CRISP原理.docx
- 文档编号:26519549
- 上传时间:2023-06-20
- 格式:DOCX
- 页数:19
- 大小:1.71MB
CRISP原理.docx
《CRISP原理.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《CRISP原理.docx(19页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
CRISP原理
CRISP原理
CRISPR/Cas9基因敲除技术
CRISPR/Cas9(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)是一种由RNA指导的Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。
目前,来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。
在这一系统中,crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与转录激活crRNA(trans-activatingRNA,tracrRNA)退火结合形成双链RNA能特异性识别基因组序列,Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域,可以分别切割DNA两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物,然后通过PAM序列结合并侵入DNA,形成RNA-DNA复合结构,进而对目的DNA双链进行切割,生成DNA双链断裂(double-strandbreaks,DSBs)。
在基因组编辑过程中,tracrRNA和crRNA可以融合成为1条RNA(sgRNA)表达同样可以起到靶向剪切的作用。
起源:
1、2007年,来自丹尼斯克公司(一家总部位于丹麦哥本哈根的食品添加剂公司,目前被杜邦公司收购)的科学家找到了一种能增强细菌防御噬菌体能力的方法。
2、2013年,四个研究团队报告了这一被称为CRISPR的系统,自此CRISPR技术红红火火的发展了起来,许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因。
3、2015年,蒙大拿州立大学的两位学者以“CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmuneSystems”为题,介绍了CRISPR-Cas免疫应答系统。
其中BlakeWiedenheft就是当年加州大学伯克利分校JenniferDoudna研究组成员,他们曾于2010年破解了Csy4核糖核酸内切酶原子水平的晶体结构模型——研究人员确定Csy4是一种存在于原核细胞的酶,它能够启动生成CRISPR衍生RNAs(crRNAs),这种小RNA分子能够靶向并沉默侵入的病毒和质粒。
CRISPR与RNAi的区别
目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是mRNA,而CRISPR通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列,是可以遗传的。
由于编码mRNA的DNA序列只占总DNA的极少部分,因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多,更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。
CRISPR/Cas9特点和缺点:
CRISPR/Cas9的优点是操作简单,对基因组的效率高。
需要对某一个靶位点编辑的时候,只需要表达相应的sgRNA即可,不需要对Cas9核酸酶进行改造。
它可对任何物种的基因组进行高效率的定向编辑。
1、操作简单,靶向精确性更高。
sgRNA靶向序列和基因组序列必须完全匹配,Cas9才会对DNA进行剪切。
编码sgRNA的序列不超过100bp,因此比构建TALENs和ZENs更简单方便,用于CRISPR的sgRNA识别序列仅需20个核苷酸。
2、CRISPR/Cas9系统是由RNA调控的对DNA的修饰,其基因修饰可遗传。
3、基因修饰率高,基因调控方式多样,例如敲除、插入、抑制、激活等
4、可实现对靶基因多个位点同时敲除。
5、无物种限制。
6、实验周期短,最快仅需2个月,节省大量时间和成本。
基因组编辑技术的一个缺点是脱靶效应,可能在靶点以外的地方切断DNA,产生indel。
CRISPR-Cas系统三个主要阶段
细菌和古细菌进化出了复杂的CRISPR适应性免疫系统,这一系统可以分成I-III三个类型,至少有11种不同的亚型:
从I-A到I-F,从II-A到II-C,以及III-A和III-B。
其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用,而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可,这为其能够广泛应用提供了便利条件。
不过尽管有这些不同,所有的CRISPR-Cas系统都通过三个主要阶段来完成功能:
采集,CRISPRRNA(crRNA)生物合成,靶向干扰。
阶段1:
外源DNA采集
外源核苷酸是通过Cas蛋白来识别的,入侵的短片段DNA(30-50个碱基对)被称为protospacers,作为间隔序列插入宿主CRISPR位点中,由重复序列隔开。
对于I型和II型系统来说,protospacers来自入侵DNA中两侧出现2-5个核酸结构(PAM,protospaceradjacentmotif)的区域。
一般protospacers连接在CRISPR位点的一端,并且后者通过涉及Cas1、Cas2和游离3’-hydroxyls等元件的机制,牵引序列。
Protospacer的整合过程中也出现了牵引末端重新序列复制,这可能涉及宿主聚合酶和DNA修复机制。
相关论文解析:
MultiplemechanismsforCRISPR–Casinhibitionbyanti-CRISPRproteins
研究人员确定了其中三种anti-CRISPR蛋白:
AcrF1、AcrF2和AcrF3的功能机制。
他们对这些蛋白进行了生物化学及体内研究,证实每一个anti-CRISPR蛋白都通过不同的机制来抑制了CRISPR–Cas的活性。
有两个anti-CRISPR阻断了CRISPR–Cas复合物的DNA结合活性,但它们是通过与不同的蛋白质亚基互作,利用了空间或非空间抑制模式来做到这一点的。
第三种anti-CRISPR蛋白通过结合Cas3解螺旋酶-核酸酶,阻止其招募到结合DNA的CRISPR–Cas复合物上来起作用。
在体内,这一anti-CRISPR可以将CRISPR–Cas系统转变为转录遏制物,首次证实了一种蛋白质相互作用蛋白可以调控CRISPR–Cas活性。
作者们认为,这些anti-CRISPR蛋白质不同的序列及作用机制表明了独立的进化,并预示了还存在其他的方式—蛋白质借助于它们改变了CRISPR–Cas的功能。
新研究首次探讨了蛋白质抑制CRISPR–Cas系统的机制。
这些多样且不同的机制反映了病毒-宿主军备竞赛深层的进化根源。
这些已知和尚有待发现的Anti-CRISPR,将为认识和操控CRISPR–Cas系统提供大量有价值的工具。
其中一个例子就是,新研究发现AcrF3通过阻止招募Cas3将CRISPR–Cas系统转变为了一个基因调控因子。
由于除了破坏外源DNA,CRISPR–Cas系统来执行着各种功能,许多重要的功能有可能是由与CRISPR–Cas元件互作,由此改变了这一系统活性的蛋白质来完成。
生物谷推荐的英文原文SnapShot:
CRISPR-RNA-GuidedAdaptiveImmuneSystems
阶段2:
crRNA合成
CRISPRRNA生物合成在转录之后,生成初级转录产物:
pre-crRNA,之后经过加工,又成为一组短小的CRISPR衍生RNAs(crRNAs),这些crRNAs每一个都包含有对应于之前遇到的外源DNA的对应序列。
CrRNAs导向序列两端是相邻重复序列区域,在I型和II型系统中,这种CRISPR转录产物会被CRISPR特异性核酸内切酶(Cas6或Cas5d)切割,切割位点位于重新序列。
许多I型系统的重新序列会出现多次,因此Cas6也需要稳定连接在crRNA3’端茎环上。
对于III型系统来说,Cas6则是短暂连接,crRNA3’端会进一步通过未知的酶处理。
II型系统中,CRISPRRNA加工过程则取决于反式作用crRNA(tracrRNA),tracrRNA包含一个重复序列的互补序列,这些双螺旋区域在Cas9出现时可以通过RNaseIII进行处理。
相关论文解析:
CRISPR-mediatedadaptiveimmunesystemsinbacteriaandarchaea.
这篇发表在Annu.Rev.Biochem.杂志上的文章十分重要,解析了crRNA合成过程,以及其后的靶向干扰中的几个重要步骤,此后也被多人引用。
DevelopmentandapplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering
张锋的这篇综述概述了CRISPR/Cas9作为一种平台技术的开发状况以及在基因组编辑方面的应用,也讨论了其存在的一些挑战,以及未来的创新之路。
阶段3:
靶向干扰
成熟的crRNAs能指导Cas蛋白靶向互补靶标,靶标序列由专用Cas核酸酶降解,但其靶标降解的机制存在差异。
I型和II型系统都可以靶向包含PAM和protospacer互补序列的dsDNA底物。
III型系统则不依赖于PAM作为识别序列,而是通过导向序列延伸至crRNA信号5'handle的核苷酸进行识别(CRISPR位点包含与导向序列,5'handle互补的序列),并阻止靶向切割。
相关论文解析:
Co-transcriptionalDNAandRNACleavageduringTypeIIICRISPR-CasImmunity
一些数据表明,当病毒入侵细菌细胞时,称作为III型CRISPR-Cas的这一机制会靶向病毒的DNA,阻止它利用细菌的机器来拷贝自身及感染更多的细菌。
但另外的一些实验表明,III型CRISPR-Cas只能通过切割病毒RNA来让病毒丧失能力。
洛克菲勒大学的研究人员他们检测了III型CRISPR-Cas对DNA和RNA的切割,结果发现了从前其他人没有得到过的一个关键成分,并发现CRISPR-Cas确实切割了病毒DNA生成的RNA,但它也切割了病毒的DNA。
这种双交叉系统有一些优势。
许多的病毒整合到它们感染细胞的基因组中保持休眠状态,不会造成损伤。
事实上,这些病毒对于细菌可能是有益的,例如它们携带的毒素帮助了细菌促进自身生存。
举例说来,白喉毒素是由一种细菌所分泌,但编码这一毒素的基因却来自于一种病毒。
只有在病毒开始将它们的DNA转录为RNA之时才会让它们丧失功能,通过设置这样的要求III型CRISPR-Cas不会损及休眠病毒,使得它们可以继续让宿主细菌受益。
循环关闭
I型系统中,监测复合物中靶向结合会导致Cas3介导的靶向降解(直接干扰)或最初采集,这其中涉及crRNA导向募集Cas3、Cas1和Cas2到外源DNA处,引起新一轮的快速采集。
II型系统中虽然未观察到最初采集,但Cas9也是protospacer筛选的必要元件,这表明在靶向干扰与外源DNA采集之间存在一种功能性联系。
近期还有研究发现了编码anti-CRISPRs蛋白的不同病毒基因,指出了干扰以上不同阶段,能颠覆CRISPRs系统。
Cas9specifiesfunctionalviraltargetsduringCRISPR-Casadaptation.
一些证据表明,某些Cas酶(未包括Cas9)自身可以操控记忆形成过程。
基于Cas9识别切割位点的方式,研究人员猜测Cas9在记忆形成中也发挥了作用。
除了匹配CRISPR引导序列和病毒DNA,Cas9需要在附近寻找第二信号:
病毒DNA中的前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif,PAM)序列。
这是一个至关重要的步骤,因为PAM序列的存在阻止了Cas9攻击细菌自身包含记忆的DNA。
为了检验他们的假说,研究人员交换了化脓链球菌和嗜热链球菌免疫系统的Cas9酶,它们各自识别不同的PAM序列。
结果,PAM序列跟随着在两种细菌之间发生了交换——表明在记忆形成中Cas9负责了PAM的识别。
MultiplemechanismsforCRISPR–Casinhibitionbyanti-CRISPRproteins
实验操作
1、根据靶序列设计RNA序列;
设计sgRNA,提供的序列经过blast,优选脱靶效应最低,此外,为进一步提高sgRNA的特异性和降低脱靶效应,提供双切口sgRNA对设计(Figure1)。
Figure1.SchematicillustratingDNAdouble-strandedbreaksusingapairofsgRNAsguidingCas9D10Anickases(Cas9n).
2、sgRNA表达载体构建,或sgRNA体外转录合成
A、sgRNA表达载体构建(试剂盒PrecutSgRNACloningkit&pSD-gRNAPlasmid)
质粒pSD-gRNA专门用于在哺乳动物细胞中表达sgRNA,该质粒含CMV启动子驱动的GFP报告基因表达框,与Cas9表达质粒一起转染细胞即可以完成基因组编辑功能。
此质粒含氨苄抗性用于阳性克隆筛选,试剂盒提供预剪切线性质粒,可以直接进行连接筛选阳性克隆,降低了酶切质粒不完全导致假阳性克隆的出现几率。
B、sgRNA体外合成。
sgRNA合成纯化试剂盒(T7sgRNAMICscriptTMKIT&EzOmicsTMRNAQUICKclearKIT)体外转录的sgRNA与质粒表达的sgRNA相比,更简便快捷,省去了质粒构建的步骤,整个操作过程仅需20h(包括过夜孵育)。
转录纯化后的sgRNA可直接进行转染及细胞显微注射。
(1)sgRNA合成引物(反向引物设计为固定模式)
(2)PCRkit(e.g.pfuDNApolymerase)
(3)T7sgRNAMICscriptTMKIT
(4)EzOmicsTMRNAQUICKclearKIT-------一步纯化RNA转录产物
简单三步实现sgRNA轻松合成
3、全基因组sgRNA文库的构建(用于全基因范围的基因打靶,构建突变体库)
(1)根据物种信息,进行生物信息统计
(2)针对物种的全基因组进行RNA序列设计
(3)根据设计结果合成RNA或构建sgRNA表达载体库
(4)sgRNA表达质粒和合成的RNA文库,质粒及RNA质量分析报告。
4、CRISPR/Cas9载体
有多种cas9表达载体及其sgRNA共表达载体,三种不同的突变用于不同的应用,例如双切口敲除、单切口敲除、抑制转录、启动子激活等。
5、sgRNA活性检测
包括SSAluciferase报告系统、Surveyor法、Q-PCR、突变点基因测序等
(1)SSA检测:
根据要求检测sgRNA的活性及敲除效率,也可以选购BiomicsPrecutpSG-targetCloningkit自行构建报告载体用于检测,提供阳性及阴性sgRNA及其SSAreporttarget质粒。
检测原理:
SSA报告质粒(pSG-target)中luciferase基因被终止密码子提前终止,这种截短的luciferase没有活性。
为检测sgRNA的剪切活性,将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。
在Cas9和sgRNA的作用下,靶点位置的序列被有效剪切形成DSB,细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase(Figure2),通过检测luciferase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性(Figure3)。
Figure2.RestoredisruptedluciferasefunctionviasgRNA-mediatedhomologousrecombination
Figure3.IncreasedFL/RLratioinCas9/sgRNAtransfectioncells.
(2)Surveyor法及测序验证
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致,都是NHEJ或是HR。
因此在CRISPR/Cas9的应用中,活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:
靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法(Surveyor法)。
Surveyor法即错配酶法:
靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板,将主要以非同源重组的方式进行修复,或多或少会插入或删除一些碱基。
因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火,将形成错配。
错配酶(主要是CEL1或T7E1酶)将识别错配的杂合双链并剪切。
产物跑电泳,比较切割条带与未切割条带的比例,即可反映出Cas/sgRNA的活性。
6、稳定表达Cas9蛋白细胞株筛选(StableCAS9Proteinexpressingcelllinescreening)
通过抗性基因的筛选,筛选出稳定表达的Cas9细胞系。
使用该细胞系筛选sgRNA时,不需要额外转染表达Cas9的质粒,简化试验操作,提高试验的可重复性。
7、利用CRISPR系统进行基因重组donor质粒构建
该系统可用于sgRNA剪切效果的检测。
与SSA系统不同的是,需要额外转染donor质粒进行同源重组,即可恢复mCherry的活性。
同时,可根据客户的需要,将特定的基因通过donor的方法敲入到指定位点,进行基因敲入(敲除)的服务。
新技术改善CRISPR/Cas9系统的准确率
在2013年6月,来自麻省总医院的研究人员发现使用CRISPR-CasRNA引导性核酸酶的一个重要局限:
会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变。
另有研究直接说明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性,即该技术可以发生非特异性切割,引起基因组非靶向位点的突变,这样会造成研究结果的不确定性以及研究工作的大量增加,这一问题严重地限制了Cas9的应用。
1、ChIP-seq方法
在2014年6月,弗吉尼亚大学医学院的研究人员设计出一种方法,可检测风靡科学界的CRISPR/Cas9基因编辑系统中意想不到的副作用,相关研究结果发表在《NatureBiotechnology》。
1个月后,中国医学科学院和北京生命科学研究所(NIBS)的研究人员,在《CellResearch》发表的一项研究中,利用一种公正的全基因组ChIP-seq方法,分析了人类基因组中CRISPR/Cas9的结合脱靶效应。
新年伊始,美国希望之城贝克曼研究所和浙江大学第一附属医院的研究人员在《NatureBiotechnology》描述了一种新策略,有望帮助科学家检测基因组编辑技术中的脱靶效应。
2、Digenome-seq方法
2015年2月9日,来自韩国首尔大学、首尔基础科学研究所等机构的研究人员在Nature旗下子刊《NatureMethods》发表一项研究,成功证实CRISPR-Cas9在人类细胞中有精确的打靶作用,他们开发出一种强大、敏感、无偏见和具有成本效益的方法——Digenome-seq,可在全基因组范围内检测人类细胞中的CRISPR/Cas9脱靶效应。
在这项研究中,虽然RNA引导的、通过CRISPR-Cas9系统的基因组编辑已经被广泛应用于生物医学研究,但是Cas9核酸酶的全基因组靶向特异性仍然是有争议的。
为此,他们提出一种方法Digenome-seq,利用基因组测序查找CRISPR-Cas9可能突变产生的打靶和脱靶序列。
他们用Cas9核酸酶在试管中消化人类基因组DNA,然后进行全基因组测序。
这种体外消化可产生打靶和脱靶序列的独特模式,可以通过计算确定。
此外,在sgRNA末端添加组成CRISPR-Cas9的鸟嘌呤核苷酸,研究人员成功地制备了这种高度发达的可编程核酸酶,在人类基因组中它没有可测量的脱靶效应。
Jin-SooKim表示:
“如果CRISPR-Cas9可缩短脱靶的DNA序列,它就可能诱导多余的突变。
因为我们成功证实了CRISPR-Cas9的精确度,我们认为,这将推动基因或细胞治疗的发展。
”
研究人员还表示,Cas9核酸酶可能是高度特异性的,从而诱导整个基因组中仅仅几个(而不是数千)位点的脱靶突变,而且Cas9脱靶效应可通过用改性sgRNAs替换“混杂”单导RNAs(sgRNAs)而得以避免。
总而言之,Digenome-seq是一种强大的、敏感的、无偏见的和具有成本效益的方法,可分析编程核酸酶(包括Cas9)的全基因组脱靶效应。
参考文献Digenome-seq:
genome-wideprofilingofCRISPR-Cas9off-targeteffectsinhumancells
3、CRISPR/Cas9-pDBD
美国麻省大学医学院的科学家开发的新型CRISPR/Cas9技术可以足够精确地在几乎任何基因组的位点处对DNA进行切割,同时还可以避免潜在的在标准CRISPR基因编辑技术中发现的有害的脱靶性改变,近日,研究者通过将CRISPR/Cas9系统同可编程的DNA结合结构域(CRISPR/Cas9-pDBD)相结合,开发出了一种附加的校对步骤,其可以有效改善基因编辑系统的精确性,同时为开发潜在的基因疗法提供希望,相关研究刊登于国际杂志NatureMethods上。
研究者ScotWolfe博士表示,标准的CRISPR/Cas9系统善于在体外利用单链引导的RNA来对基因组进行切割,理想状况下这种技术可以应用于大部分的基因疗法中,包括对大量细胞进行编辑来尽可能减小对基因组的附带损伤;文章中研究人员给CRISPR/Cas9系统中添加了一种额外的校对步骤,通过将锌指DNA结合结构域融入到CRISPR/Cas9系统中就可以明显改善CRISPR/Cas9系统的精确性,大约可以改善大约100倍的精确性。
如今研究人员正在开发新型的核酸酶平台用于切除感染细胞中潜在的HIV原病毒,同时修饰引发慢性肉芽肿病的遗传突变。
文章中科学家们利用人工引导的RNAs来对CRISPR/Cas9进行重编程从而清除哺乳细胞基因组中的特殊序列,也可以在细胞的遗传信息中插入新的片段,因此CRISPR/Cas9系统是一项革命性的医学进步,其可以很容易地对细胞中的基因进行失活的活化操作。
锌指结构域是一种特殊蛋白,其可以被工程化操作结合到基因组的特殊区域中,通过将DNA结合的锌指结构域同RNA引导的CRISPR/Cas9系统结合,研究者就可以开发出一种高效高准确率的新型系统;当前研究中研究小组表示,当将二者结合以后,和靶向作用两个不同基因组位点相关的脱靶切割事件大大降低了,而且脱靶切割事件下降将近10倍。
因此研究者表示,将DNA结合结构域同CRISPR/Cas9进行结合或许可以开发出一种新型平台来减少基因疗法给患者所带来的潜在风险。
研究者目前正在开发修饰化的Cas9来在造血干细胞中直接修复引发疾病的突变,用来治疗慢性肉芽肿病患者,他们的最终目的就是将正确的细胞再次插入到患者机体中帮助患者恢复机体免疫功能,从而达到疾病治愈的目的。
进展
在过去两年中,共有大约650篇关于CRISPR/Cas9技术的文章发表,这些论文涉及特殊特征的动物模型,基因编辑相关的疾病,还有基因敲入,可逆敲除,基因激活和表达等多方面领域。
而且在如HIV,疟疾,癌症等人类疾病中也有应用。
DevelopmentandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering
在生命科学研究中,一些可以删除、插入
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- CRISP 原理