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阿司匹林对大鼠脊髓损伤细胞凋亡的爱惜作用
阿司匹林对大鼠脊髓损伤细胞凋亡的爱惜作用
王景,夏亚一,李延宏,潘文杰,赵斌
【摘要】目的观看阿司匹林对大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡及神经功能恢复的阻碍。
方式选择65只体重为220~250g的Wistar大鼠(雌雄不限),于T10部位置入后路渐进式压迫装置,制作成慢性压迫性脊髓损伤模型。
随机分为阿司匹林医治组(A组,30只)、生理盐水对照组(B组,30只)和假手术组(C组,5只)。
应用原位结尾脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记技术,别离于慢性压迫性脊髓损伤后一、3、7、14、28d做行为学评判,并取材对脊髓损伤区进行细胞凋亡检测。
结果A、B组均发觉细胞凋亡,A组与B组细胞凋亡率相较不同有显著性(P<,A组与B组行为学评判相较不同有显著性(P<,神经细胞凋亡情形与运动功能改变具有相关性。
结论阿司匹林对慢性脊髓压迫损伤后所致使的神经细胞凋亡产生抑制作用。
【关键词】阿司匹林;慢性压迫;脊髓损伤;神经爱惜;细胞凋亡
NeuroprotectionEffectofAspirinonNeuronApoptosisFollowingChronicSpinalCordCompressiveInjuryinRats
Abstract:
ObjectiveThisstudyevaluatedtheneuroprotectioneffectofaspirinonneuronapoptosisfollowingchronicspinalcordcompressiveinjuryinThechronicspinalcordcompressionmodelmadeof65Wistarmice(Weight220~250g)wereassignedintothefollowing4groupsmiceintotheaspirintherapygroup(GroupA),30miceintothenormalsodium(NS)controlgroup(GroupB)and5miceintotheshamoperationgroup(GroupC).Appliedthelocomotor′sfunctionscaleandtheTUNELimmunohistochemistrytechniquelabeledofthespinalcordinjuringprofileson1st、3rd、7th、14th、28thdaysofpostoperationGroupAreducedtheneuronapoptosis,theApoptosisIndex(AI)andtheresultsoflocomotor′sfunctionscalecomparewithGroupB,thosethathassignificantdifference(P<.Thereisahighrelativitybetweentheneuronapoptosisandlocomotor′sTheseresultssuggestthattheprotectiveeffectsofaspirinagainstneuronapoptosisfollowingchronicspinalcordcompressiveinjury.
Keywords:
aspirin;chroniccompression;spinalcordinjury;neuralprotection;apoptosis
慢性脊髓压迫性疾病由于椎管内存在占位性病变,脊髓受到持续、渐进性的压迫,神经、运动系统损害程度慢慢加重。
研究说明,其要紧病理机制在于脊髓受损神经细胞凋亡,引发一系列继发性病理损伤和临床病症。
本实验研究采纳后路渐进慢性压迫性脊髓损伤的动物模型,给予阿司匹林干与,于慢性压迫性脊髓损伤后不同时刻点采纳原位结尾脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记法(terminaldeoxynucheotidetransferasemediateddeoxyuridinebiotinnickendlabeling,TUNEL),观看阿司匹林对慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡的阻碍。
1材料和方式
慢性压迫性脊髓损伤动物模型的制作65只体重220~250g的健康Wistar大鼠(雌雄不限,兰州军区兰州总医院实验动物中心提供),2%的戊巴比妥(40mg/kg)腹腔内注射麻醉。
常规消毒铺巾,取后正中切口,切除T10棘突,以平头钻行椎板钻孔,暴露硬膜。
用直径3mm、螺距mm、经高压蒸汽灭菌的不锈钢平头螺钉旋入T10椎板,螺钉头端呈水平面。
第一次旋入时螺钉头面仅与硬脊膜接触,以旋入进程中大鼠后肢不显现跳动,挤捏大鼠尾根部可引出反映,且植入螺钉牢固为度,证明未造成脊髓损伤。
以后每隔5d显露螺钉,将螺钉旋入1/2圈约mm,造成大鼠脊髓渐进性压迫性损伤,于造模后第一、3、7、14、28d取材观看。
试剂配置阿司匹林g加入50mL双次蒸馏水,配成浓度为20mmol/L的悬浮液,现用现配。
动物分组将上述65只大鼠随机分组:
慢性脊髓压迫阿司匹林医治组(A组,30只),慢性脊髓压迫生理盐水对照组(B组,30只),假手术组(C组,5只,仅行椎板钻孔术)。
模型制作完成10min后,A组腹腔注射阿司匹林(30mg/kg),尔后每隔5d同途径同剂量再次注射;B组腹腔注射等量的生理盐水。
A、B组别离于压迫进程中第一、3、7、14、28天取材,每组每一个时刻点6只动物。
行为学检查慢性压迫性脊髓损伤后一、3、7、14、28d对动物进行行为学检查,采纳改良的Tarlov评分[1]和斜板实验[2]。
病理标本制备别离于不同时刻点取材[3],采纳TUNEL观看各组细胞凋亡率。
TUNEL检测凋亡试剂盒为武汉博士德产品,严格依照产品说明书步骤操作。
图像分析各组各时刻点随机计数6张切片(损伤段、损伤上段、损伤下段各2张),经运算机图像分析系统处置,别离测出每张切片凋亡细胞指数(AI)及每mm2阳性细胞数。
结果判定以细胞核中显现棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞。
采纳高清楚度彩色病理图像分析系统,进行图像半定量分析。
应用凋亡细胞核数估量凋亡细胞,依照以下公式计算:
AI=凋亡细胞核数/总细胞核数。
统计学分析所有数据行多样本均数单因素方差分析或两样本均数的t查验,以±s表示,以α=为查验水准进行双侧查验。
利用SPSS统计软件进行统计分析。
2结果
行为学检查采纳改良的Tarlov评分和斜板实验检测结果显示,慢性压迫性脊髓损伤后60只大鼠均显现不同程度后肢瘫痪,排尿障碍。
A组运动功能恢复良好,尿潴留有所减缓,与B组比较不同有显著性不同(P<(见表1)。
表1大鼠慢性压迫性脊髓损伤Tarlov评分和斜板实验结果
各组细胞凋亡指数及凋亡率通过对组织染色切片的图像分析和统计学查验,A组的细胞凋亡指数和凋亡率均小于B组(P<(见表2~3)。
表2大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡指数结果
病理学检查光镜下观看B组切片,可见神经元细胞水肿,丧失典型的多极形态。
胞核偏位,尼氏小体丧失,噬神经元现象明显。
轴突纤维排列结构紊乱,髓鞘脱失,星形胶质细胞和少突胶质细胞增生,有卫星现象。
部份神经元细胞缩小呈三角形,胞核浓缩深染,呈缺血性改变,亦可见明显灶性表3大鼠慢性压迫性脊髓损伤后神经细胞凋亡率结果
出血坏死区及炎性细胞浸润。
A组切片可见脊髓灰质轻度水肿,神经元肿胀减轻,有少量胶质细胞和星形胶质细胞增生,白质胶质细胞增生明显,可见病理改变较B组有所减轻(见图1~4)。
3讨论
本研究发此刻大鼠慢性脊髓压迫损伤模型中,阿司匹林组的神经细胞凋亡率低于空白对照组(P<,提示阿司匹林对大鼠慢性脊髓压迫损伤后神经细胞凋亡有爱惜作用。
图1慢性压迫性脊髓损伤后7d阿司匹林医治组脊髓组近来研究以为,阿司匹林可通过对环氧化酶2(Cyclooxygenases,COX2)的作用、抑制核因子κB(NFκB)激活、对蛋白激酶Cζ(proteinkinaseCζ,PKCζ)的作用、调控NOS表达等途径抑制神经细胞凋亡,发挥神经爱惜作用。
已知COX要紧有COX一、COX2两种表型,在脊髓神经元中COX2的表达占绝对优势[4],且COX2表达峰值与谷氨酸浓度呈正相关图4慢性压迫性脊髓损伤后28d阿司匹林医治组脊髓组性[5]。
COX2的过度表达亦可使大鼠中枢神经的兴奋性氨基酸神经兴奋毒性增强[6]。
提示COX2表达与脊髓压迫的损伤因素紧密相关,是兴奋性氨基酸的神经毒性和一氧化氮和NMDA介导的神经细胞死亡中的一个重要环节。
阿司匹林通过对脊髓中丰硕表达的COX2的抑制,可完全抑制谷氨酸对神经细胞的毒性损伤,减轻NMDA介导的神经毒性。
同时抑制脊髓前列腺素合成,减少细胞黏附和细胞膜的粘性,减轻脊髓炎性反映。
NFκB能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强κB序列特异结合,普遍存在于各类细胞中,在细胞受到损伤因素刺激后可被活化,增强多种炎症介质的转录。
阿司匹林可特异性抑制ATP与IκKβ的结合,阻滞胞浆核因子κB复合物中IκB的磷酸化,阻止蛋白酶对IκB的降解,使NFκB的信号通路受阻,对抗谷氨酸神经兴奋毒性来爱惜神经元[7,8],并减轻脊髓受损段的炎性反映。
另外阿司匹林还可爱惜在磷脂酰肌醇代谢中起重要作用的PKCζ免于NMDA诱导活化,并抑止PKCζ的蛋白激酶活性,避免其发生转位并启动神经细胞凋亡途径,引发神经退行性变[9,10]。
另外,脊髓损伤时产生过量的NO,通过超氧自由基的细胞毒性作用,造成细胞蛋白质、核酸和脂质膜损伤,并激活COX2[11]。
同时,受TNFα介导的星形胶质细胞释放大量谷氨酸,使NMDA受体依托性的钙通道开放,引发Ca2+内流,激活NOS生成NO,继而激活鸟苷酸环化酶,升高cGMP水平,促使细胞凋亡[12,13]。
阿司匹林可通过抑制中枢和外周神经细胞的iNOS,减少NO生成,并直接清除NO[14,15],抑制关联损伤因子的释放发挥神经细胞的抗凋亡作用。
另外,阿司匹林还可延缓神经细胞低氧状态下胞外ATP的减少,恢复ATP水平,抑制谷氨酸释放[16]。
有研究报导[17],对大鼠大脑中动脉梗死模型一次性给予阿司匹林,8d后处死,与空白组对照有明显神经爱惜作用。
在MPTP诱导的Parkinson′s疾病模型中[18],以50mg/kg阿司匹林预处置的大鼠7d后取材观看,发觉阿司匹林可明显减缓多巴胺的减少。
提示一次性给予大剂量阿司匹林其最大神经爱惜效能在体内可至少持续7d以上。
在大鼠慢性脊髓压迫模型中给予大剂量甲基强的松龙,第14、28天与空白组对照神经元凋亡情形均有显著性不同[3]。
以上研究提示在大鼠脊髓压迫损伤中抑制神经元凋亡的干与具有非剂量相关的长时效性。
本实验采纳术后中断性大剂量给药方式,不同时刻点神经元凋亡结果对照具有显著性不同,可能是慢性脊髓压迫性损伤后,神经元的抗凋亡途径和内源性爱惜机制存在相关医治干与的长效应靶点,使阿司匹林不需完全依托体内药物代谢动力而发挥神经细胞的抗凋亡作用。
但具体的效应机制仍需咱们进一步探讨。
综上所述,在慢性脊髓压迫损伤后给予阿司匹林,能够减少神经元凋亡,减缓相应病症,对此类疾病医治有踊跃作用。
其抑制神经元凋亡的机制和分子水平途径有待咱们进一步研究。
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