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微生物验证
方法验证
湖州药检所王新财
一、微生物检查方法的验证
1、细菌霉菌及酵母菌计数方法的验证
1.1验证的目的:
确保试验方法的完整,保证检验结果的可靠。
1.2何时需要验证:
a建立微生物检查方法时。
b、药品的组分或原检验条件发生改变时。
1.3验证菌种
(1)大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102];
(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003];
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501];
(4)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001];
(5)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003];
该5种菌株具有普遍的代表性,5种菌分别代表不同的微生物类别,
(1)
(2)(3)属细菌,(4)真菌,(5)霉菌。
验证所用的标准菌种的传代数不得过5代。
省所
提供的是第2代,我所提供的是第3代。
1.4菌液制备
1.4.1制备
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中,32.5±25C培养18~24小时;白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,25.5±2.5C培养24~48小时;上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液逐级稀释制成50-100cfu/ml的菌悬液。
黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁培养基斜面上,25.5±.5C培养5~7天,使大量抱子成熟,加入3-5ml0.9%无菌氯化钠溶液,将抱子洗脱,无菌纱布或薄棉滤过,逐级稀释至50~100cfu/ml的菌悬液。
1.4.2注意点
a菌悬液配制的稀释过程中,每一级稀释液混合震荡必须非常充分。
b、由于菌种为具有特殊活性的生物,菌种的状态、接种量及培养时间对最终菌悬液配制浓度都有较大影响,因此在试验中应严格按照已确定的实验参数(接种量、培养温度、培养时间、培养基的量)。
c、制备好的原菌悬液以当天使用为宜,超过一周应重新计数。
d、自我保护,防止感染。
1.5方法
1.5.1平皿法
对无明显抑菌作用的水溶性制剂,采用该方法进行微生物限度检查法的验证。
方法验证的主要思路:
加菌回收。
⑴试验组:
取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和浓度为50~100cfu/ml的菌液1ml,分别注入平皿中,立即倾注琼脂培养基,每种试验菌制备2个平皿,
培养,计数。
⑵菌液组:
测定所加的试验菌数,即上述菌液1ml注入平皿,倾注琼脂培养
基,每种试验菌制备2个平皿,培养,计数。
⑶供试品对照组:
测定供试品本底菌数,即加上述供试液1ml,倾注琼脂培
养基,培养,计数。
验证试验至少应进行3次独立的平行试验,各菌应逐一进行验证,并分别计算各试验菌每次试验的回收率。
试验组的菌回收率%=
试验组平均菌落数一供试品对照组平均菌落数
X100%
菌液组的平均菌落数
试验组的菌回收率均不低70%确定可以照该供试品制备法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数。
若任一次试验中试验组的菌低于70%应采用其
他方法重新进行验证。
1.5.2培养基稀释法
略带抑菌作用的水溶性制剂(上述常规平皿法试验菌回收率低于70%的),
可采用该方法进行方法验证。
⑴试验组:
a准备25个平皿,分5组,每组5个平皿,分别做好各相应菌种的标记。
b、取试验可能用的最低稀释级供试液各0.2ml,分别注入上述平皿中,即每组加1ml供试液。
c、按标记分别注入浓度为50~100cfu/ml的菌液1ml,立即倾注琼脂培养基,培养,计数,取平均值。
⑵菌液组:
测定所加的试验菌数,同1.5.1⑵。
⑶供试品对照组:
测定供试品本底菌数,即上述供试液1ml,5等分,分别
注入5个平皿中,倾注琼脂培养基,培养,计数。
试验组的菌回收率计算同平皿法。
注:
上述培养基稀释法是将1ml供试液用5倍稀释液来培养,亦可用2倍稀释液、10倍稀释液来培养,即每皿加供试液0.5ml、0.1ml。
1.5.3薄膜过滤法
一般适用于对可溶性抑菌制剂。
主要思路:
滤除抑菌成分,加菌回收。
⑴试验组:
取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,滤过,稀释剂冲洗数次,在最后一次冲洗中加入50~100cfu/ml试验菌1ml,滤过,按薄膜过滤法计数。
⑵菌液组:
测定所加的试验菌数,同1.5.1⑵,无需过滤。
⑶供试品对照组:
取规定量试验可能用的最低稀释级供试液,滤过,稀释剂冲洗数次,按薄膜过滤法计数。
⑷稀释剂对照组:
用相应得稀释液替代供试品,加入1ml上述菌液,滤过,稀释剂冲洗数次,按薄膜过滤法计数。
试验组的菌回收率同1.5.1平皿法。
稀释剂对照组的平均菌落数
X100%
稀释剂对照组菌回收率%=
菌液组的平均菌落数
3次验证试验,各菌的试验组的菌回收率、稀释剂的菌回收率均不低于70%,该方法可行,确定可以照该制备法和计数法测定供试品的细菌、霉菌和酵母菌数。
注意点:
a、供试品的量一般按每张滤膜1g或1ml供试品的加入。
b、稀释剂冲洗次数和冲洗量应根据供试品的性质和实际情况而定,冲洗次数一般不少于3次,总共冲洗量一般不大于1000ml,个人认为少量多次较好。
c、稀释剂对照组考察的是供试液制备和处理过程中微生物受影响的程度,所以所加试验菌应参与整个制备和处理过程。
d、选择适宜的滤膜。
e、所使用的与供试品或稀释剂直接接触的所用用具都应灭菌处理,操作过程防止滤膜被污染。
1.5.4离心沉定集菌法
主要思路:
离心沉定,离心集菌。
试验组:
离心得供试液,加菌,采用适宜方法计数。
菌液组:
测定所加的试验菌数。
供试液组:
离心得供试液,同法计数。
稀释剂对照组:
稀释剂代替供试品,加菌(菌液应参与离心处理),处理过
程同供试液组。
考察各菌的试验组的菌回收率、稀释剂的菌回收率均不低于70%。
1.5.5中和法
主要思路:
制备供试液过程中加入适宜的钝化剂、酶等中和剂,以消除或减小制剂中的抑菌性。
中和剂的量应多次试验而定。
稀释剂对照组考察中和剂本身的抑菌性和处理过程对微生物的影响。
考察各菌的试验组的菌回收率、稀释剂度对照组的菌回收率均不低于70%。
1.6讨论
a供试品需要分散、乳化等特殊处理的均应考察考察处理过程对微生物检出的影响,即均应考察稀释剂对照组的回收率。
b、有时单独一种方法不能消除供试品的回收率,可多法联合使用。
c、验证方法至少应进行3次独立的的平行试验,这是对验证方法本身重复性的考察。
d、验证试验可以与供试品的细菌,霉菌及酵母菌计数同时进行。
e国内外验证用菌株比较如下:
2控制菌的验证
2.1验证的目的同1.1。
何时需要验证同1.2。
2.2验证菌种
⑴大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102];
(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003;
(3)乙型副伤寒沙门菌(Salmonellaparatyphi)[CMCC(B)50094];
(4)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]
(5)生抱梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941];
验证时,依照各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验
证的菌株。
验证大肠菌群检查法时,应采用大肠埃希菌作为验证菌。
2.3菌液制备
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中,生抱梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中,32.5±2.5C培养18~24小时。
用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10~100cfu的菌悬液。
2.4验证方法
⑴试验组:
取规定量供试液(各控制菌检查方法下均有规定)及10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,依相应的控制菌检查法进行检查。
当采用薄膜过滤法时,试验菌液应加在最后一次冲洗液中,冲洗后,取出滤膜接种到增菌培养基中。
⑵阴性菌对照组:
设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌的检查方法的专属性。
方法同试验组,验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照用金黄色葡萄球菌;验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时得阴性对照菌米用大肠埃希菌。
结果判断:
阴性菌对照组不得检出。
若试验组检出试验菌,证明可按此供试液制备方法和控制菌检查法进行控制菌检查。
若试验组未检出试验菌,应消除供试品种的抑菌活性,方法同细菌、霉菌和酵母菌检查方法验证(稀释法、薄膜过滤法、中和剂、沉定法),建立新的方法,重新验证。
2.5讨论:
a、供试液制备用薄膜过滤法时,稀释剂冲洗次数和冲洗量不一定与计数法验证相同,应以试验组检出为准。
b、阴性菌对照组的定义(非阴性对照),意义。
c、验证试验可以与供试品的控制菌检查同时进行。
二、无菌检查法的验证
1、验证的目的:
试验方法的完整和结果可靠性。
验证主要思路:
供试品+试验菌呈阳性。
2、菌种
(1)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003];
(2)铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104;]
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501];
(4)生孢梭菌(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64941]
(5)白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001];
(6)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003];
3、菌液制备
同上,最终逐级稀释至小于100cfu/ml的菌悬液。
4、验证方法
4.1薄膜过滤法试验组:
将规定量的供试品按薄膜过滤法滤过,冲洗,再最后一次冲洗中加入小于100cfu的试验菌,滤过,加培养基培养。
菌液组:
取同体积培养基,加试验菌,培养。
各试验菌同法操作,按规定温度培养3~5天。
结果判断:
试验组、菌液组均生长良好,则按此检查法和检验条件可进行供试品的无菌检查。
如试验组中微生物生长微弱、缓慢或不生长,则供试品的该检验条件下有抑菌作用,处理方法:
1增加冲洗量、冲洗次数或更换冲洗液的种类。
2增加培养基的量。
3添加中和剂或灭活剂。
4更换滤膜品种。
消除抑菌作用,重新验证。
4.2直接接种法
准备:
8管适宜装量的硫乙醇酸盐流体培养基4管适宜装量的改良马丁培养基;无菌接种器具等注:
培养基的装量根据供试品的性状和供试品的装量而定,具体见药典。
整个试验分试验组和菌液组,方法流程如下:
取适量适合的培养基12管
、E一「
分别接入小于100cfu的试验菌,每菌接2管
菌液组试验组
6菌各1管
6菌各1管接入规定量供试品
按规定温度培养3~5天
结果判断:
试验组、菌液组均生长良好,则按此检查法和检验条件可进行供试品的无菌检查。
否则,应消除抑菌作用,重新验证。
若供试品性状允许,应采用薄膜过滤法,除抑菌成分方法同4.1①②③④。
4.3讨论:
a供试品的量照无菌检查法检验量,表2,表3所示。
b、菌液浓度应预先计数或试验同时计数,以确保选择适宜稀释级的菌悬液
c、薄膜过滤法冲洗量和冲洗次数以试验组检出为准,但不宜过大,冲洗的流数不宜过快。
d、方法验证试验可以与供试品的无菌检查同时进行。
e、无菌试验若需要使用表面活性剂、灭菌剂、中和剂等试剂,应证明其有效性且对微生物生长及存活无影响。
微生物限度检查法的验证
一、目的
建立该产品的菌落技术方法,并对其有效性进行评价。
二、供试品
培养基
采用符合中国药典规定的干燥培养基,中国药品生物制品检定所制。
四、菌液的制备
⑴大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102];
(2)金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003];
(3)枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501];
⑷白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001];
(5)黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003];
上述菌种采用药典提供的方法制备菌液。
五、方法及结果
(1)常规平皿法
(1)供试液的制备:
取每批供试品各10g,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml,制成1:
10的供试液。
验证实验的3次平行试验,其试验组分别采用上述3批供试品。
(2)试验组
A、准备10个培养皿,两个做好各相应菌种的记号。
B、取一批供试液1ml注皿,加入1ml稀释至适宜浓度的菌液,立即倾注相应得培养基,平行制备二个平皿,置规定温度培养规定时间,点计菌落数。
(3)菌液组:
按平皿菌落计数法测定加入的5种菌液的实际浓度。
(4)供试品组:
取规定量供试品溶液,按菌落计数方法测定本底菌落数。
(5)稀释剂对照组:
稀释剂100ml,加入对照菌液适量,振摇,分别注入1ml,立即
倾注培养基,每菌作2个平皿,置规定温度培养规定时间,计菌落数。
结果:
试验次数
菌落计数结果
回收率%菌液组(上)
稀释剂对照组(下)
试验组(cfu/皿)
菌液组(cfu/皿)
供试品组
稀释剂对照组(cfu/皿)
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
(7)评价
上述试验结果表明,采用常规方法进行菌落计数,仅黑曲霉的记数结果的
准确的,大肠杆菌有部分抑制,其他三种菌被完全抑制,常规计数法对这四种菌的计数结果是无效的。
针对上述结果,应考虑重新建立菌落计数的方法。
拟采用培养基稀释法。
(2)培养基稀释法
(1)供试液的制备同常规法。
(2)试验组:
a、确定稀释法的接种量:
本次验证实验将1ml供试液分成5等分,即每皿接种
0.2ml
b、准备25个平皿,分成5组,每组5个平皿,分别做好各相应菌种的标记
c、用微量移液器吸取供试液各0.2ml,注入上述平皿中,加入1ml稀释至适宜
浓度的菌液,立即倾注相应的培养基,置规定温度培养规定时间,点计菌落数
(3)菌液组:
按平皿菌落数计数法测定假如地种菌液的实际浓度
(4)供试液对照组:
取规定量供试品溶液,按培养基稀释法测定供试品本底菌数
(5)稀释剂对照组:
稀释剂100ml,加入对照菌液适量,振摇,分别注入1ml,立即
倾注培养基,每菌作二个平皿,置规定温度培养规定时间,点计菌落数。
(6)结果
试验次数
菌落计数结果
回收率%菌液组(上)
稀释剂对照组(下)
试验组(cfu/皿)
[菌液组(cfu/皿)
供试品组
稀释剂对照组(cfu/皿)
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
白色念珠菌
黑曲霉
(7)评价
上述实验结果证明,采用培养基稀释法进行菌落计数,大肠埃希菌、枯
草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的计数结果是准确的,金黄色葡萄球菌几乎被完全抑制,培养基稀释法对该菌的计数结果是无效的
针对上述结果,应考虑重新建立菌落计数的方法
拟采用离心法和培养基稀释法联用的方法
(3)离心法一一培养基稀释法联用
(1)供试液制备:
同常规方法。
取供试液10ml置离心管内,500rmp离心5min,小心吸取上清液,置另一支离心管内,3000rpm离心30min,弃取上层液,保留离心管底部2ml供试液
(2)试验组:
a.确定稀释法的接种量:
本次验证实验将1ml供试液分成5等分,即每皿接种
0.2ml
b.准备5个平皿做好金黄色葡萄球菌的标记
c.用微量移液器吸取供试液各0.2ml,注入上述平皿中,加入1ml稀释至适宜
浓度的菌液,立即倾注营养琼脂培养基,置规定温度培养规定时间,点计菌
落数
(3)菌液组:
按平皿菌落计数法测定加入的金黄色葡萄球菌菌液的实际浓度
(4)供试品对照组:
取规定量供试平溶液,按离心法一一培养基稀释法联用测定供试品本底菌数
(5)稀释剂对照组:
本品为粉状固体,制备供试液时需采用稀释剂分散,应设置该组。
分别取稀释剂100ml,加入金黄色葡萄球菌对照液适量(一般应加入10的负
5次方稀释级的菌液1ml),按
(1)供试液制备的方法振摇。
用取此液10ml置离心管内,500rmp离心5min,小心吸取上清液,置另一支离心管内,3000rpm离心30min,弃取上层液,保留离心管底部2ml残液。
(5)用微量移液器吸取该稀释剂0.2ml注皿,做5个平皿,立即倾注相应的培养
基,置规定温度培养规定时间,点计菌落数
(6)结果
试验次数
菌落计数结果
回收率
(%)
试验组
菌液组
供试品组
稀释剂对照组
(7)评价
上述实验结果证明,采用离心法一一培养基稀释法联用进行菌落计
数,5种菌均能有效计数
六、结论
针对上述结果,制订的菌数计数方法为:
取供试品10g,加PH7.0无菌氯化钠一蛋白胨缓冲液至100ml,制成1:
10的供试液,取供试液10ml置离心管内,500rmp离心5min,小心吸取上清液,
置另一支离心管内,3000rpm离心30min,弃取上层液,保留离心管底部2ml
供试液。
用微量移液器吸取该稀释剂0.2ml注皿,做5个平皿,立即倾注相应的培养
基,置规定温度培养规定时间,点计菌落数
虎杖苷注射液无菌检查的方法验证
1.样品:
虎杖苷注射液由深圳海王药业有限公司提供,批号20040305。
2.培养基:
无菌检查用硫乙醇酸盐液体培养基,批号040203;改良马丁液体培养基,
批号040302;营养肉汤培养基,批号0403045;营养琼脂培养基,批号040513;0.1%蛋
白胨溶液,批号050217;玫瑰红钠琼脂培养基,批号040202;由中检所所培养基室提供。
3.方法:
中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证
4.验证试验用菌种:
验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌(26003)、铜绿假单胞菌
(10104)、枯草芽孢杆菌(63501)、生孢梭菌(64941)、白色念珠菌(98001)、黑曲霉菌
(98003),来自中国医学细菌保藏中心。
5.菌液制备:
取经34C培养18〜24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌肉汤液
体培养物1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10「5〜10「7约为50〜100cfu/ml备用。
取经24C培养18~24小时的白色念珠菌霉菌液体培养物1ml,加入9ml0.9%氯化钠
溶液中,10倍稀释至10「5约为50〜100cfu/ml备用。
取经34C培养18〜24小时的生孢梭菌硫已醇酸盐液体培养物1ml,加入9ml0.9%
氯化钠溶液中,10倍稀释至10「7备用。
取经培养一周的黑曲霉斜面培养物,加0.9%氯化钠溶液3ml,洗下孢子,转移至另一
空管,标准比浊管比浊后,取1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10「4约为50〜100cfu/ml备用。
6.供试液制备:
取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30ml溶解后,过滤。
7.活菌计数活菌计数结果见表1。
表1活菌计数(cfu/ml)
10「4稀释10「5稀释10「7稀释
121212
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
8方法验证
直接接种法:
取样品12支,分别接种8支硫乙醇酸盐和4支改良马丁液体培养基2
ml/支后,再按要求加入相应的阳性菌液(30-100个/ml),即上述菌液1ml,其中4支硫乙
醇酸盐培养基和2支改良马丁培养基中个加入供试品2ml,置规定温度培养3-5天,逐日
观察结果。
薄膜过滤法:
取样品11支,将样品过滤于封闭式滤器(3联筒/套),用0.1%蛋白胨
氯化钠溶液冲洗500ml后,再分别接入金黄色葡萄球菌、枯草杆菌50~100个/筒即可,同
时平行做稀释剂的对照组。
将稀释剂对照滤筒和污染阳性菌的验证滤筒置37C培养3〜5
d,逐日观察,结果见表1、2、3。
表2虎杖苷注射液无菌检查法验证(直接接种法)试验组
菌株
次数—
管数
培养基
硫乙醇酸盐
霉菌
1
2
3
4
5(d)1
2
3
4
5
金黄色葡萄球菌
1
1
-
-
-
-
-
2
-
-
-
-
-
2
1
-
-
-
-
-
2
-
-
-
-
3
1
-
-
-
-
2
-
-
-
-
白色念株菌
1
1
- 配套讲稿:
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