研究生开题报告.ppt

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动物体内观察miR-363对口腔鳞癌侵袭与转移的影响及可能的调控机制导师：

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学生：

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1实验背景及意义实验背景及意义实验背景及意义实验背景及意义2实验内容、方法及研究机制实验内容、方法及研究机制实验内容、方法及研究机制实验内容、方法及研究机制3技术路线以及实验难点技术路线以及实验难点技术路线以及实验难点技术路线以及实验难点4实验进度安排实验进度安排实验进度安排实验进度安排实验进度安排实验进度安排5参考文献参考文献参考文献参考文献参考文献参考文献v1.microRNA是一大类非编码小RNA，本身并不编码蛋白质,但是可以通过靶向、特异性作用mRNA或基因启动子，导致靶mRNA降解或者抑制其翻译，降低相关靶基因蛋白质的表达，从而发挥重要的调控作用1。

目前研究已经证实，microRNA的异常表达与疾病尤其是癌症有着密切的关系2。

近年来其作用及调控机制已成为国内外研究的热点，发现microRNA在不同类型肿瘤及肿瘤的不同发展阶段有着不同的表达3，参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移及血管形成等过程4。

一、研究背景及意义一、研究背景及意义

（一）研究背景

（一）研究背景v2.Podoplanin（PDPN）是一种唾液粘蛋白样糖蛋白，对其发挥凝集血小板的功能起关键性作用，研究推测其功能可能有利于肿瘤细胞的血循转移（5）。

深入研究发现它在恶性肿瘤组织中有特征性的表达，并有着重要的临床意义（6）。

El-Naggar等（7）研究发现90%口腔鳞癌中都有PDPN不同程度的异常表达。

研究发现，PDPN在头颈鳞癌发生中也起着重要的作用，Mao等3在对口腔癌前病变-白斑的研究结果中发现，白斑中PDPN表达程度与其组织异常严重程度呈正相关。

v3.目前有研究已经通过双荧光素酶报告分析系统、Transwell及wound-healing等实验，证实了体外头颈鳞癌细胞系中，miR-363可以通过调控PDPN的表达从而对肿瘤细胞侵袭、转移能力产生影响。

并对临床病例中转移（0.990.14）与未转移（1.930.21）头颈鳞癌组织中miR-363的表达水平有显著性差异（P=0.001）（9）肿瘤的侵袭与转移是导致患者死亡的主要原因，针对头颈鳞癌侵袭转移机制的阐明，将有利于帮助我们阐明肿瘤侵袭、转移的机制，对发展肿瘤的新治疗策略提供理论和实验支持；从而发展肿瘤转移诊断治疗的新技术，将对改善晚期转移患者无有效治疗方法的困难局面提供帮助。

（二）研究意义

（二）研究意义BACKBACK二、实验内容、方法及研究机制二、实验内容、方法及研究机制实验内容实验内容33、分析评价、分析评价miR-363-miR-363-PDPNPDPN通路对通路对肿瘤转移的肿瘤转移的调控作用调控作用11、建立肺及、建立肺及淋巴结转移模淋巴结转移模型型22、荧光分子探针示踪，、荧光分子探针示踪，观察肿瘤转移情况观察肿瘤转移情况

（一）、实验内容

（一）、实验内容1、建立肺及淋巴结转移模型、建立肺及淋巴结转移模型v构建miR-363慢病毒载体，感染Rca-T细胞株，将0.2ml含有106感染此病毒的细胞悬液分别注射到25只4周龄的雌性裸鼠尾静脉及左后肢足蹼黏膜下后；并将0.2ml含有106感染非miR-363载体病毒的细胞悬液以同样的方式注射另外25只4周龄裸鼠，来作为对照。

（二）、实验方法

（二）、实验方法v分别在14d、21d、28d、35d和42d使用IVIS-100CCDcamera（Xenogen）观察肺部肿瘤转移灶的数量和大小，并通过Xenogen自带软件分别测量处理组以及对照组裸鼠肿瘤灶及转移淋巴结的体积。

2、荧光分子探针示踪，观察肿瘤转移情况、荧光分子探针示踪，观察肿瘤转移情况v肺转移及淋巴转移的样本将冻存到液氮或者用10%福尔马林固定；这些组织将进一步用免疫组织化学技术检测各种分子，包括miR-363及PDPN的表达变化。

3、分析评价、分析评价miR-363-PDPN通路对肿瘤转移的调控作用通路对肿瘤转移的调控作用研究证实，PDPN3-UTR区存在有一个保守位点及两个非保守位点，而miR-363能够直接结合并作用于此靶向调控位点，反向调节PDPN的表达，并且呈剂量相关性，从而抑制了肿瘤细胞的转移及侵袭能力。

本实验利用荧光分子探针示踪方法，观察比较裸鼠肺内及腘窝淋巴结肿瘤转移情况，用免疫组织化学技术检测各种分子，包括miR-363及PDPN的表达变化，用体内实验的方法来证明miR-363-PDPN通路对肿瘤转移的调控作用。

（三）、研究机制（三）、研究机制BACKBACKmiR-363慢病毒载体感染头颈鳞癌细胞慢病毒载体感染头颈鳞癌细胞后裸鼠体内注射后裸鼠体内注射裸鼠尾静脉注射观察裸鼠尾静脉注射观察肺转移肺转移裸鼠爪垫祝贺观察裸鼠爪垫祝贺观察腘窝淋巴结转移腘窝淋巴结转移证实证实miR-363-PDPN通路在通路在头颈鳞癌转换中的作用头颈鳞癌转换中的作用

（一）技术路线

（一）技术路线三、技术路线及实验难点三、技术路线及实验难点1尾静脉注射形成淋巴尾静脉注射形成淋巴结转移需要荷瘤时间结转移需要荷瘤时间较长，大负荷长时间较长，大负荷长时间荷瘤往往导致动物的荷瘤往往导致动物的死亡，使得淋巴结转死亡，使得淋巴结转移模型成功率较低。

移模型成功率较低。

2爪垫注射，局部组织爪垫注射，局部组织载荷瘤量过大，肿瘤载荷瘤量过大，肿瘤局部浸润生长，可能局部浸润生长，可能导致局部组织的破坏导致局部组织的破坏及破溃，导致裸鼠的及破溃，导致裸鼠的死亡，影响实验进程。

死亡，影响实验进程。

（二）技术难点

（二）技术难点BACKBACK2014.22014.5设计miR-363的包埋病毒，建立肺及淋巴结转移模型；2014.62014.7荧光分子探针示踪，观察并记录原发瘤和肿瘤转移情况；2014.8免疫组织化学技术检测各种分子，包括miR-363及PDPN的表达变化，分析评价miR-363-PDPN通路对肿瘤转移的调控作用；2014.9撰写论文四四.实验进度实验进度BACKBACK五、参考文献五、参考文献v1PetersenCP,BordeleauME,PelletierJetal.ShortRNAsrepresstranslationafterinitiationinmammaliancells.MolCell2006,21,533-542.v2KrichevskyAM,GabrielyG.miR-21:

asmallmulti-facetedRNAJ.JCellMolMed，2009,13

（1）:

39-53.v3YuanP,TemamS,El-NaggarA,etal.OverexpressionofPDPNinoralcanceranditsassociationwithpoorclinicaloutcomeJ.Cancer,2006,107:

563-569.v4KawaguchiH,El-NaggarAK,PapadimitrakopoulouV,etal.PDPN:

ANovelMarkerforOralCancerRiskinPatientswithOralPremalignancyJ.JClinOncol,2008,26（3）:

354-60.v5KatoY,FujitaN,KunitaA,etalMolecularidentificationofAggrus/T1alphaasaplateletaggregation-inducingfactorexpressedincolorectaltumorsJ.JBiolChem,2003,278:

5159951605.v6BhallaR,SiddiquiMT,MandichD,etal.DiagnosticUtilityofD2-40andPodoplanininEffusionCellBlocks.DiagnCytopatholJ.2007,35（6）:

342-7.v7YuanP,TemamS,El-NaggarA,etal.OverexpressionofpodoplanininoralcanceranditsassociationwithpoorclinicaloutcomeJ.Cancer,2006,107:

563-569.v8AtsumiN,IshiiG,KojimaM,etal:

Podoplanin,anovelmarkeroftumor-initiatingcellsinhumansquamouscellcarcinomaA431.BiochemBiophysResCommunJ.2008,373

（1）:

36-41.v9QiangSun，JianjunZhanga,WeiCao,etal:

DysregulatedmiR-363affectsheadandneckcancerinvasionandmetastasisbytargetingpodoplaninJ.TheInternationalJournalofBiochemistry&CellBiology,45（2013）513-520.谢谢各位老师的聆听指导谢谢各位老师的聆听指导!