《基因工程》重点.docx

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《基因工程》重点

基因工程重点

第一章

一、名词解释：

基因工程：

基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体链接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使基因生物获得新的遗传性状的操作。

基因操作：

泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。

基因克隆：

是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节，很多时候并不涉及动物、植物等的转化及性状的遗传改良。

第二章

一、名词解释：

核酸酶：

通过切割相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而使核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。

限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）：

简称限制酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并切割DNA双链结构的内切核酸酶。

限制-修饰系统：

黏性末端（stickyend）：

指DNA分子在限制性内切核酸酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸形成的末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新连接起来。

平末端（bluntend）：

若限制性内切核酸酶在识别序列的对称轴上切割，形成的片段末端为平末端。

同切点酶（isoschizomer）：

又称同裂酶，是一类来源于不同的微生物、能识别相同靶序列的限制性内切核酸酶。

同尾酶（isocaudamer）：

来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的粘性末端。

酶的星号活性（staractivity）：

限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定条件下测定的。

当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性。

DNA连接酶（DNAligase）：

能催化双链DNA片段靠在一起3'羟基末端与5'端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两端连接的一种核酸酶。

DNA聚合酶:

DNA聚合酶的作用是在引物和模板的作用下，把脱氧核糖单苷酸连续地加到双链DNA分子引物的3'-OH末端，催化甘氨酸的聚合作用。

TaqDNA聚合酶：

是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，Taq基因全长2496bp，编码832个氨基酸，相对分子质量约为94000，除具有5’→3’聚合酶活性外，还有5’→3’外切酶活性，但没有3’→5’外切活性，因而无3’→5’方向的校正功能。

反转录酶（reversetranscriptase）:

是依赖于RNA的DNA聚合酶，或称为RNA指导的DNA聚合酶，是分子克隆中重要的核酸酶之一。

反转录酶普遍存在于含RNA的反转录病毒中，它以RNA为模板，催化合成互补的DNA单链，进而合成DNA第二条链。

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）:

，简称末端转移酶，一般是从小牛胸腺中提取的一种碱性蛋白，相对分子质量为3400。

在末端转移酶催化下将脱氧核苷酸添加到DNA分子的3’-OH，伴随无机磷酸的释放。

碱性磷酸酶:

能够催化核酸分子脱掉5’的磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。

外切核酸酶（exonuclease）:

是一类从多核苷酸链的末端开始逐个降解核苷酸的酶。

S1核酸酶:

来源于米曲霉，是一种含锌的蛋白质，相对分子质量为32000，相对耐热，由nucO编码，可以高特异性地降解单链DNA和RNA，包括单链分子中的单链区域（如发卡结构），反应产物为5’单核苷酸链，调节S1核酸酶的用量，可以切割双链DNA的单链缺刻，但它不能识别单个碱基对的错配。

脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ）:

简称DNA酶Ⅰ，是来源于牛胰脏的糖蛋白。

它是一种需要二价阳离子的内切核酸酶，能从嘧啶核苷酸5’端磷酸基处随机降解单链或双链DNA，生成具有5’磷酸末端的寡核苷酸。

当有Mg2+存在时，能在双链DNA上随机独立地产生切口；而在Mn2+存在时，则在双链DNA的大致同一位置上切割，产生平末端。

核糖核苷酸A（RNaseA）：

又称RNA酶A，是从牛胰脏中分离纯化得到的一种内切核酸酶，它可以特异性地攻击RNA上嘧啶残基的3’端，切割胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，反应终产物是嘧啶3’磷酸和末端带嘧啶3’磷酸的寡核苷酸。

P13页的表2—1

二、思考题

1、Klenow片段和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ有何异同？

答：

（1）Klenow片段是来自大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段

（2）DNA聚合酶Ⅰ具有5’→3’聚合酶活性，3’→5’核酸外切酶活性，5’→3’核酸外切酶活性；Klenow片段只有5’→3’聚合酶活性，3’→5’核酸外切酶活性。

2、Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性有哪些？

答:

Ⅱ型限制性内切核酸酶只有一种多肽，以同源二聚体的形式存在，其识别和切割DNA分子具有严格的特异性。

①识别序列的特异性:

识别序列为4-6bp的双重螺旋对称结构的回文序列；②切割位点的特异性：

在识别序列内或附近特异性切割双链DNA分子，水解磷酸二酯键，产生3’端羟基、5’端磷酸基团的DNA片段。

3、大肠杆菌DNA聚合酶酶Ⅰ有哪些不同的酶活性特性，各有何利用价值？

5’→3’聚合酶活性:

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的聚合酶活性是以DNA为模板，利用体系中的4种脱氧核糖核苷（dNTP），催化单核苷酸分子加到引物的3’-OH末端，沿5’→3’合成与模板互补的另一条DNA链，聚合作用需要Mg2+存在。

模板DNA可以是单链或双链DNA分子。

双链DNA只有在其一条链上有一个或数个断裂时才可以作为有效模板。

3’→5’外切酶活性：

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的3’→5’外切酶活性是沿3’→5’方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸，这种外切酶活性在体内DNA复制时主要起校对作用。

当DNA复制中掺入的核苷酸与模板不互相而游离时就会被其3’→5’外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。

这种校对功能保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。

5’→3’外切酶活性：

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的5’→3’外切酶活性，是从5’端降解双链DNA分子。

它也可以讲解DNA：

RNA杂合体中的RNA分子，即具有RNA酶H的活性。

这种酶外切活性特点是：

待切除的核酸分子必须具有5’端游离基团；核苷酸分子被切除前位于已配对的DNA双螺旋区段上；被切除的可以是脱氧核苷酸，也可以是非脱氧核苷酸。

第三章

一、名词解释

载体：

能携带外源基因进入细胞复制、整合或表达的工具。

质粒：

存在于多种宿主细胞中，独立于染色体外的可自主复制闭合环状的DNA分子。

人工染色体（载体）:

染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源基因DNA片段复制的载体，其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小媲美。

二、相关知识重点

1、载体必须满足的基本条件：

具有对受体细胞的能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增值具有单一性制性内切核酸酶识别位点组成的多克隆位点，可供外源基因的插入4、具有合适的选择性标志，用于含有重组质粒的宿主细胞筛选

2、

（1）pBR322质粒载体的基本特征:

由ColE1质粒衍生的pMB1作为出发质粒构建而成。

复制起点来自pMB1，拷贝数15-20，具有tet和amp。

（2）pUC18和pUC19的基本特征:

均由pBR322改造而来。

两个质粒结构几乎一样，只是多克隆位点的排列方向相反。

复制起始位点为突变的pMB1，缺乏控制拷贝数的rop基因，不含多余的DNA片段。

均只保留pUBR322的amp基因，含有一段来自M13mp18/19的lacZ基因5'末端的编码序列，在特定的受体细胞中可变现α-互补作用，形成蓝、白菌落可用于筛选重组质粒。

注重看一下：

P40和P47的两个图及其含义

3、常用的人工染色体有酵母人工染色体和细菌人工染色体。

4、原核表达载体的表达元件主要包括：

启动子、复制子、转录终止子、核糖体结合位点和标记基因。

5、Ti质粒可分为T-DNA、Vir、Con和Ori4个功能区，均可用于双子叶植物转基因中。

P53

6、质粒具有哪些特性？

答：

质粒的基本性质:

1）复制:

它们使质粒独立于宿主细胞的染色体外自主复制并保持其固有的遗传信息及相对稳定的拷贝数2）质粒的不相容性：

两种质粒在同一种宿主细胞中不能共存3）质粒的转移性：

使质粒从一个细胞转移到另一个细胞中。

8、试述黏粒载体的组成要素及其应用情况？

答：

黏粒载体由质粒和含有cos位点的λDNA片段所组成，大小一般在5-7kb，包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式复制，又可以承载40kb左右的外源DNA片段。

应用：

黏粒载体只有一个cos位点，所以在使用时要首先须对黏粒载体进行适当处理，构成具有两个cos位点的二联体线性DNA分子，当外源DNA重组进入二联体线性DNA分子，而且两个cos位点之间的核苷酸列足够长且与包装蛋白混合时，两个cos位点可被A蛋白所切割，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到λ噬菌体中去。

9、表达载体需要的基本元件及其作用？

答：

1）启动子：

DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列，其强弱影响表达量的决定因素之一。

2）转录终止子：

稳定系统，防止克隆的外源基因表达干扰载体的稳定。

3）核糖体结合位点：

转录出的mRNA必须借助宿主细胞的蛋白质合成系统翻译出目的蛋白。

细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效核糖体位点以及其中的SD序列，从而启动临近的翻译起始密码子的蛋白质翻译。

4）复制子：

 能独立进行复制的一部分DNA，其中包括发出被动复制指令的基因。

5）标志基因：

通过检测受体细胞中有无标记基因来判断是否成功将重组质粒（带有目的基因）导入受体细胞。

第四章

一、名词解释

1、Southern杂交：

是将DNA片段从琼脂糖转移到滤膜上。

2、Northern杂交：

是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

3、Western杂交：

是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。

4、探针：

是指用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸序列，这些序列在使用之前，需要进行标记。

5、引物：

是指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链DNA片段。

6、逆转录PCR：

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板透过PCR进行DNA复制。

二、相关知识要点

1、DNA提取的基本原理：

DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂它的钠盐比游离态更易溶于水，DNA在水中溶解度可达10g/L，呈黏性胶体。

生物细胞中大部分DNA大部分集中在细胞核，多以脱氧核糖核蛋白（DNP）形式存在。

DNP在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的显著影响（在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度最低，在1mol/LNaCl溶液中溶解度很大），而核糖核蛋白（RNP）在盐溶液中的溶解度受盐溶液浓度的影响较小（在0.14mol/LNaCl溶液中溶解度较大），因此常用钠盐法分离DNP和RNP两种核蛋白。

2、DNA提取的主要步骤：

（1）细胞裂解和DNA的溶解：

一般采用机械破碎细胞或酶解细胞释放DNA。

（2）与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除:

主要是利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂、去污剂使蛋白或多糖类变性。

（3）DNA的沉淀和纯化：

将向得到的DNA上清液中加入2倍体积的无水乙醇可使其沉淀。

3、NA提取的基本原理:

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA释放到溶液中。

当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。

水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。

4、紫外光光度法测定DNA、RNA的浓度和纯度

样品中单链DNA、双链DNA和RNA的浓度计算公式：

SSDNA=33*（OD260—OD310）*稀释倍数

dSDNA=50*（OD260—OD310）*稀释倍数

SSRNA=40*（OD260—OD310）*稀释倍数

1µg/mLDNA溶液OD260等于0.021µg/mL的RNA或单链DNA溶液OD260等于0.022~0.0241个OD260相当于50µg/mL的双链DNA，37µg/mL单链DNA，40µg/mL的RNA，30µg/mL的寡核苷酸

5、DNA电泳影响因素：

（1）DNA分子大小：

DNA分子越大，在凝胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。

（2）DNA分子构型：

不同构型的质粒DNA分子即使具有相同分子质量，电泳迁移速率也不同，超螺旋最快、线状分子次之。

开环分子最慢。

（3）凝胶浓度：

对于同种DNA分子，凝胶浓度越高，电泳速率越慢；浓度低的胶线性范围较宽，而浓度高的凝胶对小分子DNA片段呈现较好的线性关系。

（4）电场强度：

电场强度高（5V/cm），电泳速度快，但分辨率低。

（5）溴化乙锭（EB）：

其具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，可用作DNA染色剂。

（6）电泳缓冲液：

目前有TAE（多用，时间短成本低）、TBE、TPE3种

6、核酸分子杂交：

实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。

应用于重组子鉴别、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等

7、Southern杂交应用：

遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等，例如在研究转基因的时候，可用于检测外源基因的插入和整合情况。

8、Northern杂交应用：

是检测、定量mRNA大小及在组织中表达水平的标准方法，既是能直接提供有关RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一张膜上直接比较同一信息在不同样品中的表达丰度的首选方法。

9、Western杂交应用：

主要用来检测细胞或组织样品中是否存在能被某抗体识别的蛋白质，从而判断在翻译水平上某基因是否表达。

10、PCR技术原理：

DNA在高温时可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做引发子，加入DNA聚合酶、dNTP完成特定基因的体外复制。

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。

12、PCR技术的基本过程：

变性、退火和延伸

（1）模板DNA的变性：

模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

（2）模板DNA与引物的退火（复性）：

模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

（3）引物的延伸：

DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的"半保留复制链"，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

13、PCR的反应体系含有哪些基本成分？

缓冲液、模板、dNTP、耐热的DNA聚合酶、引物

和体内复制相比较，PCR体外反应体系还需要加耐热的DNA聚合酶

DNA聚合酶应用区别：

TaqDNA聚合酶：

扩增效率最高的耐热DNA聚合酶，能很好的扩增6kb以下的DNA片段。

扩增碱基出错率为10-5左右。

PfuDNA聚合酶：

目前保真度最高的耐热DNA聚合酶，碱基出错率为10-6，但扩增效率低于Taq酶，一般能很好的扩增2kb以下的片段。

14、提取DNA、RNA的步骤主要有哪些？

需要注意哪些问题？

DNA提取：

（1）细胞裂解和DNA的溶解

（2）与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除（3）DNA的沉淀和纯化注意问题：

RNA的提取：

（1）细胞的有效破碎

（2）使核蛋白复合体充分变性、解离，使核酸释放到溶液中（3）有效地抑制内源及外源RNase活性（4）将RNA与DNA、蛋白质和多糖分开注意的问题：

15、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲电泳的原理是什么？

影响因素有哪些？

各有什么用途？

（1）琼脂糖凝胶电泳：

是以琼脂糖为支持物，在适当条件下对带电生物大分子进行电泳的技术，主要用于DNA分子的分离、纯化和鉴定。

影响因素：

1）DNA分子大小2）DNA分子构型3）凝胶浓度4）电场强度5）溴化乙锭6）电泳缓冲液

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：

是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持物介质的垂直凝胶电泳，可根据电泳样品的电荷、分子大小及性状的差别分离物质。

适用于小分子DNA、寡聚核苷酸和蛋白质的分离。

影响因素：

电场强度、分子静电荷量、分子大小和形状以及介质的离子强度、黏度和温度。

（3）脉冲电泳：

是一种交替变换电场方向的电泳，它以一定的角度并以一定的时间改变电场的方向，是DNA在微观上按“Z”字形向前泳动，从而达到分离相对分子量大的DNA片段的目的，可使50Kb以上，甚至Mb级的大片段DNA。

影响因素：

电场方向、电流大小及作用时间。

16、分子杂交的原理是什么？

有几种类型？

各有什么作用？

核酸分子杂交实质上是双链DNA或者具有二级结构的RNA变性后，其具有互补序列的两条单链的退火复性过程。

有核酸和蛋白质两种类型应用于重组子鉴别、基因分离、DNA片段分析、基因表达研究等

17、设计引物应遵循以下原则：

1、引物长度：

15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物扩增跨度：

以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

3、引物碱基：

G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3''端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。

4、引物3''端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。

5、引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。

6、引物的特异性：

引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

7、引物量：

每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

18、实时定量PCR的原理是什么？

有哪些应用？

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR进程最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析

应用：

对特定核苷酸片段进行指数级的扩增

第五章

一、名词解释：

1.RACE：

即cDNA末端的快速扩增技术，是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的PCR技术。

或者

2.RACE：

即cDNA末端的快速扩增技术，是一种根据已知部分cDNA序列扩增未知序列的PCR技术。

这种方法是根据基因编码蛋白的同源性或多个同源基因cDNA比较的变异情况，将同源基因cDNA的核心区段分析出来，针对核心区段保守性高的位点设计引物，然后运用RT-PCR克隆技术核心序列区。

3.简并序列：

由于一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列。

4.基因组文库：

简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。

5.cDNA文库:

是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录。

或者

6.cDNA文库:

以特定的组织或细胞mRNA为模板，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。

二、思考题

1.通过查阅资料了解5’RACE克隆的几种具体方法和实验流程？

答：

方法与实验流程：

（1）利用烟草碱性磷酸酶将mRNA5’端的帽子结构切除，然后利用

T4RNA连接酶上一段已知序列的寡核苷酸，RACE时可将它作为设计上游引物的依据。

（2）利用特殊反转录酶法，在反转录到cDNA的末端时，加上了几个多余的C碱基，在体系中加入3’端为几个G碱基的已知序列寡核苷酸，在合成cDNA末端加上一段延伸的序列，作为上游引物的位点，在反转录酶的作用下，利用oligo作引物合成cDNA第一链，反转录酶在cDNA第一链末端延伸合成了几个C碱基，体系中加入的3’端为G碱基的寡聚唐序列与cNDA末端互补，作为cDNA继续延伸合成的模板，在cDNA的末端合成出一段已知序列，形成5’RACE的引物位点。

（3）在cDNA第一链利用末端转移酶加上一段寡聚核苷酸作为引物结合的序列。

（末端脱氧核糖核酸转移酶法）

（4）单链cDNA分子环化法

2、什么是简并引物？

设计简并引物时怎样降低简并度？

答：

简并引物：

是合成一段作PCR扩增体系的简并序列的引物即为简并引物。

简并度越低，产物特异性越强，所以设计简并引物时在选取氨基酸序列时应选取对应密码子较少的残基，放弃最后一个氨基酸放弃其密码子的第3为碱基（避免引物3’末端兼并）。

3、基因文库要满足什么条件？

有哪些类型的基因文库？

答：

（1）基因文库要满足的条件：

①首先要满足文库的完整性，即文库应包含基因组的完整序列信息。

②基因组信息的可重建性。

③基因组文库的大小，即文库中应包含的独立重组子数目。

（2）基因文库的类型：

按其克隆的载体分，通常有质粒文库、噬菌体载体文库、粘性粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库等。

4、cDNA文库必须满足什么条件，其构建包括哪些步骤？

答：

条件：

①cDNA文库的代表性，即文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性；②文库中的重组cDNA片段的序列完整性。

（2）步骤：

细胞总RNA的制备及分离、cDNA第一链的合成、双链cDNA的合成、双链cDNA与载体的连接和噬菌体颗粒的包装及感染宿主细胞等。

①总RNA的提取RNA提取程序一般包括：

沉淀细胞、裂解细胞、离心除去细胞残渣。

②分离mRNA分离mRNA前，需先分离总RNA，一般利用异硫氰酸胍和β-巯基乙醇是核糖体解体，后通过沉淀得总RNA。

在合成cDNA第一链之前应对其完整性进行检测。

③对mRNA进行富集，即通过一定的方式使特定的mRNA分子在体系中的比例增高。

④cDNA的合成cDNA第一链的合成是以mRNA分子为模板，在反转录酶的作用下，利用适当引物引导DNA合成的过程。

mRNA3’端为polyA尾为cDNA第一链的合成提供了一个很好的引物位点。

⑤黏性末端片段与载体的连接为cDNA双链分子方便克隆入相应载体，常在oligo寡聚引物一端接上含有特定限制性核酸酶黏性末端的接头分子。

⑥离体包装获得重组噬菌体⑦检测重组噬菌体效价。

第4题XX的答案是如下：

条件：

1、要使用mRNA经过反转录PCR产生cDNA.

2、要进一步获得cDNA全长

3、加适当接头,连接到适当的载体内.

4、转化受体细胞,构建为cDNA文库.

基本步骤包括：

RNA的提取（例如异硫氰酸胍法,盐酸胍—有机溶剂法,热酚法等等,提取方法的选择主要根据不同的样品而定）,要构建一个高质量的cDNA文库