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SRB的筛选
一株硫酸盐还原菌的分离筛选及生理特性的初探
学生指导老师乐以成
摘要:
硫酸盐还原菌利用其它细菌的代谢终产物作为自己的能源而生长,其本身又是还原活动的参与者。
而硫酸盐有机废水生物处理技术一直是人们关注的热点,这种废水处理的关键是如何在有效去除COD的同时,高效的去除SO42-。
硫酸盐还原菌在一定的条件下可以有效的将SO42-还原从而从废水中去除,并在该过程中起主要作用。
为了更深入的研究其过程机理,比较好的做法是把在那种在数量上占优势,并且起主要功能的种群分离出来,对它们进行单独研究。
本文利用厌氧装置和滚管技术,于广东化工集团硫酸厂废水污泥中分离和筛选了一株硫酸盐还原菌,命名为SRB6。
并对其生理生化指标进行了测定。
菌体为短杆状或弧状,0.5—0.6μm,革兰氏染色阴性,不产芽孢。
有Fe2+时菌落为黑色,直径为2mm,无Fe2+时固体培养基上的菌落为灰白色,直径1.5mm。
利用乳酸盐作为最佳碳源。
最适生长盐浓度为0.5%(W/V),最适生长温度为35℃,最适pH值为7.0。
根据形态和生理生化特征,该菌为脱硫弧菌属。
但与该属已报道的硫酸盐还原菌在碳源利用、最适生长温度、最适盐浓度及其它一些生理特征方面均有不同。
关键词:
硫酸盐还原菌、厌氧培养、Hungate试管
ISOLATIONANDPHYSIOLOGYOFASULFATE-REDUCINGBACTERIUM
StudentTeacher
Abstract:
Sulfate-reducingbacteriausethefinalproductionofotherbacteriaastheenergysource,anditalsoparticipateinthereducingaction.Thebiologicaltreatingtechnologyisalwaysthefocusofresearchersintheworld.ThekeyofthistechnologyistoremoveCODandSO42-simultaneouslyandeffectively.Sulfate–reducingbacteriacanreduceSO42-toH2SastortemoveSO42-.Tostudyphysiologicalmechanismindepth,weisolatingmainfunctionalgroup,SRBcansimplifythisresearch.PreponderantpopulationofSRBwereisolated.UsinganaerobicsetandHungatetubetechnic,asulfate-reducingbacteriawasisolatedfromthewastewaterofChemicalIndustryCorporationVitriolFactory.Andwemensurateitsphysiologyguide.Thestrainisgramnegativeandnotsporeforming.Itsshortrodorarc,andsinglecellisabout0.5—0.6μmwideand1.7—2.0μmlong.ColoniesfromrolltubeswithoutFe2+aregreywhiteandabout1.5mmindiameter.Whenmediacontain,Fe2+thecoloniesareblackandabout2mmindiameter.Itutilizelactateascarbonsource.Foritsgrowth,theoptimumNaClconcentrationrangeis0.5%(W/V),temperate36℃andpH7.0.ThestrainbelongstoDesulfovibrioanddifferfromthepreviouslydescribesulfate-reducingbacteriainitsoptimumgrowthtemperate,carbonsourceandothercharacters.
Keyword:
SulfateReducingBacteria,anaerobicculture,Hungatetube
引言
硫酸盐还原菌(SulfateReducingBacteria,简称为SRB)是一些能够把SO42-还原成S2-而自身获得能量的各种细菌的统称,其利用硫酸盐取代好氧生物所用的氧为呼吸的氧化剂。
它最基本的特征就是其生命活动需要硫酸盐,除了少量用于组成细胞成分,主要是用于在厌氧氧化有机物质时作为最终电子受体,所以SRB在自然界中的硫循环中起着不可缺少的作用。
因为各类硫酸盐还原菌分布于不同的生态环境之中,故它们的生长温度范围、生长盐浓度范围、生长pH范围等各项生长指数的差异都很大。
大部分硫酸盐还原菌嗜中温,中度嗜盐,在偏碱性的环境中生长。
硫酸盐还原菌的形态和营养也是十分多样化,其常见的形态有杆状,短杆状,椭圆或长丝状。
而SRB各属所能利用的碳源、硫源以及它的生长条件更是不尽相同。
大部分硫酸盐还原菌能利用C3和C4脂肪酸、挥发性脂肪酸以及醇类如乳酸盐,丙酸盐,乙酸盐,甲酸盐,乙醇等作为碳源和电子供体,而在厌氧条件下,SRB同化这些有机物时可以以硫酸盐,亚硫酸盐或其它含硫化合物作为电子受体,将其还原为H2S。
铵盐则是大多SRB生长所需的氮源。
根据前人的研究,SRB的代谢活动分为三个阶段。
第一阶段是有机物碳源的降解,发生在厌氧状态下,同时通过“基质水平磷酸化”产生少量的ATP;第二阶段中,前一阶段释放的高能电子通过SRB中特有的电子传递链(如黄素蛋白、细胞色素C等)逐级传递,产生大量的ATP。
在最后阶段中,电子被传递给氧化态的硫元素,并将其还原为S2-,此时需要消耗ATP提供能量。
从这一过程可以看出,有机物不仅是SRB的碳源和电子供体,也是其能源,硫酸盐(或氧化态的硫元素)仅作为最终电子受体起作用。
硫酸盐还原菌对环境有较强的适应能力,因而具有与环境相适应的特殊结构,机能和遗传基因。
了解其其细胞结构、遗传特性以及其适应极端环境的生物化学机制,可以丰富对这一生命现象本质的认识,为生物进化,微生物分类等研究积累数据,又可望发掘新的微生物资源,而且其特殊的基因为创造新的物种提供了可能。
另外,SRB虽然会引起环境污染,但SRB还有其较高的经济价值,即在污水处理中及在生物学和生态学中的所显示出的独特作用。
因此,要全面地认识SRB,才能利用它在自然界和国民经济中的作用为我们造福。
我们从广东化工集团硫酸厂的废水污泥中分离了一株硫酸盐还原菌,测定其形态、大小、各项生理生化指标以及它对碳源和硫源的利用情况等,为进一步研究其功能打下了基础。
1.材料和方法
1.1实验材料
1.1.1采集土样
2007年8月3日于广东化工集团硫酸厂采集废水污泥。
1.1.2培养基(1000mL)
SRB(LS)培养基配方(配方参考农业部沼气所厌氧微生物重点开放实验室)
NaCl2gNH4Cl1g
K2HPO40.5gNa2SO40.5g
MgSO4·7H2O2gCaCl20.1g
FeSO4(NH4)(SO4)2·6H2O0.5g70%乳酸5mL
酵母膏1gpH7.0
固体培养基则加1%到2%的琼脂。
1.2药品和试剂
无菌水,NaCl,NH4Cl,K2HPO4,CaCl2,MgSO4·7H2O,70%乳酸,酵母膏,琼脂,Na2SO4,FeSO4(NH4)(SO4)2·6H2O;
甲酸钠,乙酸钠,丙酸钠,乙醇,葡萄糖;
Na2SO3、Na2S2O3,硫磺;
结晶紫染液,碘液,95%乙醇,番红染液,孔雀绿染液。
1.3实验器材
组培罐,富集培养瓶,恒温培养箱,分液器,恒温水浴锅,血浆瓶,厌氧装置,滚管机,Hungate试管,无菌注射器(2.5mL),酒精灯,毛细管,分光光度计(721型),pH试纸,PbAc试纸,荧光光学显微镜,显微镜测微尺。
1.4实验方法
1.4.1筛菌
SRB的富集培养
⑴.以1g:
10mL的比例用无菌水稀释土样。
⑵.以1:
10的比例量取20mL土样悬液,接入到200mL富集培养基中,34℃培养。
⑶.7d后培养基变黑,产气泡,说明SRB已大量生长。
培养基的分装
⑴.培养基按如上配方配好后,调pH至7.0,并置于电炉上煮开,目的为尽可能的制造厌氧环境。
⑵.对分液器的标定刻度进行校准。
⑶.校准后将分液器固定于三角瓶上,并持续通入氮气,以达到厌氧环境。
⑷.于待分装的试管中也通入氮气,20s后装入4.5mL培养基,并迅速盖上塞子。
⑸.121℃高压灭菌30min。
注:
因为该培养基中不含葡萄糖等糖类,如培养基中含糖,则在115℃下灭菌30min。
Hungate滚管
该技术利用除氧铜柱来制备高纯氮,并用高纯氮驱除小环境中的空气,使培养基的配制、分装、灭菌和贮存,以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下,从而保证了这类严格厌氧菌的存活。
在进行严格厌氧菌的分离时,可用Hungate的“无氧操作”把菌液稀释,并接种到融化后的固体培养基中,然后将此试管(如图1)用丁基橡胶塞严密塞住后平放,置冰浴中均匀滚动,使含菌培养基布满在试管的内表面上,犹如好氧菌在培养皿平板表面一样,最后长出许多单菌落。
注:
滚管技术的优点是:
①试管口与空气接触面积小;②经滚动后,试管的内表面上有大面积的固体培养基可供长出单菌落。
图1.用于滚管技术中Hungate的试管剖面图
步骤:
⑴.将装在亨格特试管中的固体培养基在沸水浴中熔化,同时将恒温水浴锅的温度调至55℃(温度值参考农业部沼气所厌氧微生物重点开放实验室),既保证接入的菌不会由于培养基温度过高而致死,也保证培养基不会因为温度过低而迅速冷凝。
⑵.将熔化后的固体培养基迅速转移至水浴锅中,水浴保温15-20min。
⑶.用酒精棉球对每一试管的管帽和血浆瓶的瓶帽进行消毒。
⑷.用2.5mL的无菌注射器从富集培养液中抽取0.5mL菌液(注意需赶出气泡)加入第1支试管,混匀后另取1支新的注射器,从第1支试管中取出0.5mL加入第2支试管,同时将第1支试管水平放在滚管机上,水平冰浴滚动约20s。
⑸.重复操作⑷,将富集培养液稀释10-1—10-5。
⑹.将滚管后的菌34℃恒温培养7d。
注:
在整个接菌过程中要十分注意避免使固体培养基冷凝。
因而可以在较高的温度下(用沸水浴)将培养基煮开足够长的时间(30min);而每次取用固体培养基接菌时一定要先将管口在水浴锅中预热一下,避免转移后由于管口温度下降而导致的培养基在管口冷凝;滚管前无菌针要进行高温干燥,否则菌液将无法吸入针管或刚吸入针管就已凝固;而且用无菌针接菌时速度一定要快,但是将菌液注射进试管时动作要尽量轻缓,避免产生气泡。
毛细管的制备
⑴.准备好直径约5到6mm,长约20cm的玻璃管。
⑵.点燃酒精喷灯,调节火焰颜色至兰色。
⑶.双手持玻璃管的两端,将玻璃管的中部置于火焰上方,当烧到玻璃较软的时候,离开火焰,以均匀的力量向两头拉伸。
⑷.冷却后从中间用剪刀剪断毛细管。
⑸.121℃高压灭菌30min。
单菌落的挑取
⑴.对滚管培养后的试管进行观察,由于SRB代谢过程中将硫酸盐还原为S2-,S2-与铁盐反应生成黑色的FeS,使菌落变黑。
注:
试管由于会产生一些冷凝水,因此只能竖着拿,以避免冷凝水流过菌落,造成污染。
⑵.挑选距离管口较近,比较分散,并且尽可能的大的菌落,用记号笔在试管外对应处做一记号。
⑶.将有要挑取菌落的试管倾斜固定于铁架台上,管口略高于管底,管口下方适当位置点一盏酒精灯,并且管口始终通氮气。
⑷.根据所挑菌落在试管中的位置判断毛细管的长度,在酒精灯上烧弯,用镊子将多余部分夹掉,并形成一弯钩,注意弯钩的断面要尽量的平。
⑸.与此同时,准备接菌的液体培养基中也要通入氮气,预先把其塞子拔松,以便接菌。
⑹.将毛细管缓缓伸入试管内,注意不要碰到其它菌落。
刮下要挑取的菌落,小心退出,然后迅速伸入液体培养基管口内,用塞子将毛细管折断,塞紧塞子,完成一次挑取。
⑺.将接好的菌34℃恒温培养。
细菌的纯化
重复,因为挑菌前需要滚管培养,而每进行一次挑菌就会使菌落的形态大小更趋于一致,所以可对菌落进行纯化挑选,使分离的菌尽可能的纯。
最后分离得到分离菌SRB6。
镜检
在100倍油镜下观察菌体。
1.4.2分离菌SRB6的鉴定
形态观察
⑴.取一环分离菌SRB6菌液于载玻片上,盖上盖玻片,小心不要产生气泡。
⑵.置于显微镜下,先40倍观察,找到适当的视野。
⑶.在100倍油镜下观察菌体形态及运动方式。
测定菌体大小
⑴.取出接目镜,把目镜上的透镜旋下,将目镜测微尺刻度朝下放在目镜筒内的隔板上,然后旋上目镜透镜,再将目镜插入镜筒内。
⑵.将镜台测微尺刻度朝上放在显微镜载物台上。
⑶.将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央,调节焦距,当清晰地看到镜台测微尺的刻度后,转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行,利用移动器移动镜台测微尺,使两尺在某一区域内两线完全重合,然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
⑷.由于已知镜台测微尺每格长10µm,根据以下公式可计算出在一定放大倍数下,目镜测微尺每格所代表的长度。
公式:
目镜测微尺每格长度(µm)=两重合线间镜台测微尺格数×10/两重合线间目镜测微尺格数
⑸.目镜测微尺校正完毕后,取下镜台测微尺,换上细菌制片,油镜下测定菌的宽度和长度。
测定时通过转动目镜测微尺和移动载玻片,测出细菌直径或宽和长所占的目镜测微尺的格数。
最后将所测得的格数乘以目镜测微尺每格所代表的长度,即为该菌的实际大小。
革兰氏染色
⑴.取分离菌SRB6的培养物常规涂片、干燥、固定。
⑵.滴加结晶紫进行初染,量以刚好覆盖菌膜为宜,染色1到2min,水洗。
⑶.用碘液冲去残水,并用碘液覆盖媒染约1min,水洗。
⑷.用滤纸吸去玻片上是残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗。
⑸.用番红液复染约2min,水洗。
⑹.干燥后,油镜下观察,镜检。
芽孢染色
⑴.取分离菌SRB6按常规涂片、干燥、固定。
⑵.加数滴孔雀绿染液于涂片上进行染色,用木夹夹住载玻片一端,在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时,维持5min。
⑶.待玻片冷却后,用缓流自来水冲洗,直至流出来的水无色为止。
⑷.用番红染液复染2min。
⑸.用缓水流洗后,吸干。
⑹.干燥后油镜观察。
1.4.3分离菌SRB6的生理生化特征
SRB生长曲线
将一定量的菌接种到均匀新鲜的液体培养基中,在适宜的条件下培养细胞要经过延迟期、对数期、稳定期和消亡期四个阶段。
以培养时间为横坐标,以细菌数目的对数或生长速率为为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线,可以反映细菌在整个培养时间里菌数变化规律的曲线。
测定细菌的生长曲线,了解其生长繁殖规律,这对人们根据不同的需要,有效的利用和控制细菌的生长有重要的意义。
步骤:
⑴.取24支无菌试管,用记号笔分别标明培养时间,即0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92h。
⑵.用2.5mL无菌注射液吸取SRB6富集培养液逐次接入上述做好标记的试管中。
⑶.将已接菌的试管34℃恒温培养,分别培养0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92h,将标有相应时间的试管取出,立即放入冰箱储存,最后一同比浊测定其光密度值。
⑷.未接种的液体培养基做空白对照,选用625nm波长进行光电比浊测定。
(测定OD值之前,将待测定的培养液振荡,使细胞均匀分布)
⑸.以时间为横坐标,以测得的OD值为纵坐标,做一曲线,即为生长曲线。
pH对SRB生长的影响
为了找到分离菌SRB6的最适生长pH值,对接菌的液体培养基做不同的pH梯度,即pH梯度为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5。
生长72h,在625nm测OD值。
根据OD值以及其产气情况可以判定该菌的最适pH值。
为更好的判断,同时做加Fe2+和不加Fe2+的对照实验。
步骤:
⑴.分装11支液体培养基,分别调节其pH值为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0和9.5,其余培养条件都相同。
⑵.在上述培养基中接入分离菌SRB6后34℃恒温培养。
⑶.在72h之后取出测OD值并用PbAc试纸观测产气情况。
温度对SRB生长的影响
对接菌的液体培养基做不同的温度梯度,即温度梯度为25℃、35℃、45℃和55℃,可以较好找到分离菌SRB6的最适生长温度值。
将接入的菌培养72h,在625nm测OD值,根据OD值及产气情况判断该菌的最适温度。
同时做加Fe2+和不加Fe2+的对照实验。
步骤:
⑴.分装4支液体培养基,分别调节其温度为25℃、35℃、45℃和55℃,其余培养条件都相同。
⑵.在上述培养基中接入分离菌接入SRB6后34℃恒温培养。
⑶.在72h之后取出测OD值并用PbAc试纸观测产气情况。
盐浓度对SRB生长的影响
为了找到分离菌SRB6的最适生长盐浓度值,对接菌的液体培养基设置不同的盐浓度梯度,即梯度为0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%和5%。
生长72h,在625nm测OD值。
根据OD值及产气情况得到最适的生长盐浓度。
同时做加Fe2+和不加Fe2+的对照实验。
步骤:
⑴.分装7支液体培养基,分别提调节其盐浓度为0.2%、0.5%、1%、2%、3%、4%和5%,其余培养条件都相同。
⑵.在上述培养基中接入分离菌接入SRB6后34℃恒温培养。
⑶.在72h之后取出测OD值并用PbAc试纸观测产气情况。
Fe2+对SRB生长的影响
根据上述在不同的pH值、温度和盐浓度的条件下,含Fe2+时和不含Fe2+时SRB的生长情况,可以看出Fe2+对SRB生长的影响。
SRB对各硫源的利用情况
在培养基中分别加Na2SO4、Na2SO3、Na2S2O3及硫磺等不同的硫源,接入分离菌SRB6进行培养,72h后观察菌液是否变黑及其产气情况,便可判定该SRB是否能利用该硫源和其最佳硫源。
步骤如下:
分装四支液体培养基,于其中分别加入Na2SO4、Na2SO3、Na2S2O3及硫磺等不同的硫源,其余培养条件都相同。
于其中接入分离菌SRB6后34℃恒温培养。
72h之后取出观察菌液是否变黑。
并用PbAc试纸判断其产气情况。
SRB对各碳源的利用情况
在培养基中分别加乳酸、葡萄糖、乙醇、甲酸钠、乙酸钠和丙酸钠等不同的碳源,接入SRB进行培养,72h后观察菌液是否变黑及其产气情况,便可判定该SRB是否能利用该碳源和其最佳碳源。
步骤如下:
分装六支液体培养基,于其中分别加入乳酸、葡萄糖、乙醇、甲酸钠、乙酸钠和丙酸钠等不同的碳源,每种碳源都都相应的有(+Fe2+,+SO42-)和(-Fe2+,+SO42-)的两种组合进行比较。
且每个组合都做3次重复试验。
其余培养条件都相同。
接入SRB后34℃恒温培养。
72h之后取出观察菌液是否变黑。
并用PbAc试纸判断其产气情况。
2.结果与分析
2.1菌落形态与特征
滚管之后,在管壁的培养基上形成分布较稀松、形态特征一致的单个菌落。
由于培养基中加入了Fe(NH4)2SO4•6H2O,而硫酸钠的还原产物H2S能够和Fe(NH4)2SO4•6H2O发生反应,生成黑色沉淀FeS,从而菌落为黑色,直径约2mm,菌落边缘不整齐,表面较粗糙。
当培养基中不含Fe2+盐时,菌落为灰白色,直径约1.5mm。
2.2分离菌SRB6个体形态与特征
细菌呈杆状或弧状(图2),大小为0.5—0.6×1.7—2.0μm,革兰氏染色呈阴性,芽孢染色阴性,在荧光光学显微镜下观察到,细菌做波浪式运动或翻转运动,且整个运动过程中,尾部不停的摆动。
图2分离菌SRTB6的细胞形态
2.3分离菌SRB6的生长曲线
通过96h连续不间断的观察测试,得到了如下生长曲线图(图3),发现分离菌SRB6在前16h里生长比较缓慢,处于生长延迟期,从20h开始到60h,是它的对数生长期,68—96h是生长稳定期。
2.4pH对分离菌SRB6的生长影响
对分离菌SRB6在4.0到9.5的pH范围内生长曲线并且用PbAc试纸检测H2S的产生后,得到了如下结果(图4)。
排除掉两端受误差影响的数据,在pH6.0—8.0的范围内,分离菌SRB6的最大OD值出现在pH7.0。
并且加了铁盐的分离菌SRB6的OD值要比没加铁盐的高出100个百分点。
当PH小于5或大于8.5时,分离菌SRB6的生长量明显下降,在pH为4.0或9.0时,分离菌SRB6已经无法生长,PbAc试纸没有检测到H2S的产生。
综合所得到的实验结果,可以确定分离菌SRB6能够适应较宽的pH范围(5.0—8.5),最适生长PH在7.0—7.5之间,这与之前报道的结论是一致的。
2.5温度对分离菌SRB6生长的影响
绘制分离菌SRB6在25℃到55℃的温度范围内的生长曲线并且用PbAc试纸检测H2S的产生后,得到了如下结果(图5)。
发现在不加铁盐的情况下,分离菌SRB6的最适生长温度是36℃,OD值0.293。
45℃后,OD值迅速下降。
当培养基中加入铁盐后,分离菌SRB6的生长量迅速增大,从0.293上升到最高时的0.742,增幅高达153%。
在55℃时,无论加Fe2+还是不加Fe2+,都没有H2S被检测到,细菌都处于致死状态。
2.6盐浓度对分离菌SRB6生长的影响
许多有关微生物的实验都已经证实,过高的Na+浓度会对细菌的生长产生盐胁迫,导致细胞脱水,从而致死。
我们在0.2%—5%的Na+浓度范围内,对分离菌SRB6的生长量进行了测定,绘制了生长曲线,得到如下结果(图6)。
可以看到,Na+浓度与分离菌SRB6的生长量基本上呈负相关的关系。
在Na+浓度达到2%时,只有在加入铁盐的培养基里,检测到了H2S的产生,一旦Na+浓度超过3%,无论是加Fe2+还是不加Fe2+,都没有检测到H2S的产生,这说明分离菌SRB6已不能耐受如此高的盐浓度。
分离菌SRB6最适的生长盐浓度在小于1%的范围内。
2.7Fe2+对分离菌SRB6生长的作用
在图4、图5、图6中,培养基中加入Fe2+的分离菌SRB6的生长状况明显好于没有加Fe2+的。
这说明Fe2+对于分离菌SRB6的生长有刺激促进的作用。
在温度、盐浓度、pH三种不同因素对分
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