显微镜的使用及微生物形态观察.docx

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显微镜的使用及微生物形态观察

10实验

10.1显微镜的使用及微生物形态视察

10.1.1目的要求

了解光学显微镜的结构、各部门的功效；掌握光学显微镜的使用、调养要领；视察微生物的形态，学会生物图的绘制。

10.1.2器材和质料

10.1.2.1仪器或其它用具

光学显微镜、镜纸、吸水纸等。

10.1.2.2溶剂或试剂

⑴镜油：

香柏油或石蜡油。

⑵镜头清洗液：

二甲苯或醚醇清洗液（乙醚70mL，无水乙醇30mL）。

10.1.2.3菌种

米酒酵母、链霉菌、青霉、曲霉、根霉等装片。

10.1.3实验内容

10.1.3.1显微镜的根本结构

普通光学显微镜由机器和光学两大部门组成，见图10.1。

图10.1显微镜结构示意图

1.目镜；2.镜筒；3.镜臂；4.标本移动器；5.粗动限位器；6.粗调治器；7.细调治器；8.镜座；9.反光镜；10.虹彩光圈；11.聚光器；12.载物台；13.物镜；14.物镜转换器

（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程.北京：

北京大学出书社.1999）

⑴机器部门

镜座是显微镜的基座，使显微镜能平稳地安排在桌子上。

镜臂用以支撑镜筒，也是搬动显微镜时手握的部位。

镜筒是连接目镜和物镜的金属筒。

镜筒上端插入目镜，下端与物镜转换器相接。

载物台是安排标本的地方。

镜台上有压片夹用以牢固被检标本，较好的显微镜则有标本移动器，转动螺旋可使标本前后和左右移动。

有的标本移动器带有游标尺，可定位标本所在位置。

物镜转换器安装在镜筒的下端，其上装有3～4个差别放大倍数的物镜，可以通过转动物镜转换器选用符合的物镜。

调治器安装在镜臂的基部，是调治物镜与被检标本之间距离的装置，通过转动粗调治器和细调治器便可清晰地视察到标本。

⑵光学部门

物镜是显微镜中很重要的光学部件。

凭据物镜的放大倍数和使用要领的差别，分为低倍物镜、高倍物镜和油镜三种，常用的放大倍数为低倍物镜10×、高倍物镜40×、油镜100×。

目镜是把接物镜放大的实像再放大一次，并把物像映入视察者的眼中。

通常有5×、10×等规格。

聚光器安装在载物台下，能将平行的光芒聚焦于标本上，增强照明度。

聚光器可以升降，升高时增强光强，下降时削弱光强。

虹彩光圈附于聚光器内部，可开大或缩小，以调治进入镜头的光芒的强弱。

光圈巨细应适当，使物像能得到更清晰的效果。

反光镜是普通光学显微镜的取光设备，使光芒射向聚光镜，分平、凹两面，使用低倍镜和高倍镜均应用平面镜；凹面镜聚光力强，适合于光芒较弱时，一般在使用油镜时用凹面镜。

内光源是较好的光学显微镜自身带有的照明装置，安装在镜座内部，由强光灯胆发出的光芒通过安装在镜座的集光镜射入聚光镜。

其强弱可进行调治。

10.1.3.2显微镜的使用要领

（1）显微镜的取用和安排

从显微镜箱或柜内取出显微镜时，应一手提镜臂，另一手托镜座，让显微镜直立，防备目镜从镜筒中脱落。

显微镜应直立安排在桌上。

离桌缘3cm，查抄各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。

（2）标本安排

下降载物台或升高镜筒，使物镜远离载物台。

将低倍镜转至正下方，把标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使视察工具处在物镜的正下方。

（3）低倍镜视察

侧面注视，用粗调治器调治上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片靠近，距离约0.5cm处，开放光圈，下降聚光器。

选用平面反光镜并调治其角度，使视野内光芒均匀，亮度适宜。

如有内置光源灯可通过调治电压以得到适当的照明亮度。

再由目镜视察，同时转动粗调治器下降载物台或升高镜筒，使物镜逐渐远离玻片，标本在视野中显现后，再使用细调治器调治至图像清晰。

通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真视察标本各部位，找到符合的目的物，仔细视察并记载所视察到的结果。

（4）高倍镜视察

在低倍镜下找到符合的目标并将其移至视野中心后，侧面注视，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至正下方。

适当调治聚光器光圈及视野亮度，用细调治器使物像清晰，利用推进器移动标本，仔细视察并记载所视察到的结果。

在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到事情位置进行视察时，物像将保持根本准焦状态，这种现象称为物镜的同焦。

利用这种同焦现象，可以包管在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、事情距离短的物镜时，仅用细调治器即可对物像清晰聚焦，从而制止由于使用粗调治器时可能的误操纵而损坏镜头或载玻片。

（5）油镜视察

使用同焦显微镜时，在高倍镜或低倍镜下找到要视察的区域后，移开镜头，在待视察的区域滴加1～2镜油，将油镜转至油中，调治光强，使视野的亮度符合，用细调治器调治物像清晰为止。

对付不等焦的显微镜，用粗调治器下降载物台或升高镜筒，使物镜逐渐远离玻片，在标本视察区滴加镜油，然后将油镜转至镜筒下方，须在侧面注视下，用粗调治器调治上升载物台或下降镜筒，使物镜与玻片靠近，将油镜前端浸入镜油中，并险些与标本相接。

将聚光器升到最高位置并开足光圈，调治照明，使视野的亮度符合，用粗调治器上升镜筒或下降载物台，使物镜迟钝离开玻片，直至视野中出现物像，并用细调治器使其清晰准焦为止。

有时按上述操纵还找不到目的物，则可能是油镜头下降或载物台提升还未到位，或因油镜上升或载物台下降太快，以至眼睛捕获不到一闪而过的物像。

遇此情况，应重新操纵。

另外应特别注意，不要因在下降镜头时或提升载物台时用力过猛或调焦时误将粗调治器向反方面转动而损坏镜头及载玻片。

（6）显微镜用毕后的处理惩罚

用粗调治器使物镜远离玻片，取下载玻片。

用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许镜头清洗液擦去镜头上残留的油迹，最后再用洁净的擦镜纸擦去残留的镜头清洗液。

切忌用手或其它纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响视察。

用擦镜纸清洁其它物镜及目镜；用绸布清洁显微镜的金属部件。

放平反光镜，把聚光镜降下，将物镜转成“八”字形，将各部门还原，归置镜箱中。

10.1.3.4显微镜的维护和调养

显微镜是珍贵精密的光学仪器，正确的使用、维护与调养，不光视察物体清晰，并且延长显微镜的使用寿命。

（1）显微镜应安排在通风干燥，尘土少，不受阳光直接曝晒的地方。

不使用时，用有机玻璃或塑料布防尘罩罩起来。

也可套上布罩后放入显微镜箱内或显微镜柜内，并在箱或柜内安排干燥剂。

（2）显微镜要制止与酸、碱及易挥发具腐化性的化学物品放在一起，以免显微镜受损。

（3）显微镜应防备震动和暴力。

粗、细调治螺旋、聚光器螺旋和标本移动器等机器部门要灵活而不松动，如不灵活可在滑动部位滴加少许润滑油。

（4）显微镜的目镜、物镜、聚光器和反光镜等光学部件必须保持清洁，防备长霉。

镜检时通过转动目镜、物镜及调解焦距等步伐判断尘土或污脏所在部位，如附有尘土，则先用吸耳球吹去尘土，或用擦镜纸轻轻擦去。

若有污脏，用擦镜纸沾镜头清洗液轻轻擦拭，然后用擦镜纸擦干。

显微镜的金属油漆部件和塑料部件，可用软布沾中性洗涤剂进行擦拭，不要使用有机溶剂。

（5）用油镜视察后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后用擦镜纸沾少许镜头清洗液擦拭，最后用洁净的擦镜纸擦干。

10.1.4实验陈诉

绘出你所视察到的几种微生物形态图

思考题

1.镜检玻片标本时，为什么要先用低倍物镜视察，而不直接用高倍物镜或油镜视察？

2.油镜用毕后，为什么必须把镜油擦净？

用过多的清洗液擦镜油有什么危害？

3.视察时为什么要用左眼，并且两眼都应睁开？

10.2细菌的简朴染色法及革兰氏染色法

10.2.1目的要求

学习并掌握无菌操纵技能；学习细菌涂片、染色的根本技能；掌握细菌的简朴染色法和革兰氏染色法；牢固显微镜（油镜）的使用要领和学习生物画图技能。

10.2.2染色原理

细菌个别微小，菌体透明，必须通过染色使其着色后，才气较好地在光学显微镜下视察其个别形态和部门结构。

10.2.2.1简朴染色法

利用细菌在中性情况中带负电荷，而碱性染料如结晶紫、美蓝、碱性复红、番红等解离后带正电荷，细菌与染料具有亲和力而被着色的原理，接纳一种单色染料对细菌进行染色，称为简朴染色法。

适用于菌体一般形态的视察。

10.2.2.2革兰氏染色

是细菌学中的一个重要的辨别染色法。

由于应用了结晶紫和番红两种差别性质的染料进行染色，故又叫复染色法。

凭据细菌对此种染色法的反响差别，可将细菌分为两大类，菌体呈者为革兰氏阳性菌，呈赤色者为革兰氏阴性菌。

其原因是由于这两类细菌细胞壁的结构和组成差别决定的。

革兰氏阳性细菌的肽聚糖层较厚，交联度大，类脂质含量低，经用乙醇（或丙硐）脱色等处理惩罚主要产生脱水作用，而使孔经缩小，通透性低落，初染剂结晶紫和媒染剂碘的复合物保存在细胞内不被脱色，结果使细胞呈紫色；而革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄，类脂含量高，当脱色处理惩罚时，类脂质被乙醇（或丙硐）溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫和碘的复合物较容易被洗脱出来，用番红复染后，细胞被染上赤色。

10.2.3实验质料和用具

10.2.3.1菌种

大肠杆菌、白色（或金黄色）葡萄球菌、枯草芽孢杆菌（培养18～24h的斜面菌种）。

应用新鲜幼龄的菌体进行涂片。

10.2.3.2试剂及染液

（1）齐氏石炭酸复红染液：

A液：

碱性复红0.3g，95%乙醇10mL

B液：

石炭酸5.0g，蒸馏水95mL

将A、B二液混淆摇匀过滤。

（2）草酸铵结晶紫染液：

A液：

结晶紫2.0g，95%乙醇20mL

B液：

草酸铵0.8g，蒸馏水80mL

将A、B二液充实溶解后混淆静置24h过滤使用。

（3）鲁哥氏碘液：

碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL

配制时，先将碘化钾溶于5~10mL水中，再参加碘1g，使其溶解后，加水至300mL。

（4）95％乙醇

（5）番红染液：

2.5%番红的乙醇溶液10mL，蒸馏水100mL混淆过滤。

10.2.3.3器材

无菌水、显微镜、擦镜纸、吸水纸、载玻片、接种环、酒精灯、石蜡油、镜头清洗液。

10.2.4实验内容及步调

10.2.4.1简朴染色法

操纵步调如下：

（1）制片

涂菌取洁净载玻片一块将其一面在火焰上微微加热，撤除油脂，冷却，在载玻片中央滴加一小滴无菌水，用烧灼冷却后的接种环从试管中取少许菌和玻片上的水滴混匀，涂布成一均匀的薄层即可。

无菌操纵历程见图10-2。

接种环用后必须再次烧灼灭菌。

干燥涂布后，待其在空气中自然晾干。

牢固将已干燥的涂片正面朝上，通偏激焰３次，以热而不烫手为宜。

牢固的作用是杀死细菌；可使卵白质凝固，并使细菌粘附在玻片上，染色时不被染液或水冲掉；增加菌体对染料的结协力，使涂片易着色。

图10.2无菌操纵历程及涂片历程

1–烧灼接种环；2–拔去棉塞；3–试管口灭菌；4–挑取小量菌体；

5–试管口灭菌；6–将棉塞塞好；7–做涂片；8–烧去残留的菌体

（引自顾夏声等.水处理惩罚微生物学.北京：

中国修建产业出书社.1998）

（2）染色

在涂片处滴加1～2滴染色液（石炭酸复红、草酸铵结晶紫或番红任选一种），使其铺满涂菌的部位，染色约1min。

（3）水洗

斜置载玻片，倾去染液，用细水流轻轻冲去多余染料，直至流水变清为止。

注意水流不得直接冲在涂菌处，以免将菌体冲掉。

（4）吸干

用吸水纸轻轻吸去载玻片上的水珠，自然干燥。

（5）镜检

将干燥后的染色标本，先用低倍镜找到目的物，将低倍镜移开，滴加石蜡油于涂片处，用油镜进行视察。

注意种种细菌的形态和细胞排列方法。

用铅笔绘出细菌形态图。

视察完毕，用擦镜纸将镜头上的石蜡油擦净。

10.2.4.2革兰氏染色法步调

（1）制片

以无菌操纵技能取大肠杆菌和枯草杆菌（或白色葡萄球菌）分别做涂片、干燥、牢固。

要领与简朴染色相同。

还可在同一载玻片上，将两种菌作混淆涂片，按下述要领染色后，在镜检时便于比力。

（2）染色

初染用草酸铵结晶紫染液笼罩1min，用水冲洗。

媒染用鲁哥氏碘液冲去残水，并且碘液笼罩1min后水洗。

脱色用滤纸吸去玻片上的残水，乙醇滴加在涂片上静置30S立即水洗。

或斜置载玻片，用滴管从玻片上端滴加95％乙醇，直至流出的乙醇方才不现紫色立即水洗。

脱色是革兰氏染色的要害，必须严格掌握乙醇脱色的水平。

若脱色过分则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不敷时阴性菌被误染为阳性菌。

复染滴加番红复染1min后水洗并干燥。

（3）镜检

干燥后用油镜视察时应选择薄而均匀的区域，注意染色后细菌的颜色，以单个菌体的颜色为准。

菌体被染成紫色的是革兰氏阳性菌，被染成赤色的为革兰氏阴性菌。

绘出镜检细菌的形态，并注明革兰氏染色的结果。

若研究事情中要确定未知菌的革兰氏反响时，则需同时用已知菌进行染色作为比较。

思考题

1.涂片后为什么要进行牢固？

牢固时应注意什么？

2.革兰氏染色时，初染液和复染液能颠倒使用吗？

3.要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操纵？

要害在哪一步？

为什么？

4.为什么要用培养24h以内的菌体进行革兰氏染色？

5.当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样包管操纵正确，结果可靠？

10.3水体卫生细菌学查验

10.3.1培养基及其他物品的制备及灭菌

10.3.1.1实验目的

学会玻璃器皿的洗涤、包扎和灭菌的准备事情；掌握培养基的配制要领；掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的操纵要领。

10.3.1.2根本原理

正确掌握培养基的配制要领是从事微生物学实验事情的重要底子。

由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也许多，它们的配方及配制要领虽各有差别。

但一般培养基的配制步伐及其他的准备事情却大抵相同，例如器皿的准备、培养基的配制和分装、棉塞的制作、培养基的灭菌、斜面与平板的制作以及培养基的无菌查抄等根本环节大抵相同。

10.3.1.3实验器材

（1）试剂：

待配制种种培养基的组成身分，琼脂、10%HCl、10%NaOH、蒸馏水等。

革兰氏染液。

（2）仪器：

天平、高压蒸汽灭菌锅、烘箱、电冰箱。

（3）玻璃器皿：

培养皿、试管、150mL大试管、移液管（1mL和10mL）、锥形瓶（250mL、500mL）、1000mL烧杯、量筒、玻璃漏斗等。

（4）其他物品：

药匙、称量纸、pH试纸（6.4~8.4）、暗号笔、纱布、全脂棉花、棉线、报纸（或牛皮纸）、试管架等。

以上器材均是为10.3.2水的细菌总数检测和10.3.3水的大肠菌群检测作准备。

10.3.1.4实验步调：

（1）玻璃器皿的洗涤

玻璃器皿在使用前必须洗涤洁净。

培养皿、试管、锥形瓶等较大的器皿可用洗衣粉或去污粉洗涤，并用清水冲洗洁净；移液管先用洗液浸泡，再用清水冲洗洁净。

洗洁净的器皿自然晾干或置入烘箱烘干备用。

（2）玻璃器皿的包装

①培养皿的包装：

培养皿由一底一盖组成一套，将实验所需套数的培养皿用报纸（或牛皮纸）包好。

包装后的培养皿须经过灭菌后才气使用。

②移液管的包装：

用细铁丝将少许棉花塞入移液管的吸端，在距管口0.5cm处组成1~1.5cm的棉塞（制止外界及口中杂菌吸入管内，防备菌液等吸入口中）。

棉塞要塞得松紧适宜，既包管通气良好又不会滑入管内。

将塞好棉花的移液管的尖端，放在4~5cm宽的长纸条的一端，使管与纸条成约20～30。

夹角，折叠包装纸包住尖端，左手压紧移液管，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来，余下的纸条折叠打结，准备灭菌。

凭据实验所需，可单支也可多支包装。

图10.3移液管的包扎

（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程.北京：

北京大学出书社.1999）

（3）棉塞制作及试管、锥形瓶的包扎：

为了培养好气性微生物，需提供优良的通气条件，同时防备杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。

通常要领是在试管及锥形瓶口加上棉塞等。

制作棉塞时，应选用巨细、厚薄适中的棉花一块，用折叠卷塞法制作棉塞，见图10.4所示。

图10.4棉塞制作历程

（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程.北京：

北京大学出书社.1999）

按管口及瓶口巨细制作的棉塞，应紧贴管壁和瓶壁，不留漏洞，以防空气中的微生物沿漏洞侵入。

棉塞塞得不宜过松或过紧，以手提棉塞，器皿不掉为准。

棉塞的2/3应在管内或瓶内，1/3露在口外，以便拔塞。

塞好棉塞后，在棉塞外包一层报纸或牛皮纸（这是为了制止灭菌时冷凝水淋湿棉塞）并用细绵线捆扎好。

目前也有接纳金属或塑料试管帽取代棉塞，直接盖在试管口上，灭菌待用。

（4）培养基的制备

本实验要用到四种培养基：

测定细菌总数用营养琼脂培养基；测定大肠菌群用乳糖卵白胨培养基、三倍浓缩乳糖卵白胨培养基、伊红美蓝培养基。

①营养琼脂培养基：

牛肉浸膏3g，卵白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL、pH7.2～7.4。

制备：

称取各身分,放入蒸馏水中,加热溶解并补足蒸发的水分。

用10%NaOH调解pH。

装入锥形瓶中，塞上棉塞，包扎后待灭菌。

②乳糖卵白胨培养基：

卵白胨10g，牛肉浸膏3g，乳糖5g，氯化钠5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，蒸馏水1000mL，pH7.2~7.4。

制备：

称取卵白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠于1000mL蒸馏水中，加热溶解并补足蒸发的水分，用10%HCl、10%NaOH调解pH。

参加1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充实混匀后分装于置有小玻璃倒管的试管内，每管10mL，塞好棉塞、包扎。

115℃高压蒸汽灭菌20min。

③三倍浓缩乳糖卵白胨培养基：

除蒸馏水外，上液各身分均为三倍，制法同上，分装于置有小玻璃倒管的试管内，每管5mL；另分装于2支大试管内，每管50mL。

其余同上步。

④伊红美蓝培养基：

伊红美蓝琼脂40g，蒸馏水1000mL。

制备：

用药物天平称取40g伊红美蓝琼脂于1000mL蒸馏水中，加热溶解并补足蒸发的水分。

充实混匀后分装于锥形瓶中，塞好棉塞、包扎。

115℃高压蒸汽灭菌20min。

（5）灭菌

干热灭菌法：

培养皿、移液管、试管及其他玻璃器皿可用该法。

将上述物品包装好放入干烤箱中，当温度升至160℃后保持120min。

要注意温度不得凌驾170℃，不然包装纸会烧焦。

高压蒸汽灭菌法：

该法要使用高压灭菌锅。

微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）都可用此法灭菌。

具体步调如下：

①打开灭菌锅盖，从进水杯中向锅内参加适量的水（至量高水位的标示高度），然后把要灭菌的物品放入锅内（不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品），盖上锅盖，对角式拧紧螺栓，打开排气阀，封闭宁静阀。

②通电加热，在加热历程中，不停有水蒸汽从排气阀泄出，等锅内水沸腾后，再保持3~5min排气时间后封闭排气阀，此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽。

当压力上升到所需温度时开始计时。

通过调解热源，维持压力、温度。

到达灭菌时间后，停止加热。

③等锅上压力表指示为零后，打开排气阀，卸下锅盖，取出物品。

如果压力未降到零就打开排气阀，就会因锅内压力突降，使器皿中的培养基翻滚冲出，损失培养基及污染棉塞。

④将灭菌后的培养基置于恒温箱内，保持37℃作无菌培养1～2d，若无细菌生长说明灭菌及格，放入冰箱或阴凉处备用。

高压蒸汽灭菌锅种类和规格许多，以上操纵步调适用于立式高压蒸汽灭菌锅。

其它种类的灭菌锅应严格按说明书操纵。

图10.5高压蒸汽灭菌锅结构

（引自钱存柔、黄仪秀.微生物学实验教程.北京：

北京大学出书社.1999）

10.3.2水中细菌总数及大肠菌群的测定

10.3.2.1实验目的

学习水中细菌总数的测定要领；了解平板菌落计数原则；掌握用多管发酵法测定水中总大肠菌群数量的要领；了解总大肠菌群的数量在饮水中的重要性；掌握平板划线分散技能。

10.3.2.2实验原理

细菌总数（CFU）是指1mL水样在营养琼脂培养基中，于37℃培养24h后所生长的细菌菌落的总数。

是应用平板计数技能进行测定的。

水中的细菌总数可以作为水体的卫生状况和污染水平的指标。

大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。

大肠菌群是肠道最普遍存在和数量最多、且与多数肠道病原菌存活期相近、并易于培养、视察的一群需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

故被定为查验肠道致病菌的指示菌，作为水体受粪便污染及其污染水平的指标。

一般接纳管发酵法测定。

我国饮用水卫生尺度划定：

1mL自来水中细菌总数不能凌驾100个；每升自来水中大肠菌群数不得凌驾3个。

10.3.2.3水样的收罗和处理

（1）自来水的收罗：

将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧5~10分钟灭菌，然后再放水流5分钟，以排除管道内的存水，再用无菌容器取水。

如果水样中含余氯，则采样瓶在灭菌前应预参加硫代硫酸钠溶液于瓶中（每500mL水样加3%硫代硫酸钠溶液1mL），以消除余氯的影响，制止其继承存在产生杀菌作用。

（2）河湖水、井水、海水和其他水样的收罗：

可用特制的采样器。

采样器的种类许多，图10-5是其中的一种。

采样器外部是一金属框，内装玻璃瓶，器底有沉坠，可按需要坠入一定的深度，瓶盖系有绳索控制瓶盖启闭，拉起绳索即打开瓶盖装水，松放绳索即自行盖上。

取样前应对玻璃瓶作灭菌处理惩罚。

采样时将采样器浸入水中，使瓶口位于水面下10~15cm处。

水样收罗后，将水瓶取出待检。

图10.6采样器

（引自李军、王淑莹.水科学与工程实验技能.北京：

化学产业出书社.2002）

水样收罗后，迅速送回实验室进行查验。

水样收罗与查验隔断时间应在4h以内。

若来不及查验，应放在4℃冰箱内生存。

取样时要注明日期、温度、水的来源、情况状况、水的用途等。

10.3.2.4细菌总数的测定

（1）自来水的测定

用1mL无菌移液管吸取1mL水样，以无菌操纵方法注入无菌培养皿中。

至少做3个平皿。

另取一套无菌培养皿，做空白比较。

将10.3.1准备的营养琼脂培养基加热融化并冷却至45℃左右，以无菌操纵方法倾入每皿约15mL，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充实混匀。

冷却凝固后，将以上所有平板倒置于恒温箱中37℃培养24h，计菌落数。

算出3个平板上生长的菌落总数的平均值即为1mL水样中的细菌总数。

（2）水源水或其他水样的测定

稀释水样：

在无菌操纵下，以10倍法稀释水样。

如取3支无菌空试管，分别参加9mL灭菌水。

取1mL水样注入第一管9mL灭菌水内，摇匀；再从第一管中取1mL水至第二管，摇匀；如此稀释到第三管，则稀释度分别为10-1、10-2、10-3。

稀释倍数视水质而定，以培养后平板的菌落数在30~300个之间的稀释度最为符合。

一般中等污染水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度。

若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继承稀释或减小稀释倍数。

接种培养：

用无菌移液管吸取三个适宜浓度的稀释液1mL分别参加无菌培养皿中，每一稀释度做2个平行，共6个。

以下操纵与自来水的检测步调相同。

（3）菌落计数要领即陈诉方法

用肉眼视察，计各浓度的2个平板的菌落总数，并盘算平均菌落数。

凭据种种差别情况接纳差别的盘算方法陈诉结果。

有以下几种情况：

①首先选择平均菌落数在30~300之间者进行盘算。

当只有1个稀释度的平均菌落数在此范畴时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数陈诉之（表10.1例1）。

②若有2个稀释度的平均菌落数在30~300之间时，则按两者的菌落总数之比来决定，若比值小于2应陈诉两者的平均数；若大于2则陈诉其中较小的菌落总数（表10.1例2、3）。

③若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数陈诉之（表10.1例4）。

④若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数陈诉之（表10.1例5）。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最靠近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数陈诉之（表10.1例6）。

⑥若所有的菌落数匀为“无法计数”时，应注明水样的最大稀释倍数。

（表10.1例7）