分子生物学.docx

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分子生物学

分子生物学

第一章绪论

·理解分子生物学的含义、研究对象

分子生物学MolecularBiology是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。

分子生物学发展简史

1.准备和酝酿阶段（19世纪后期到20世纪50年代初）

在这一阶段产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：

•确定了蛋白质是生命的主要物质基础。

（酶）

•确定了生物遗传的物质是DNA。

2.现代分子生物学的建立和发展阶段（50年代初到70年代初）

1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构模型标志着现代分子生物学诞生。

在这期间的主要进展包括：

•遗传信息传递中心法则的建立

•对蛋白质结构与功能的进一步认识（氨基酸、分子量、空间结构）

3.初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段

70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类认识生命本质并能主动改造生命的新时期开始。

其间的重大成就包括：

第二章细胞与生物大分子

·原核生物与真核生物细胞的主要区别；亚细胞器的功能；糖蛋白，核蛋白（举例）。

原核生物与真核生物细胞的主要区别是否具有明显的亚细胞器，～～溶酶体、微体等

可以通过差速离心和密度梯度离心相结合的方法将各细胞器分离纯化。

脂类：

甘油三酯、磷脂、鞘脂

复杂大分子：

一种以上的大分子以共价或非共价键相结合。

核蛋白：

核酸和蛋白质的结合体（端粒酶、核糖核酸酶P、核糖体、染色质、病毒）糖蛋白：

糖和蛋白质的结合体，是细胞膜的重要组分，并介导细胞与细胞间的识别糖脂：

糖和脂以共价键相结合，在脑细胞和神经细胞的膜中含量特别丰富。

膜蛋白有多种多样的功能：

•作为激素和神经递质等信号分子的受体；

•作为在吸收物质前降解细胞外分子所需的酶；

•作为选择性转运小分子、极性离子和分子的孔或通道；

•作为细胞与细胞相互作用的介质（主要是糖蛋白）。

大多数大分子的组装是由大量不同的非共价相互作用维系在一起的：

•氢键：

在供体基团的一个共价结合的氢原子（-O-H）和受体基团上的一对非成键电子（O=C-）间形成。

•范德华力：

电中性分子间的非共价结合力的总称。

•疏水相互作用（疏水堆积力）：

一些非极性分子倾向于聚集起来以减少暴露给水的表面积，从而产生的力。

疏水相互作用是蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂类相互作用以及核酸结构中的主要稳定力。

第三章基因的概念

·正确理解基因的内涵、了解证明核酸是遗传物质的三个实验、基因概念的多样性（名词解释）以及一个典型原/真核基因的结构。

1.基因概念的发展

a.孟德尔的“遗传因子”

1909年丹麦学者约翰森提出了“基因”

b.基因位于染色体上---摩尔根的染色体-基因学说

c.核酸是遗传物质

d.一个基因一种酶（onegene-oneenzyme）

e.一个顺反子一条多肽链

顺反子（cistron，又叫作用子）是由互补测验定义的遗传功能单位，是一个基因功

能不可分割的单位。

突变子（muton）是基因突变时，产生突变的最小单位。

一个突变子可以小到只是

一个核苷酸对。

重组子（recon）是基因重组时，可交换的最小单位。

交换有时也只有一个核苷酸对。

证明遗传物质是核酸（DNA或RNA）有3个著名的实验：

①肺炎双球菌的转化试验；

②噬菌体感染实验；

③烟草花叶病毒的感染实验。

2.基因概念的多样性

a.结构基因和操纵基因

操纵子模型解开了基因表达的调控机制

操纵基因是原核生物的操纵子中调节蛋白的结合位点，为控制结构基因转录的DNA序列b.重叠基因

不同的基因共用一段相同的DNA序列

c.断裂基因

原核生物的基因一般是连续的，而真核生物的绝大多数基因都是不连续的断裂基因。

无编码意义的插入片段称为内含子（intron），有编码意义的基因片段称为外显子（exon）。

d.跳跃基因（转座子）

可移动的遗传基因存在，某些基因具有游动性。

转座子除了含有与改变自身位置有关的基因以外，还携带与插入功能无关的基因。

e.不编码蛋白质的基因

RNA基因，或者分别称为rRNA基因和tRNA基因

f.假基因

指具有与功能基因相似的序列，但不能翻译有功能蛋白质的无功能基因。

它往往存在于真核生物的多基因家族中。

•

（1）常规假基因：

指基因的核苷酸序列因为突变而发生改变，导致基因失活。

如珠蛋

白假基因。

•

（2）已加工的假基因：

以某个基因的mRNA合成的cDNA拷贝再次插入到基因组后，

由于缺少上游调控序列不能转录而引起的基因失活。

基因家族：

一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。

它们可以串联排在一起，形成基因簇；也可以位于不同的染色体上。

基因：

能够表达出一个有功能的多肽链或功能RNA分子的核酸序列。

原核生物的基因应包括：

调控序列，5’-非翻译区，编码序列，3’-非翻译区。

真核生物的基因应包括：

调控序列，5’-非翻译区，外显子，内含子，3’-非翻译区。

•许多真核生物的基因都被内含子所隔断。

•RNA剪接：

去除内含子并连接外显子的过程。

•在原核生物中，基因和顺反子通常等价。

•在真核生物中，顺反子等价于基因的外显子。

内含子在进化中的意义

有利于生物遗传的相对稳定。

增加变异概率，有利于生物的进化。

遗传重组是生物进化的主要动力；遗传重组容易发生在内含子中。

扩大生物体的遗传信息储量。

改变读码框架；可变剪接。

利用内含子进行代谢调节。

第四章核酸的结构和性质

·核酸的二级结构：

双螺旋模型、加卡夫法则、双螺旋结构的类型（左手、右手，A、B、Z）、稳定力；

·三级结构：

连接数、缠绕数、扭曲数，拓扑异构酶；

·理化特性和热力学特性：

RNA水解敏感性高的原因；增色效应和减色效应；变性、复性，Tm；回文序列。

嘌呤为双环结构，嘧啶为单环结构

在DNA中则为脱氧核糖，即2’位的羟基为氢原子所取代。

核苷=碱基+戊糖

核苷酸（nucleotide）：

由一个或多个磷酸分子与核苷共价结合而成。

5’-三磷酸脱氧腺苷（dATP）

NTP和dNTP是组成核酸大分子的基本元件，但DNA和RNA链中的重复单位是单磷酸（脱氧）核苷

DNA是由脱氧核糖核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来的生物大分子。

DNA/RNA序列:

一般用碱基字母代表，通常从左向右按5’到3’端方向书写。

6.DNA与RNA的异同点：

相同点：

结构的基本单位相同，5’3’方向，线性分子。

不同点：

a.在DNA中，戊糖是脱氧核糖；在RNA中戊糖是核糖。

b.TU

c.RNA主要是单链形式；DNA主要是双链形式。

DNA的二级结构－双螺旋

1WatsonandCrick（1953）提出的DNA双螺旋结构模型：

DNA分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。

戊糖－磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.碱基间通过氢键相互连接，A和T以2个氢键配对，G和C以3个氢键配对.

螺旋中相邻碱基间相隔0.34nm，每10个碱基对螺旋上升一圈，螺距为3.4nm，直径为2nm。

2.Chargaff（加卡夫）法则：

1）所有DNA中，A与T的摩尔含量相等（A=T），G与C的摩尔含量相等（G=C）,即

嘌呤的总含量与嘧啶的总含量相等（A+G=T+C）。

2）DNA的碱基组成具有种属的特异性，但没有组织和器官的特异性。

3）生长和发育阶段，营养状态和环境的改变都不使DNA的碱基组成改变。

4.DNA双螺旋结构的类型:

三种形态的DNA：

A-DNA,B-DNA,Z-DNA

两类：

右手螺旋和左手螺旋

DNA的三级结构－超螺旋

正超螺旋：

DNA扭曲的方向与双螺旋方向相同。

具正超螺旋的DNA处于过旋状态。

（左手超螺旋）

负超螺旋：

DNA扭曲的方向与双螺旋方向相反。

具负超螺旋的DNA处于欠旋状态。

（右手超螺旋）

超螺旋的水平可以用连接数的变化（Lk）来衡量。

连接数Lk（Linkingnumber）：

两条链相互连接的数目。

负超螺旋DNA具有比松弛的DNA更高的能量。

这一能量会使DNA螺旋更易于局部解旋。

因此，负超螺旋有利于一些需要螺旋解旋的细胞过程，如转录起始或复制。

2.超螺旋的拓扑学

缠绕数Tw（Twistingnumber）：

双螺旋本身的螺旋数。

扭曲数Wr（Writhingnumber）：

围绕超螺旋轴扭曲的圈数。

连接数=缠绕数+扭曲数；Lk=Tw+Wr

拓扑异构体：

一个具有给定连接数的DNA分子。

除非DNA的一条或两条链发生断裂，否则连接数保持不变。

当连接数不变时，DNA分子的构型可以发生改变。

主要通过缠绕数和扭曲数的变化来实现。

3.超螺旋的转变

1）嵌入剂如溴化乙锭（EB）影响DNA双螺旋内部缠绕：

缠绕数减少，扭曲数增加，而

连接数不变。

2）拓扑异构酶：

能调控DNA分子超螺旋水平的酶。

拓扑异构酶I：

在一条链的磷酸骨架上产生断裂，每次断裂使Lk变化±1，一条链穿过缺口。

利用水解磷酸二酯键提供能量，不需要额外的能量。

拓扑异构酶II：

在2条链的磷酸骨架上都产生断裂，每次断裂使Lk变化±2。

反应由ATP提供能量，2条链穿过缺口。

在原核生物（大肠杆菌）中，拓扑异构酶I称为酶；拓扑异构酶II称为螺旋酶或旋转酶。

生物体内通过两种拓扑异构酶的相互抑制作用，维持了体内基本恒定的5%的负超螺旋密度。

生物体内DNA的负超螺旋密度低于或超过5%时，均不利于其生长发育。

体内DNA超螺旋的形成或去除与DNA功能相联系。

如：

DNA复制，转录等。

4.超螺旋的功能：

a）在DNA解链过程中更容易打开DNA。

负超螺旋

b）使DNA不易受到核酸酶等的攻击。

c）有利于更加紧密的结构的形成，如染色体结构。

在真核生物细胞内，DNA三级结构与组蛋白八聚体共同组成核小体，核小体是染色质的基本结构单位。

在核小体基础上，DNA链经反复折叠形成染色体。

五、DNA的结构多样性

1）单链DNA

a.几类病毒的DNA呈单链状态。

如：

球形病毒ØX174，棒型病毒MB。

b.单链DNA分子内可形成部分双链，不规则的发夹结构。

c.单链DNA的密度通常比双螺旋DNA大。

2）线性DNA

3）环状DNA

猴病毒SV40，质粒，大多数细菌染色体。

a.开环DNA：

双链中一条链呈闭合环状，另一条链的骨架上有缺口。

b.闭环DNA：

两条链都呈闭合环状，也称为共价闭环DNA。

4）反向重复与回文序列

反向重复的２个拷贝间不一定要相互连接在一起

六RNA的结构和功能

1）RNA分子通常以单链形式存在

2）RNA分子局部发生分子内碱基配对形成二级结构

3）碱基配对，其它氢键的相互作用以及碱基堆积作用使RNA形成复杂的三级结构

1.真核生物成熟mRNA的结构特点：

1）5’端帽子结构

即在5’端加上一个7-甲基鸟苷

帽子结构能促进核糖体与mRNA的结合，加速翻译起始速度，同时可以增强mRNA的稳定性。

2）3’末端多聚A的尾巴。

可能与mRNA从核内向胞质转移及mRNA的稳定有关。

mRNA的功能是把核内DNA的碱基顺序按照碱基互补的原则，转录并转送至胞质，指导蛋白质的合成。

2.转运RNA是细胞内分子量最小的一类核酸，其功能是在蛋白质合成过程中作为各种氨基酸的载体。

tRNA的特点：

（1、tRNA分子中含有10~20%的稀有碱基，包括双氢尿嘧啶（DHU）、假尿嘧啶（Ψ）和甲基化的嘌呤（mG，mA）。

（2、tRNA中存在一些能局部互补配对的区域，能形成局部双链，进而形成一种茎-环或发夹结构。

由于茎环结构的存在，使tRNA形成了三叶草形的二级结构。

（3、tRNA共同的三级结构：

倒L型。

3.核糖体RNA（ribosomalRNA，rRNA），是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上。

rRNA与核蛋白体蛋白共同构成核糖体（ribosome）。

核小RNA（SnRNA）：

发现于真核生物细胞核中，与前体mRNA剪接成成熟mRNA的过

程相关。

核仁小RNA（snoRNA）：

发现于真核细胞核的核仁区，在rRNA分子的加工过程中起

到核心作用（比如在某个核苷酸位点上加上一个甲基）。

微小RNA（miRNA）和短干扰RNA（siRNA）：

是调控个别基因表达的小RNA。

七、核酸的理化特性

1.核酸结构的稳定性

氢键促成了双链的形成，但对核酸结构的稳定性无多大影响。

核酸螺旋的稳定性取决于：

1）碱基对间的疏水堆积作用

2）碱基相互作用的范德华力

2.酸效应

强酸＋高温核酸完全水解为碱基、核糖／脱氧核糖和磷酸。

pH=3-4连接嘌呤（A和G）和核糖的糖苷键发生断裂，产生脱嘌呤核酸。

3.碱效应

1）DNA

1.pH>7-8时，碱基的互变异构态发生变化，由酮式向烯醇式转化。

2.这种变化影响到特定碱基间的氢键作用，结果导致DNA双链解离，称为碱变性。

2）RNA

pH较高时，同样导致内部氢键断裂，RNA的螺旋区域发生变性。

同时，2’-OH参与磷酸二酯键分子内裂解，形成2’,3’-环磷酸二酯。

因此，即使在中性条件下，RNA水解的敏感性也比DNA高得多。

4.化学变性：

化学变性：

在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链。

监测指标为A260的变化。

一些化学物质，如尿素（H2NCONH2）和甲酰胺（HCONH2）能使DNA或RNA在中性pH条件下变性。

这些物质破坏了氢键作用，由碱基堆积形成的疏水作用被减弱，导致核酸变性。

5.黏性

DNA很细而长，是一个相对刚性的线性高分子，因此在溶液中黏性很强。

长的DNA分子易被机械力和超声波损伤。

而RNA分子远小于DNA，粘度也小得多。

应用：

利用机械力和超声波可产生特定长度的DNA片段。

当要分离大片段的DNA分子时，要避免机械作用。

6.浮力密度

在8M氯化铯（CsCl）溶液中，DNA与溶液的密度大致相同，约为1.7g·cm-3。

平衡（等）密度梯度离心

八、核酸的光谱学和热力学特性

1.紫外光吸收：

核苷酸的嘌呤、嘧啶环上由于有共轭双键，能强烈地吸收紫外光，在波长为260nm处吸收达到最大值，利用该特性可以对核酸进行检测、定量与纯化。

增色效应和减色效应

单一的核苷酸在260nm的光吸收值最大，其次是单链DNA（ssDNA）或RNA，而双链DNA（dsDNA）最小。

ssDNA（单链）dsDNA（双链）：

减色；dsDNAssDNA：

增色。

2.DNA的纯度

可大致由A260/A280的比值来确定。

纯dsDNA的A260/A280为1.8，纯RNA的A260/A280为2.0。

而蛋白质由于lmax=280nm，A260/A280小于1（实际上在0.5左右）

3.DNA热变性

除化学物质外，加热也可使DNA和RNA中双链部分氢键的断裂，从而导致变性。

1）DNA热变性从开始到完全解链是在一个相当窄的温度范围内完成的。

通常把DNA的

双螺旋结构失去一半时的温度称为DNA的解链温度，用Tm表示。

2）Tm是DNA样品中（G+C）含量的函数，对于长DNA分子，其取值范围是80~100°C。

3）影响Tm值的因素：

a）DNA片段的均一性，dsDNA的含量越高，Tm越大

b）（G+C）含量。

DNA每增加1%的（G+C）含量，Tm值增加大约0.4°C。

c）介质的离子强度。

介质的离子强度低时，Tm值也低，熔解温度范围也宽。

4）环状DNA的变性：

（a）如果两条链都是闭合环状的,变性可以打破双螺旋结构，但两条单链相互缠绕在一起，不能分开。

（b）如果其中一条或两条链上有切刻，两条链在热变性时将分开。

4.DNA复性

在一定条件下，变性的DNA的互补碱基对间氢键重新形成，恢复原来的双链状态，称为复性。

热变性DNA经缓慢冷却后即可复性，也称为退火。

快速降温：

仅在局部区域发生碱基配对，重新形成双链。

光吸收值下降很小。

如dsDNA加热变性后将其迅速冷却至4℃以下，则不可能发生复性。

比Tm低25℃为DNA复性的最佳条件。

慢速降温：

互补链相互配对，形成完全的双链DNA。

光吸收值与原初样品相同。

核酸杂交：

利用变性、复性技术使不同来源的核酸互补序列结合形成双螺旋结构的过程。

例：

Southern杂交、Northern杂交。

分子杂交：

在DNA复性过程中，双链分子的再形成既可以发生在序列完全互补的核酸分子之间，也可以发生在碱基序列部分互补的不同的DNA之间或DNA与RNA之间，这种现象称为分子杂交。

第五章DNA的复制

·基本概念：

DNA半保留复制、前导链、后随链、冈崎片段、复制子、复制泡、引发体、复制体等；

·DNA复制的特点；原核生物DNA复制的过程及其与真核生物DNA复制间的比较；复制过程中涉及到的酶（DnaA、DnaB、DnaC、SSB蛋白、DNA拓扑异构酶、DNA聚合酶I、II、III）及其功能；端粒的结构、复制过程及其与其它部分DNA复制的异同点；klenow大片段

1.关于DNA复制机制的学说

全保留复制

分散复制

半保留复制

二、复制子

复制子（replicon）：

生物体的复制单位，一个复制子只含有一个复制起始点。

——复制的起点（Originofreplication）：

复制开始于分子内部的某个点。

——复制泡：

DNA合成时从复制起点开始向一边或两边移动，形成的泡状中间产物。

——复制叉（replicationfork）：

复制时DNA双链解开分成二股单链，新链沿着张开的二股单链生成，复制中形成的这种Y字形的结构称为复制叉。

——DNA分子复制时，有两种类型的区域：

（1）亲代双链组成的父本区

（2）进行子代链合成的复制区

——复制的方向可以单向，也可以双向

单向复制：

起点只有一个复制叉。

双向复制：

起点处有两个复制叉，向相反方向移动。

原核生物染色体、许多噬菌体及病毒的DNA分子都是作为单个复制子进行复制的，一个起点，双向进行。

真核生物染色体含有多个复制子，可以同时在多个起点进行双向复制。

复制叉移动的方向和速度可以多种多样，但以双向等速为主。

三、DNA复制的特点

1.链增长方向为5'→3'

2.冈崎片段与不连续复制：

前导链：

合成方向与复制叉移动的方向一致，通过连续的5'→3'聚合反应合成的新的DNA链。

后随链：

合成方向与复制叉移动的方向相反，通过不连续的5'→3'聚合反应合成的新的DNA链。

冈崎片段：

相对比较短的DNA链（1000-2000nt），是在DNA后随链的不连续合成期间生成的片段。

3.需要RNA作引物

用RNA引导DNA的复制对DNA复制的高忠实性至关重要

DNA复制的基本特点：

DNA复制是从特定的复制起点开始，大多数是双向进行。

采用半保留和半不连续复制的方式进行复制，方向是5'→ 3'，且需要多种酶和蛋白质的参与，需要RNA作引物。

四、原核生物DNA的复制（E.coli）

1.与解链有关的酶和蛋白质

（1）解螺旋酶（helicase）：

DnaB

（2）单链结合蛋白（SSB蛋白）

c.协同效应：

原核生物中，如果第一个SSB结合到DNA上的能力为1，则第二个SSB的结合能力可高达1000。

真核生物的SSB蛋白无协同作用。

（3）DNA拓扑异构酶

拓扑异构酶作用特点：

既能水解、又能连接磷酸二酯键

2.DNA聚合酶

核酸酶：

切除多核苷酸链中磷酸二酯键的的酶。

－内切酶：

断裂内部二酯键的酶。

内切酶作用产生核酸片段。

－外切酶：

切除末端核苷酸的酶。

外切酶从分子的末端切除，产生单核苷酸。

DNA聚合酶：

合成DNA的酶，完成DNA链的延伸。

DNA聚合酶只能以脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底物。

（1）DNA聚合酶I

需要DNA模板才能发挥作用。

一旦与模板结合，不会马上脱离，而是继续作用，称为持续性，保证了复制过程的连续性。

A.5'→3'方向的聚合活性。

B.5'→3'外切酶活性：

C.3'→5'校正外切酶活性：

用枯草杆菌蛋白酶处理DNA聚合酶I，可获得两个片段，大片段的分子质量约76kDa，保留聚合酶活性和3’5’外切核酸酶活性，又叫Klenow片段。

小片段具有5'→3'外切核酸酶活性。

DNA聚合酶I不是大肠杆菌复制中主要的合成酶，而是在去除RNA引物、DNA损伤修复以及DNA体外标记中起重要作用。

DNA体外标记的方法

A.缺口平移法（Nicktranslation）（DNA聚合酶I）

B.末端标记法（Klenow片段）

C.随机引物法（Klenow片段）

（2DNA聚合酶II

具有5'→3'方向的聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。

其生理功能还不清楚。

可能主要在DNA损伤修复中起作用

（3）DNA聚合酶III

a.全酶由7种不同的亚单位组成，每个亚单位有其特定的功能。

b.它既具有3'→5' 聚合酶活性，也有3'→5' 核酸外切酶活性。

c.该酶的活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，DNA聚合酶II的300倍，是大肠杆菌DNA复制中起主导作用的酶。

d.复制时，两个PolyIII全酶组成二聚体，结合于复制叉上，同时进行前导链和后随链的合成。

（1）起始

（2）引物合成

a.DNA合成是从DNA引发酶合成的一段RNA引物开始，再由DNA聚合酶从引物3'端

开始合成新链。

b.前导链合成前，DNA引发酶在起点合成RNA短链，经RNaseH去除短链中不必要部分。

这些短链把起点处DNA双链分开以便引发体与特定序列结合，进而合成RNA引物。

引发:

引发酶识别单链DNA上专一的DNA序列,合成RNA引物的过程。

引发体（Primosome）:

引发酶和另外6种蛋白质（DnaB,DnaC,n,n',n''和I）组装而成的多蛋白复合体。

引发体的作用：

排除SSB、识别起始点、合成RNA引物。

引发体常合成3-5个碱基的引物。

DnaA蛋白辨认起始点,形成起始复合物

DnaB蛋白解螺旋，消耗ATP

DnaC蛋白协助DnaB

DNA拓扑异构酶：

引入负超螺旋

SSB维持单链稳定

（3）延伸

a.前导链和后随链的引物均由DNA聚合酶III全酶来延伸。

b.PolyIII全酶是一个二聚体，一个单体用于先导链的合成，另一个用于后随链的合成，

从而可以保证两条链以同样的速度合成。

c.二聚体的两个单体都含有聚合酶亚基、3’→5’校正作用的外切核酸酶亚基和将

聚合酶结合于DNA的亚基。

d.每个单体中的其余亚基各不相同，以保证全酶在前导链和后随链上分别合成长或短

的DNA片段。

e.一旦后随链的引物被PolyIII延伸，会由PolyI将引物去除，并填上DNA。

f.两个片段间最后的磷酸二酯键是由DNA连接酶来催化完成的。

g.体内的DNA聚合酶III的全酶二酶体、引发体和DNA解旋酶以物理方式结合成一个

大的复制体，该复制体以每秒900bp的速率合成DNA。

复制体（replisome）：

DN