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酶促反应动力学实验教案
生物化学实验(上)
实验一酶促反应动力学实验
·底物浓度对酶活性的影响
·pH对酶活性的影响
·温度对酶活性的影响
华中科技大学生命科学与技术学院
2014级生物化学小老师第一组
酶促反应动力学综合实验
实验
(一)——碱性磷酸酶Km值的测定
【实验目的】
1.了解底物浓度对酶促反应速率的影响
2.掌握米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km的方法。
【实验原理】
1.米氏方程:
(1)
式中:
v表示酶促反应速率,
表示酶促反应最大速率,
[S]表示底物浓度,
Km表示米氏常数。
v=Vmax×[S]/(Km+[S]),这个方程称为Michaelis-Menten方程,是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的,其中Km值称为米氏常数,Vmax是酶被底物饱和时的反应速度,[S]为底物浓度。
由此可见Km值的物理意义为反应速度v达到1/2Vmax时的底物浓度(即Km=[S]),单位一般为mol/L,只由酶的性质决定,而与酶的浓度无关。
可用Km的值鉴别不同的酶。
当底物浓度非常大时,反应速度接近于一个恒定值。
在曲线的这个区域,酶几乎被底物饱和,反应相对于底物S是个零级反应。
就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。
反应速度逐渐趋近的恒定值称为最大反应速度Vmax。
米氏常数Km是酶促反应速度v为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。
这可通过用[S]取代米氏方程中的Km证明,通过计算可得v=Vmax/2。
2.Km值的测定主要采用图解法,有四种:
①双曲线作图法(图a)
根据公式
(1),以v对[s]作图,此时1/2
时的底物浓度[s]值即为Km值,以克分子浓度(M)表示。
这种方法实际上很少采用,因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。
实测
一个近似值,因而1/2
不精确。
此外由于v对[S]的关系呈双曲线,实验数据要求较多,且不易绘制。
②Lineweaver-Burk作图法—双倒数作图法(图b)
实际工作中,常将米氏方程(式
(1))作数学变换,使之成为直线形式,测定要方便、精确得多。
其中之一即取
(1)式的倒数,变换为Lineweaver-Burk方程式:
(2)
以
对
作图,即为y=ax+b形式。
此时斜率为
,纵截距为
。
把直线外推与横轴相交,其截距即为—
。
③Hofstee作图法(图略,不要求)
把
(2)式等号两边乘以Vmax,得:
(3)
以v对
作图,这时斜率为
,纵截距为
,横截距为
。
④Hanas作图法(图略,不要求)
把
(2)式等号两边乘以[S],得:
(4)
以v对
作图,这时斜率为
,纵截距为
。
(a)(b)
本实验主要以双倒数法,即Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。
具体原理如下:
本实验以碱性磷酸酶为例,用磷酸苯二钠为其作用物,碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸,在适宜条件下,准确反应15分钟。
在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物,以波长660nm比色。
在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。
反应式如下:
然后以光密度直接表示不同底物浓度时的酶反应速度(思考分析这样处理的原理及合理性),即以光密度的倒数作纵坐标,以底物浓度的倒数作横坐标,按Lineweaver-Burk作图法来测定碱性磷酸酶Km值。
【仪器与试剂】
仪器:
1.恒温水浴锅;
2.721型分光光度计;
3.试管;
4.吸量管;
5.移液枪;
6.烧杯。
试剂:
1.酚试剂
2.2.5mM磷酸苯二钠基质液
3.碱性缓冲液(pH10.0)
4.碱性磷酸酶
【注意事项】
1.加入碱性磷酸酶的量要准确,并且提前进行预热。
2.保温时间要准确,不同试管加热时间须保持一致,注意计时方法。
3、磷酸苯二钠为2.5mmol/L,注意与后两个试验区分。
4、使用分光光度计和移液枪时注意操作步骤。
【实验步骤】
取6支试管按下表加入试剂:
0号管切勿加酶!
0
1
2
3
4
5
2.5mM磷酸苯二钠(mL)
1.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水(mL)
0.2
0.8
0.6
0.4
0.2
------
碱性缓冲液(pH10.0)(mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀后,37℃预温5分钟。
注意:
碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃,再滴加到试管中参与反应
碱性磷酸酶液(mL)
------
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
混匀后,37℃水浴15分钟(准确计时)。
注意:
1)加入碱性磷酸酶液要快速、准确。
(用移液枪加)
2)酶促反应溶液总体积2.2mL。
3)第0管不加酶,基本无反应。
酚试剂(mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
10%Na2CO3(mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
混匀后,37℃水浴15分钟(准确计时)。
注意:
1)酚试剂为显色剂,同时为酶的变性剂,故加入酚试
剂后酶促反应停止。
2)Na2CO3提供碱性环境,加入Na2CO3后试剂才显
色,37℃水浴使显色充分。
以0号管调零,在660nm波长处比色。
【结果处理】
1.将各管光密度和底物浓度记入下表:
管号
1
2
3
4
5
O.D1
O.D2
O.D3
O.D(均值)
1/O.D
[S]请自行计算
1/[S]
2.以1/O.D为纵坐标,1/[s]为横坐标,按Lineweaver-Burk作图,求出碱性磷酸酶的Km值,并分析实验结果。
实验
(二)——PH对酶活性的影响
【实验目的】
了解PH对酶活性及酶促反应速度的影响,加深对酶特性的认识。
【实验原理】
大部分酶活力受其环境pH的影响。
在一定的pH下,酶反应具有最大速度,高于或低于此值,反应速度下降,通常称此pH值为酶反应的最适pH。
不同的酶具有不同的最适pH。
【仪器与试剂】
仪器:
1.恒温水浴锅;
2.试管和试管架;
3.移液枪及枪头;
4.721型分光光度计;
5.移液管。
试剂:
1、0.01M磷酸苯二钠。
2、碱性磷酸酶液(pH=10)。
3、不同pH缓冲液。
4、酚试剂和10%Na2CO3溶液。
【注意事项】
1、碱性磷酸酶溶液应先放于水浴锅中预热达到37℃,再滴加到试管中参与反应
2、注意磷酸苯二钠为0.01mmol/L,与实验一不同
【实验步骤】
取六支洁净试管,编号后按表操作:
管号
0
1
2
3
4
5
0.01M磷酸苯二钠(mL)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
缓冲溶液
蒸馏水
1.2mL
pH9
1.0mL
pH10
1.0mL
pH11
1.0mL
pH12
1.0mL
pH>12
1.0mL
混匀,置于37℃水浴5min。
注意:
碱性磷酸酶溶液应先置于水浴锅中预热到37℃,再滴加到试管中参与反应
碱性磷酸酶液(mL)
-----
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
混匀,再置于37℃水浴15min。
酚试剂(mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
10%Na2CO3(mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
混匀后,置于37℃水浴中再次保温15min,然后以第0管调零点,用660nm波长比色。
以各管pH为横坐标,光密度为纵坐标绘制曲线,从曲线上可大致得出碱性磷酸酶的最适pH。
【结果处理】
记录现象(或比较吸光度值),以pH为横坐标、吸光度为纵坐标制图,根据图象做出合理分析。
实验(三)——温度对酶活性的影响
【实验目的】
了解温度对酶活性及酶促反应速率的影响,加深对酶特性的认识。
【实验原理】
每种酶都有其最适温度,高于或低于此温度酶的活性都降低。
一般而言,若酶处于过高的温度环境中,会使酶活性永久丧失;而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制,一旦温度适宜,酶又会全部或部分的恢复其活性。
【仪器与试剂】
仪器:
1.恒温水浴锅;
2.试管和试管架;
3.移液枪及枪头;
4.721型分光光度计;
5.移液管。
试剂:
1.碱性缓冲液:
同实验一中碱性缓冲液配制(pH=10);
2.0.01M磷酸苯二钠;
3.酚试剂;
4.碱性磷酸酶液;
5.10%Na2CO3溶液;
【注意事项】
1.加入碱性磷酸酶的量要准确。
2.保温时间要准确,注意计时方法。
3.将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液,立即摇匀之后在室温下放置15min。
【注意事项】
1.加入碱性磷酸酶的量要准确,并且提前放入不同温度水浴锅中进行预热。
2.对反应温度的控制要严格,不同温度下反应的时间必须保证一样,建议每隔一分钟向装有底物的试管中加入酶液,便于用秒表计时。
3.将试管从水浴锅中拿出后再加入酚试剂和碳酸钠溶液,立即摇匀之后在室温下放置15min。
4、注意磷酸苯二钠为0.01mmol/L,与实验一不同
【实验步骤】
取6支洁净试管,参照下表加入试剂:
0
1
2
3
4
5
0.01M磷酸苯二钠(mL)
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
碱性缓冲液(mL)
1.2
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
混匀后,将0~5管分别置于室温、37℃、50℃、60℃、70℃和80℃中水浴5min;
注意:
碱性磷酸酶溶液应先放于不同水浴锅中预热,再滴加到试管中参与反应
碱性磷酸酶液(mL)
------
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
混匀后,继续原温度水浴加热15min(准确计时)。
酚试剂(mL)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
10%Na2CO3(mL)
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
2.0
混匀后,室温放置15min后,以第0管调零,用660nm波长比色。
再以温度为横坐标,光密度为纵坐标,绘制曲线。
从曲线上可得出此实验条件下碱性磷酸酶的最适温度。
【结果处理】
记录现象(或比较吸光度值),以温度为横坐标、吸光度为纵坐标制图,根据图象做出合理分析
【思考题】
1.反应时间15min是经过实验得出的较好结果,试分析时间长了或短了会有何影响?
2.回答实验原理中括号中的思考题
3.第二个实验中两次水浴的目的分别是什么,去掉其中一个行不行,为何?
附录仪器操作规范与注意事项
移液枪使用注意事项:
1.不使用时,请竖直放置;
2.枪头为一次性,可多次吸取同一种液体,不可吸取不同液体;
3.吸液时,拇指向下压到有阻力,然后轻轻释放(一定不能松开拇指),防止液体因惯性冲入移液管;
4.吸液时,枪头内不能有气泡。
规范操作:
取移液枪调至所需加液用量,套上枪头,大拇指摁下按钮到刚有阻力时将枪头伸入液体中,轻轻吸上液体,放出液体时按钮按到底即可。
移液管使用注意事项:
1.使用前必须清洗干净,用吸水纸将尖端内外的水除去,然后用待吸溶液洗三次,洗的时候,吸取液体约占管身的三分之一,将移液管润洗即可。
洗过的溶液应从流液口放出弃之。
2.吸收溶液时,管尖应深入液面10-20mm,并随液面下降而下降,用洗耳球在移液管另一侧将液体吸入管中,(切忌用嘴吸)吸液时,手应慢慢放松洗耳球,避免让移液管内液体上升太快导致液体冲入洗耳球中;另外不要让液面升得太高,使管壁沾附过多的液体,以免在调定液面和排液时流下来,影响容量的准确度。
3.调定液面或放液时吸管均应垂直放置,其流液口与容器内壁相接触,接受容器须倾斜30°,移液管者始终保持垂直。
为保证液体完全流出,要等待约3秒钟,方可拿开。
4.吸管内的溶液按规定方法排出后,移液管尖嘴的残留液,如果移液管上没有标明“吹”的字样,不能排到接受容器中,若有,则用洗耳球将剩余液体吹入。
注:
当吸取有毒或腐蚀性液体,可选用有安全泡的吸管,并使用吸具(如洗耳球等)操作
移液管规范操作:
使用移液管前,先看移液管上的标记,刻度线位置,检查管头是否损坏。
润洗时,先慢慢吸入移液管长度的1/3左右,将移液管横置,并转动移液管使溶液接触到刻度线以上的部分,进行润洗。
随后将溶液由管下口弃去,并用洗耳球吹去残余液体。
反复润洗三次。
分光光度计使用步骤
一.预热
使用前插上插头。
打开开关,预热20min。
二.选定波长
三.调零:
1.将黑色比色皿和参比液放入培养皿内,并将黑色培养皿拉入光路,按模式键调至T,按0%键将透光率调为0。
2.拉动伸缩杆,将参比液拉入光路,按100%键,将透光率调为100。
3.再按模式键调至A模式,显示屏显示0.00即可。
四.样品测定
将待测样品拉入光路,显示屏上的示数即为光密度值。
保持光路中的样品不变,打开盖子,再将盖子盖上,则再次读出光密度值,重复测量三次,取其平均值,即为该样品的光密度值。
五.实验完毕
清理仪器,将比色皿洗干净,用滤纸吸干,再用擦镜纸顺一个方向擦干,放入盒子内。
最后关闭电源,拔掉插头。
注意事项:
1.预热和不测定时应将暗箱盖打开,以延长光电管寿命
2.测定系列溶液时,应从稀到浓的顺序
3.读数应在0.1-1.0间.
4.注意调零校准。
5.注意若分光计示数不稳定,立即检查比色皿是否干净,波长是否为660nm。
使用比色皿注意事项:
1.比色皿应轻拿轻放,以免打碎,拿比色皿时,应拿比色皿的毛玻璃面;
2.使用同一规格的两个比色皿;
3.装样时,要润洗2-3次,测定时样品装液高度在比色皿3/4处,比色皿外液体要用吸水纸吸干并用檫镜纸顺一个方向擦拭干净;
4.润洗前先用蒸馏水灌洗3次,润洗(注意润洗时节约使用样品);
5.润洗后加液,加液后用擦镜纸的光滑面擦干光学面,毛玻璃面也不要有液体,最后对着光观察,光学面污渍无纸纤维,毛玻璃面无水渍即合格;
6.清洗比色皿时,一般先用水冲洗,再用蒸馏水洗净。
每次做完实验时,应立即洗净比色皿;
7.清洗完毕后用擦镜纸沿一个方向将其擦干净,光学面朝上放于比色皿盒中
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- 反应 动力学 实验 教案
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