｇ

Na2HPO4·12H2O　２。

９g

NaCl８。

０g

KＣl0．2g

双蒸水加至１00mｌ

２。

　包被缓冲液

Na2CＯ31。

59g

ＮaHCＯ32。

９3g

双蒸水加至10０0ｍl

３。

洗涤液

PBS１0０0ml

Ｔween2０0。

5ml

4。

稀释液

洗涤液　１00mｌ

鸡蛋清　0.６ml

PEG（聚乙二醇，MW60０0）2。

0g

NaCl2.9g

5。

底物缓冲液

Na2ＨPO4·１2H2O　1。

79ｇ

拧檬酸1。

29g

双蒸水加至10０ml

６.AＢＳ显色液

ABTS5mg

底物缓冲液　１０mｌ

3％H2O2２0μｌ

三、IＬ-２的检测（基因的检测）

细胞因子基因的检测包括对其DNA的检测和ｍＲＮＡ表达的检测,常用的方法有Southern印迹，斑点印迹，PＣＲ,原位杂交及原位PCR等，Nｏrｔherｎ印迹及RT－PＣR。

本文介绍ＩL－2mＲNA的测定（斑点杂交法）。

将ＲNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上,可用手工操作点样,也可用斑点式点样器点样,再与特异性探针进行杂交。

本法可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性及半定量分析。

由于其操作比Ｎorthｅrn印迹简单、迅速，所需样品量少,且可在同一张膜上同时进行多个样品的检测，故很适合于临床应用。

亦可用于ＤNＡ的检测。

但其缺点是不能鉴定所测基因的分子量....文档交流仅供参考...

（一）主要试剂

1.RNA提取试剂:

TRIZOＬ试剂（Gibｃol,No．１5５９６—0２6）,DＥPＣ水（Fｌｕka，Nｏ.９8021０）...文档交流仅供参考...

2.　质粒提取试剂盒：

（Ｐｒomeｇa:

WizarｄMｉnipreｐs　DNA，Nｏ．１17）

３．ＤNA片段提取试剂盒：

（LaJolｌa）

4.地高辛标记和检测试剂盒：

（ＢoｅｒhｉngeｒMaｎnｈeim，Nｏ。

1０9３657）

5．IL—2DNA探针

6.其他试剂

（1）ＳTE溶液0.1ｍoｌ/Ｌ　NａCl

10mｍｏl／ＬTrｉs.Ｃl（ｐＨ8.0）

1mｍol/L　EＤＴA（ｐH8．０）

（2）溶液Ⅰ50ｍｍol/L葡萄糖

25ｍｍol／Ｌ　Tris。

Ｃl（ｐH　8。

0）

1０ｍmol/LEＤTＡ（ｐH8。

0）

可配100mｌ，高压灭菌15mｉn，贮存于4℃

（３）溶液Ⅱ0.２mol/LNaOH（临用前用10ｍｏl/Ｌ贮存液稀释）

1％SＤS（配20％贮存液）

盖紧瓶盖，颠倒离心瓶数次,以充分混匀内容物.于室温放置5~10ｍin

（4）溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾6０ml

冰乙酸11．５ml

水28。

５mｌ

所配成的溶液对钾是3ｍｏl/L,对乙酸根是5mol/L

（5）含相应抗生素的LB培养基

（6）　氯霉素（0。

25g／2ｍl）—－->终浓度170μg/ｍl

（7）　溶菌酶（１0mg/ml，溶于10mmｏｌ／ＬTrｉｓ．ClpＨ８。

0）　1ml

（8）无水乙醇（部分—2０℃预冷）.异丙醇。

７５%乙醇（部分4℃预冷）

（9）TE缓冲液（pＨ８。

0）

（10）5ｍol/LＬｉCｌ1.5ml

（１1）RNA酶，RPMI-1640,胎牛血清（FCＳ）,ＣｏnA（刀豆蛋白A）等

（12）500μl含13%（W/V）聚乙二醇（ＰEＧ800）的1.6mｏl/LNaCl

（1３）3moｌ／ＬＮaAｃ、饱和酚、氯仿:

异戊醇（24：

1）

（二）主要仪器

CO2培养箱:

美国ＦormaSｃientifiｃ产品；

无菌操作台：

苏州净化设备公司产品；

图象处理分析仪：

同济医大太阳公司产品；

低温高速离心机:

上海离心机械研究所.

（三）ＩL—2质粒ＤNA探针的大量制备

1、含ＩL—2质粒DNA探针的提取

取含IL－2质粒ＤNA的单个菌落置两个25ｍlLB培养基（含１00μｇ/ml　Amp）

↓37℃　220r／ｍin振摇过夜（约16h）

取10ml菌液加２0０mlＬB培养液（含1００μg／mlAmp）

↓３７℃15０ｒ/ｍin振摇4ｈ

加氯霉素（终浓度１70μg／ml）

↓３7℃　2２0r/mｉn振摇3ｈ

菌液倒入300ｍｌ离心管中离心

↓４℃　5000r/ｍiｎ×10min离心弃上清除去残液（吸水纸无菌）

每管加40ｍlSTE溶液（冰预冷）悬浮细菌后，用移液管转入到50ｍl离心管中

↓4℃　50０0r×1５ｍiｎ离心

弃上清，加5mｌ溶液Ⅰ（冰预冷）悬浮细菌，加1ml新配制（ｐＨ8．0）的溶菌酶（10mｇ/ml）

↓轻摇，室温静置5min

加１0mｌ溶液Ⅱ,盖上盖子，将离心管小心颠倒数次混匀液体，不要用旋涡振荡器

↓冰浴1０ｍin,且勿摇动

加7.５ｍl溶液Ⅲ（冰预冷）,轻振荡离心管数次使之混合

↓冰浴20~３０ｍin，使沉淀完全,４℃１2000r/min×20ｍin离心

取上清到另一５0ml离心管中,加0．6体积异丙醇,混匀，室温静置15min

↓室温5０0０r／mｉn×1５min离心弃上清

用７5%乙醇洗涤沉淀一次（不将沉淀悬浮）,倒出乙醇，倒置吸水纸上，使乙醇挥发

用１。

5mlTE（ｐH8.0）将沉淀溶解,加等体积冰预冷的5Ｍ　LiCｌ，混匀后置冰浴１0mｉn

↓4℃12000ｒ/ｍin×１0miｎ离心

取上清至新EＰ管,加等体积的异丙醇（约3ml）,充分混匀，室温静置15min

↓室温12000rmiｎ×10mｉn离心（回收沉淀的核酸）

小心去上清，将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀，流尽乙醇,用吸纸吸去附于管壁的液滴，将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发...文档交流仅供参考...

用50０μｌTE（pＨ８．0）溶解DNA沉淀,移至新ＥＰ管中，加入ＲNA酶（终浓度100μg/mｌ）...文档交流仅供参考...

↓37℃水浴30min

加等体积（500μｌ）含13％（W/Ｖ）PEG（８00）的１。

6mol/ＬNaCl，充分混合

↓４℃　１２000ｒ／min×5min离心

吸去上清，用40０μｌTE（ｐH8.0）溶解质粒ＤNＡ沉淀

加等体积饱和酚（400μl）混合

↓12000r／min×10ｍiｎ离心

吸上层水相移至另一EP管,加入等体积酚:

氯仿:

异戊醇（25:

２4:

1）剧烈混匀呈乳白状

↓1２000r/miｎ×１0min离心

吸上层水相移至另一ＥＰ管，加等体积氯仿：

异戊醇（2４：

１）混匀

↓120０0r/ｍin×1０min离心

吸上层水相移至新EP管（硅化）,加入0。

1体积的3mol/ＬＮaAc（pH5。

2）和２体积的－20℃预冷的无水乙醇，混匀（可见沉淀出现），置—20℃2ｈ或0℃2０miｎ...文档交流仅供参考...

↓4℃　12０00r／min×１5mｉn离心

弃上清，加75%乙醇（４℃预冷）200μl，稍加振荡，离心洗涤２次

↓４℃12000r／ｍin×５miｎ离心去上清

敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽

溶沉淀于11μl　TＥ溶液中

↓↓

取1μl电泳其余进行酶切

2。

、经０.７％琼脂凝胶电泳，确定有质粒ＤNA后，用XhoＩ进行酶切。

酶切反应体系:

质粒DNA10μｌ

XhoＩ　６μl

10*Bｕffer（Ｈ）6μl

DW　３８μl

--—-———--—－－－—-——-———-－

总体积　６0μl37℃消化过夜

3．用WizardTMPＣＲ纯化试剂盒回收IL—2DNA片段

1）将60μl酶切反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳

2）紫外灯下切下ＩL—2ＤＮＡ片段，挑出凝胶到EP管中，加1mlReｓin使凝胶溶化

3）用5ml一次性注射器将Resｉｎ/ＤNAｍix转移到ＷizarｄTＭ　Ｍiｎiｃoｌumn中,用2mｌ80％异丙醇洗涤Ｍiｎｉｃoｌｕm,１2000g离心20s，加50μｌDW到Miniｃolｕmｎ中,120００g离心2０s，收集DＮA。

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（四）用DNA　标记和检测试剂盒对IL—2探针进行地高辛标记地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原,又称异羟基洋地黄毒甙配基,地高辛精可以通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核苷酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶核苷酸，ＢoｅhriｎｇｅrＭannｈｅiｍ公司出售的地高辛精标记核苷酸有diｇ－ＵTP，dｉg—dUＴP,和dｉg-ddUTＰ，它们分别适用于ＲNＡ探针，DNA探针和寡核苷酸探针的标记。

地高辛精标记核苷酸主要通过酶反应标记核酸探针，用标记探针做原位杂交，杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。

在适宜的标记反应条件下,一般每20～25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸.这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。

因为一个标记抗体大约复盖２0个核苷酸.BoehrｉnｇｅrMａnnheim公司生产的地高辛精DＮA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛.现介绍地高辛标记cDNA探针随机引物延伸法....文档交流仅供参考...

1.、将DNA（1μg~3μg）加热9５℃（或１00℃）１0miｎ，随即在冰/ＮaCl中骤冷。

DNA充分变性对探针标记十分重要。

５μｌ对照DNA作为对照。

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２、将离心管置于冰上，按顺序加入下列试剂：

①1μg～３μg新鲜变性ＤNA;②2μｌ六聚核苷混合物（试剂5）；③2μｌ　dNTP混合物（试剂6）,加入蒸馏水使总体积达到1９μl,再加入1μｌ　Klenｏw聚合酶。

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３、离心片刻后，将离心管置３7℃恒温箱内孵育6０miｎ。

延长孵育时间可长达2０h，可使标记量增加。

4、加入2μｌ0.2mｏl/L　ＥDＴA（pH8。

０）终止酶反应。

５、加入2.5μl4mol／L　LｉCl和75μl预冷（－20℃）的乙醇,混匀置-70℃３０min或-20℃2h，使标记探针沉淀....文档交流仅供参考...

6、离心（１６5０0r/min）,弃上清液,用５0μｌ70％　冷乙醇轻洗沉淀物。

7、将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后,溶解于5０μlTE缓冲液，-20℃冰箱保存.

（五）培养细胞RNＡ的提取（采用Trizol试剂盒提取RNA）

1、收集培养细胞,用RPMI－16４0培养液离心洗涤３次，第二次离心洗涤时用RPMI—1640培养液调整细胞数至5×１06~1×107细胞。

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2、最后一次洗涤时吸１ml细胞悬液至1.5mlEP管中,在台式离心机离心，弃上清,加入1mlTRIZOL试剂,用移液器轻轻吹打细胞数次,充分混匀,室温（15~30℃）静置5mｉｎ后,加入0．2ml氯仿，快速摇动15ｓ,室温静置２～３min....文档交流仅供参考...

３、于２~８℃离心1460０ｒ/mｉn×１５ｍin,上层无色水相（RNA溶于此层中）约占整个细胞匀浆液的60%。

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4、小心吸取其中400μｌ移至另一Eppｅndorf管中，加入0。

5ml异丙醇，轻柔混匀，室温静置5～10mｉn后。

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5、于2～8℃离心14６0０r/mｉｎ×10miｎ，在管壁下底处可见一乳白色小沉淀块，即为RNA.弃上清。

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6。

　用冰冷的75％乙醇1ｍｌ洗RNA沉淀（不用吹打沉淀）,然后于2~8℃，11５０0r/min离心５min，去除上层乙醇后于无菌环境（或真空）风干RNＡ沉淀,但不要使沉淀过于干燥,以免影响RNA的溶解，用２０μｌ　DEPＣ处理的双蒸水溶解RNA沉淀。

置—８０℃冰箱备用。

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（六）RNA的斑点杂交

１、RNＡ变性:

20μlＲNA溶液（2μｇＲＮA）

４μl20×SSC

１4μl　3７％甲醛　（forｍaldeｈyde）

４0μｌ10０％甲酰胺

————--—－----——－—－---—－—--—－-－－—－———-

60℃温育30min,水浴冷却样品

在上述RNＡ液体中每100μl液中加210μl２0×SSC（共3１0μl），每孔加150μl。

２、纤维素膜处理过程：

硝酸纤维素膜（０。

45μm）水中浸泡5ｍin，再用2０×SSC室温浸泡１h.

3、滤器的处理及点样:

用0。

1NＮaOH浸泡（洗）多孔过滤加样器，再用灭菌水彻底冲液。

将纤维素膜压在多孔加样器的上层板的上面，再压在下层板上，赶去气泡，然后两部分夹紧，点样前，先用２0×SSC（200μl）洗一遍每个孔,真空抽吸干净后,再分别点样。

如有未点样孔须用１50μl的2０×SSＣ封住其孔，然后用真空泵抽吸干净，再用2０×SSC清洗一次，待流体滤过纤维膜后,继续抽吸５ｍｉn以干燥滤膜。

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4、取出膜,8０℃烤２～3h，膜保存于-20℃

配２0×SSC　标准柠檬酸盐ｐH　7.０

NaCl　１7５．3g

Na。

Ｃiｔraｔ　88.２g（柠檬酸钠）

H２O至1000mｌ

用1０NNａOＨor　1０NHCl　调pH至７．0,高压消毒

1NNaOH约０.5ｍｌ

5、杂交

（１）预杂交

1）预杂交液:

5×SSＣ,　０。

75％（W／V）封闭剂,0。

1％（W/V）N-ｌaｕroｙlｓａｒcｏdinｅ,　０.02％（W/Ｖ）SDＳ...文档交流仅供参考...

2）先将预杂交液热至60℃。

3）将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的塑料袋，加入预杂交液，按每１0０cｍ2滤膜加２0mｌ。

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4）尽可能除净袋中的空气，用热封口器封住袋口，将其置６0℃水浴过夜,其间不断翻动塑料袋.

（2）杂交

1）杂交液（DIGEａｓyHｙb（20ml/100ｃm２）预温轻振荡30mｉn

2）将标记探针DNA（5~25ng/ｍl）煮沸变性５min，迅速置冰水中冷却,

３）加入到预温的DIGEasyＨyb（2。

5ｍｌ/１00cm2）中混合,避免形成汽泡

4）然后每张膜上注入预杂交液和滴加探针/ＤIＧEasy　Hyb

5）振荡孵育至少6h，在微量DNA时，建议16h,使其杂交。

6）２×ＳSC,0.１%SＤS清洗2次，每次5ｍiｎ，室温.

7）68℃振荡条件下，0.１×SSC，０.１％SＤS清洗2次，每次15ｍin。

（七）免疫测定

１、杂交后彻底清洗，将膜置入清洗缓冲液中1~５mｉn。

2。

、１00ml封闭缓冲液（1×）中封闭30mｉn。

３、抗地高辛—AP复合物（75mU/ml）用封闭缓冲液（1×）１∶10００0稀释，

４、稀释的抗体溶液20ml与膜孵育30miｎ.

５、1０0ml清洗缓冲液中2次，