约克夏猪和金华猪甲状腺组织mRNA lncRNA和miRNA测序及功能分析.docx
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约克夏猪和金华猪甲状腺组织mRNAlncRNA和miRNA测序及功能分析
约克夏猪和金华猪甲状腺组织mRNAlncRNA和miRNA测序及功能分析
浙江大学研究生学位论文独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得逝洹太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。
学位论文作者始i如签字魄加f石年6月7日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解逝江太堂有权保留并向国家有关部门或机构送交本论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。
本人授权逝婆左堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保
存,汇编学位论文。
(保密的学位论文在解密后适用本授权书)
学位论文作者签名:
f兜依锄始之盼也
签字日期:
如后年6月7日签字魄2口/5年6月7曰
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本学位论文受以下项目资助:
M诹.1et.7家族调控猪甲状腺发育的分子机制研究(No.31272424)
Thisworkwassuppertedbythefollowingfund:
NationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31272424)
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摘要.V
ABSTRACTVII
缩略词表X
1文献综述..1
1.1甲状腺1
1.1.1甲状腺激素合成l
1.1.2甲状腺激素的释放和运输2
1.1.3甲状腺激素的调控3
1.1.4甲状腺激素的功能5
1.2microRNA研究进展6
1.2.1microRNA简介.6
1.2.2microRNA的合成.7
1.2.3microRNA的特征一8
1.2.4microRNA的作用机制.8
1.2.5新microRNA的检测技术8
1.2.6microRNA的表达检测技术.9
1.2.7microRNA与甲状腺10
1.3IncRNA研究进展..12
1.3.1IncRNA简介12
1.3.2IncRNA的分类12
1.3.3lncRNA的来源13
1.3.4lncRNA的特征。
14
1.3.5IncRNA的作用机制14
1.3.6IncRNA与甲状腺疾病17
1.4高通量测序17
1.4.1高通量测序的优点..17
1.4.2高通量测序平台..18
1.5本研究的目的与意义.19
2约克夏猪和金华猪甲状腺激素水平检测20
2.1实验材料.20
2.1.1实验动物一20
2.1.2实验主要仪器..20
2.1.3实验主要试剂..20
2.2实验方法.20
2.2.1血清甲状腺激素水平测定一20
2,2.2制备甲状腺组织石蜡切片一20
2.23石蜡切片HE染色..2l
2.2.4甲状腺球蛋白免疫组化..2l
2'3结果与分析.22
2-3.1不同品种猪体型指数及血清甲状腺激素水平..22
2.3.2猪甲状腺组织形态学观察一22
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2.4讨j仑23
2.4.1甲状腺结构一23
2.4.2瘦肉型猪与脂肪型猪甲状腺激素水平..24
基于RNA.seq鉴定分析mRNA和IncRNA25
3.1实验材料.25
3.1。
1实验动物25
3.1.2实验主要仪器一25
3.1.3实验主要试剂..25
3。
2实验方法.25
3.2.1甲状腺组织采取一25
3.2.2总RNA提取26
3.2.3总RNA质量检测26
3.2.4RNA.seq文库构建.27
3.2.5文库测序..30
3。
2.6荧光定量PCR验证30
3-3测序数据处理及生物信息学分析.31
3.3.1测序数据质量检测..32
3.3.2测序数据过滤..32
3.3.3基因组比对..33
3.3.4转录本组装..33
3.3.5已知mRNA的鉴定与分析33
3.3.6IncRNA的鉴定33
3.3.7新mRNA的鉴定34
3.3.8可变剪切分析一34
3.3.9mRNA和IncRNA表达水平分析..34
3.3.10GO和KEGG分析..35
3.3.11lncRNA的功能预测35
3.3.12IncRNA的基因组特征分析35
3.4RNA.seq结果与分析35
3.4.1总RNA提取及质量检测35
3.4.2测序原始数据质量一36
3.4.3基因组比对一38
3.4.4IncRNA的鉴定与分析39
3.4.5蛋白编码基因(mRNA)的鉴定与分析42
3.4.6差异表达分析..42
3.4.7功能分析一45
3.4.8可变剪切分析一47
3.4.9荧光定量PCR验证.48
3.5讨论.49
3.5.1测序质量评估..49
3.5.2IncRNA的筛选49
3.5.3猪甲状腺组织IncRNA的特征..50
3.5.4约克夏猪和金华猪差异mRNA.50
3.5.5约克夏猪和金华猪差异IncRNA5l
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4基于smallRNA.seq鉴定分析miRNA53
4.1实验材料.53
4.I.I实验动物..53
4.1.2实验主要仪器一53
4.1.3实验主要试剂一53
4.2实验方法.53
4.2.1甲状腺组织采取一53
4.2.2总RNA提取与质量检测53
4.2.3samllRNA文库构建..54
4.2.4smallI埘A文库测序55
4.2.5荧光定量PCR验证55
4.3测序数据处理及生物信息学分析.56
4.3.1测序数据质量检测一56
4.3.2测序数据过滤..56
4.3.3长度筛选一56
4.3.4基因组比对分析..57
4.3.5smallRNA分类注释..57
4.3.6miRNA表达及差异分析57
4.3.7miRNA靶基因预测57
4.3.8GO和KEGG分析..57
4.4smallRNA.seq结果与分析58
4.4.1测序数据质量检测..58
4.4.2smallI埘A基因组定位一60
4.4.3smallRNA分类注释一60
4.4.4已;lx】miRNA...61
4.4.5新miRNA62
4.4.6miRNA差异表达分析62
4.4.7miRNA靶基因预测及功能分析65
4.4.8荧光定量PCR验证69
4.5讨论69
4.5.1猪甲状腺miRNA69
4.5.2猪甲状腺miRNA靶基因预测70
4.5.3猪甲状腺高表达miRNA71
4.5.4约克夏猪和金华猪差异表达miRNA71
5差异表达miRNA.mRNA和miRNA。
lncRNA联合分析73
5.1实验材料.73
5.2实验方法.73
5.3联合分析结果.73
5.3.1差异基因联合分析一73
513.2miRNA.mRNA功能分析74
5.3.3miRNA.靶基因调控网络74
5.4讨论76
5。
4.1RNA.seq和smallRNA.seq联合分析76
5.4.2miRNA.mRNA调控网络77
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6结论、创新点与展望79
6.1结论79
6.2创新点.80
6.3展望.80
参考文献一81
附录91
作者简历及在学期间所取得的科研成果109
致谢110
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浙江大学博士学位论文摘要
摘要
猪的脂肪代谢是一个十分复杂的过程,涉及多个组织器官的调控,其中甲状腺分泌的甲状腺激素在脂质代谢过程中发挥着重要的作用。
目前对甲状腺激素调控的研究主要集中在DNA和mRNA层面,对非编码RNA介导的基因表达调控的研究还比较匮乏。
长链非编码RNA(10ngnon—codingRNA,lncRNA)和microRNA都是重要的调控性非编码RNA。
约克夏猪是瘦肉型猪,生长快且脂肪率低,而金华猪是脂肪型猪,生长慢但脂肪率高,它们在脂肪代谢方面有很大的差异。
本研究以阉割的120日龄的约克夏猪和金华猪为研究对象,比较它们的血清甲状腺激素水平,并利用RNA.seq和smallRNA.seq技术筛选出了大量在约克夏猪和金华猪甲状腺组织中差异表达的mRNA、lncRNA和miRNA,并对差异表达的mRNA及差异表达的lncRNA和miRNA的靶基因进行了功能注释和通路分析,利用荧光定量PCR技术对筛选出的部分差异基因进行了验证,此外,还将获得的RNA.seq结果和smallRNA.seq结果进行了联合分析。
主要研究内容和结果如下:
(1)约克夏猪的体重和甲状腺重均显著高于金华猪(P<0.05),但两者比值不变。
约克夏猪的血清TT4和TT3水平显著高于金华猪(P<0.05),约克夏猪的血清FT4和FT3水平高于金华猪,但差异不显著(尸>O.05)。
(2)RNA.seq共获得约351M(million)高质量的读长为125nt的双末端原始读段,其中约83%可以比对到猪参考基因组。
共鉴定到22,435个已知mRNA在猪甲状腺组织中表达,其中分别有1,492、2,479个在约克夏猪和金华猪特异性表达。
并筛选得到1,018个IncRNA,包括760个lincRNA,140个intronicIncRNA和118个anti.senseIncRNA,此外还筛选到1189个新mRNA。
本研究鉴定到的IncRNA与猪已知的蛋白编码基因相比,IncRNA具有更短的转录本和ORF长度、更少的外显子和更低的序列保守性。
差异表达分析共筛选出492个mRNA的表达量在两个品种间存在显著差异,其中275个mRNA在约克夏猪甲状腺中高表达,217个在金华猪甲状腺中高表达,差异基因被注释到酪氨酸代谢、钙离子信号通路、甲状腺激素合成等生物学通路,主要富集在细胞周期和基于微管的过程。
差异表达分析还筛选出48个lncRNA在约克夏猪和金华猪的甲状腺中差异表达,其中10个经cis预测找到13个靶基因。
在猪甲状腺组织中共发现了12类可变剪
V
万方数据
浙江大学博士学位论文摘要
切,其中TSS(转录起始位点)与TTS(转录终止位点)两种剪切类型所占的比例最大,分别约占38%和30%的百分比。
(3)smallRNA.seq共获得约44M(million)高质量的单末端原始读段,其中约74%可以比对到猪参考基因组。
共鉴定到293条已知的miRNA在猪甲状腺组织中表达,对应266个miRNA的前体,属于146个miRNA家族,此外还鉴定到60个新miRNA。
差异表达分析共筛选出18个miRNA在两个品种间差异表达,其中12个miRNA在约克夏猪甲状腺中高表达,6个在金华猪甲状腺中高表达,生物信息学分析显示差异miRNA参与甲状腺激素调控相关通路,如内吞、
甲状腺激素合成、钙离子信号通路、过氧化物酶体、溶酶体等。
(4)荧光定量PCR检测了18个差异基因在约克夏猪和金华猪甲状腺组织的
表达情况,结果表明与测序结果基本一致,说明本实验的分析结果基本可以反映猪甲状腺组织内基因的真实表达情况。
(5)对差异表达的mRNA、IncRNA和miRNA进行联合分析,结果得到的网络调控图中包括237个mRNA、18个miRNA和1个lncRNA。
关键字:
约克夏猪;金华猪;甲状腺;IncRNA;miRNA;mRNA
万方数据
浙江大学博士学位论文ABSTRACT
ABSTRACT
Fatmetabolismisacomlexprocess,andrequiresthecoordinatedactionofseveralorgans.Thethyroidglandregulatesthefatmetabolismbyproducingthyroid
hormones.Theincreasedthyroidhormonescanstimulatebothlipogenesisand
lipolysis,althoughlipolysisisinfluencedmorethansynthesis.Althoughpreviousstudiesrevealedavarietyofgenesinvolvedintheregulationofthyroidhormones,littleisknownabouttheroleofnon—codingRNAs.Longnon-codingRNA(IncRNA)
andmicroRNAareimportantregulatorynon—codingRNAs.TheJinhuapigisachinsesindigenousfat—typepigbreed,whichhaslowgrowthrate,butstrongfatdeposition.TheYorkshirepigisalean-typepigbreedcharacterizedbyhighgrowthrate,butlowfatdeposition.Inthisstudy,castratedJinhuapigsandYorkshirepigsof120daysofagewerechosenasexperimentanimaJs.Theserumthyroidhormoneslevelsweremeasured,andRNA-seqandsmallRNA-seqwereemployedtoexplore
mRNA,IncRNAandmiRNAexpressioninthethyroidglandofYorkshireandJinhuapigs.Differentiallyexpressedgeneswerefiltered,andGOandKEGGanalysiswere
performed.Besides,quantitativereal-timePCRwasperformedtovalidatetheselected
differentiallyexpressedgenes.Atlast,weconbinedtheresultsofRNA-seqandsmallRNA—seq.Themainresultsareasfollows:
(1)BodyweightandthyroidglandweightofYorkshirepigsweresignificantlyhigherthanthoseofJinhuapigs伊<0.05),yetthethyroidindexdidnotdifferbetweentwopigbreeds.Yorkshirepigsshowedobviouslyhigherserumtotalthyroxine(TT4)andtotaltriiodothyronine(TT3)levelscomparedwithJinhuapigs(P
<0.05).Serumfreethyroxine(FT4)andfreetriiodothyroninelevels(FT3)ofYorkshirewerehigherthanthoseofJinhuapigs,butthedifferencewasnotstatisticallysignificant(P>O.05).
(2)RNA-seqyieldedabout351millionof125-bppaired—endreadsandapproximately83%ofreadswereambiguouslymappedagainstthepigreferencegenome(S.scrofa10.2).Atotalof22,435knownmRNAsweredetectedinthepigthyroidinthisstudy.OftheseidentifiedmRNAs,18,464expressedinbothJinhuaand
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浙江大学博士学位论文ABSTRACT
Yorkshirepigs,while1,492and2,479werebreed·specificinYorkshirepigsandJinhuapigsrespectively.Atotalof1,018lncRNAwereidentifiedthefoursequencinglibraries,including760intergenic,140intronicand118antisenseIncRNA.Further,
1189novelmRNAswereidentified.ThecandidatelncRNAsidentifiedinthisstudywereshorterinbothtranscriptlengthandORFlength,fewerinexonnumberandlessconservedthanmRNAs.Intheexpressionanalysis,492differentiallyexpresssed(DE)mRNAswereidentifiedbetweenYorkshireandJinhuapigs.IntheseDEmRNAs,275wereupregulatedintheYorkshirepigs,whiletheremaining217wereupregulatedintheJinhuapigs.TheDEmiRNAswereinvolvedinthe‘calciumsignalingpathway’,‘tyrosinemetabolism’,‘thyroidhormonesynthesispathway’andSOon,andtheywere
significantlyenrichedin‘cellcycle’and‘microtubule-basedprocess’.Atotalof48IncRNAwereidentifiedtobedifferentiallyexpressedbetweenYorkshirepigsandJinhuapigs.AmongtheseDElncRNAs,10werelocatedinnearbydifferentiallyexpressedcodinggenes(distance<100kb),and13miRNA—mRNApairswere
predicted.Fourtypesofaltemativesplicingeventsweredetectedintheporcinethyroidgland.Andalternative5’firstexonandalternative3’lastexonwerethecommonesttypesofalternativesplicingeventinthisstudy.
(3)SmallRNA-seqyieldedabout44millionofsingle—endreadsandapproximately74%ofreadswereambiguouslymappedagainstthepigreferencegenome(S.scrofa10.2).Atotalof293knownmicroRNAswereidentifiedintheporcinethyroidgland,correspondingto266pre-miRNAs,belongingto146miRNAfamilies.Further,60novelmiRNAswereidentified.Atotalof18miRNAswere
differentiallyexpressedbetweenYorkshirepigsandJinhuapigs(P<0.05),ofwhich12miRNAsweredown--regulatedand6wereup—·regulatedinYorkshirepigscomparedtoJinhuapigs.TheDEmiRNAswereinvoledin‘thyroidhormonesynthesispathway’,‘thecalciumsignalingpathway’,‘peroxisome’,‘glutathionemetabolism’,‘lysosome’,and‘tyrosinemetabolism’.
(4)TovalidatetheexpressionprofilesobtainedbyRNA·SeqandsmallRNA·seq,quantitativereal—timePCR(qRT-PCR)wasperformedon18differentiallyexpressed
genes.AndtheresultsofqRT-PCRweresimilartohigh-throughputsequencing.
V川
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浙江大学博士学位论文ABSTRACT
(5)InordertoinvestigatethefunctionsofthedifferentiallyexpressedmRNAs,lncRNAandmiRNAs,weconbinedtheresultsofRNA-seqandsmallRNA-seq.Finally,a
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- 约克夏猪和金华猪甲状腺组织mRNA lncRNA和miRNA测序及功能分析 约克 金华 甲状腺 组织 mRNA lncRNA miRNA 功能分析