第二十二章免疫学检测技术及其应用.ppt

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第二十二章第二十二章免疫学检测技术的基本原理免疫学检测技术的基本原理教学大纲教学大纲掌握掌握掌握掌握体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素；体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素；体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素；体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素；抗原抗体体外反应的类型。

抗原抗体体外反应的类型。

抗原抗体体外反应的类型。

抗原抗体体外反应的类型。

熟悉熟悉熟悉熟悉抗原抗体反应的检测方法；抗原抗体反应的检测方法；抗原抗体反应的检测方法；抗原抗体反应的检测方法；免疫细胞的分离技术；免疫细胞的分离技术；免疫细胞的分离技术；免疫细胞的分离技术；免疫细胞功能的测定。

免疫细胞功能的测定。

免疫细胞功能的测定。

免疫细胞功能的测定。

了解了解了解了解免疫学检测方法的应用。

免疫学检测方法的应用。

免疫学检测方法的应用。

免疫学检测方法的应用。

第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素一、抗原一、抗原-抗体反应的特点及检测原则抗体反应的特点及检测原则特点：

特点：

1.1.高度特异性高度特异性2.2.表面化学基团之间的可逆结合表面化学基团之间的可逆结合3.3.适宜的抗原抗体浓度和比例适宜的抗原抗体浓度和比例4.4.抗原抗体反应的两个阶段：

抗原抗体反应的两个阶段：

11）抗原抗体特异性结合阶段抗原抗体特异性结合阶段22）可见反应阶段可见反应阶段一、抗原一、抗原-抗体反应的特点抗体反应的特点11、高度特异性高度特异性：

抗原表位与抗体分子抗原表位与抗体分子CDRCDR的互补结合是抗原的互补结合是抗原-抗抗体反应的化学本质。

体反应的化学本质。

22、表面化学基团的可逆性、表面化学基团的可逆性抗原与相应抗体除空间构型具有互补性外，抗原与相应抗体除空间构型具有互补性外，两者主要是通过分子表面的氢键、疏水键、静两者主要是通过分子表面的氢键、疏水键、静电和范德华力非共价结合。

电和范德华力非共价结合。

亲合力（亲合力（avidity）:

指抗体分子的抗原结合部位与抗原表位之间指抗体分子的抗原结合部位与抗原表位之间的结合强度的结合强度在一定浓度范围内，二者比例合适，可出现在一定浓度范围内，二者比例合适，可出现肉眼可见的反应物；肉眼可见的反应物；若比例不合适，即抗原或抗体过剩时，可形若比例不合适，即抗原或抗体过剩时，可形成小分子抗原成小分子抗原-抗体复合物。

此种小分子复合物抗体复合物。

此种小分子复合物多呈游离状态，不能为肉眼所见。

多呈游离状态，不能为肉眼所见。

33、适宜的抗原抗体浓度和比例、适宜的抗原抗体浓度和比例44、抗原、抗原-抗体反应的两个阶段抗体反应的两个阶段抗原抗原-抗体特异性结合阶段：

抗体特异性结合阶段：

特点：

反应快，数秒钟至几分钟内完成。

特点：

反应快，数秒钟至几分钟内完成。

反应可见阶段：

反应可见阶段：

特点：

所需时间较长，从数分钟、数小时到特点：

所需时间较长，从数分钟、数小时到数日不等，且受电解质、温度和酸碱度等因数日不等，且受电解质、温度和酸碱度等因素影响。

素影响。

1.1.电解质：

电解质：

在电解质作用下，抗原在电解质作用下，抗原-抗体复合物失抗体复合物失去较多负电荷，使彼此连接出现肉眼可见的去较多负电荷，使彼此连接出现肉眼可见的凝集或沉淀现象。

凝集或沉淀现象。

试验中常用试验中常用0.85%的的NaCl溶液作为溶液作为稀释液，提供适当浓度的电解质。

稀释液，提供适当浓度的电解质。

二、抗原二、抗原-抗体反应的影响因素抗体反应的影响因素提高浓度可增加抗原与抗体分子碰撞机会，提高浓度可增加抗原与抗体分子碰撞机会，加速抗原加速抗原-抗体复合物的形成。

抗体复合物的形成。

通常抗原通常抗原-抗体反应的最适温度是抗体反应的最适温度是37。

2.2.温度温度3.3.酸碱度酸碱度抗原抗原-抗体反应的最适抗体反应的最适pH值在值在6-86-8之间。

之间。

pH过高或过低，均可影响抗原或抗体的理化性过高或过低，均可影响抗原或抗体的理化性状，影响试验的可靠性。

状，影响试验的可靠性。

三、抗原三、抗原-抗体反应类型和检测方法抗体反应类型和检测方法1.1.凝集反应凝集反应2.2.沉淀反应沉淀反应3.3.免疫标记技术免疫标记技术根据抗原的性质、参与反应的成分和反应呈现的结果，根据抗原的性质、参与反应的成分和反应呈现的结果，将抗原将抗原-抗体反应分为四类：

抗体反应分为四类：

（一）凝集反应

（一）凝集反应直接凝集：

玻片法、试管法直接凝集：

玻片法、试管法间接凝集间接凝集间接乳胶凝集：

间接乳胶凝集：

ASO试验、试验、RF试验试验间接血球凝集：

间接血球凝集：

间接凝集抑制试验：

免疫妊娠试验间接凝集抑制试验：

免疫妊娠试验Coombs试验试验：

直接法、间接法：

直接法、间接法

（一）凝集反应：

（一）凝集反应：

概念：

概念：

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝集现象。

可见的凝集现象。

类型：

类型：

11、直接凝集反应、直接凝集反应（directagglutination）概念：

颗粒性抗原直接与相应抗体结合出现的凝集现象。

概念：

颗粒性抗原直接与相应抗体结合出现的凝集现象。

检测方法：

检测方法：

（11）玻片法：

）玻片法：

特点特点定性试验；定性试验；用已知抗体检测未知抗原；用已知抗体检测未知抗原；本法简捷快速；本法简捷快速；（22）试管法：

）试管法：

特点特点半定量试验；半定量试验；用已知抗原检测未知抗体的相对含量。

用已知抗原检测未知抗体的相对含量。

应用应用肥达反应肥达反应伤寒或副伤寒；伤寒或副伤寒；外斐氏反应外斐氏反应立克次体病立克次体病瑞特反应瑞特反应布氏菌病布氏菌病22、间接凝集反应、间接凝集反应（indirectagglutination）概念：

将已知可溶性抗原或抗体与免疫无关的载体颗粒结合形成致敏颗概念：

将已知可溶性抗原或抗体与免疫无关的载体颗粒结合形成致敏颗粒后，再与相应抗体或抗原进行反应出现的凝集现象。

粒后，再与相应抗体或抗原进行反应出现的凝集现象。

应用应用抗链抗链“O”试验（试验（ASO）风湿病风湿病类风湿因子测定（类风湿因子测定（RF试验）试验）类风湿性关节炎（类风湿性关节炎（RA）22、沉淀反应沉淀反应速率散射比浊速率散射比浊/免疫比浊免疫比浊琼脂扩散琼脂扩散单向琼脂扩散单向琼脂扩散双向琼脂扩散双向琼脂扩散免疫电泳技术免疫电泳技术免疫电泳免疫电泳火箭免疫电泳火箭免疫电泳对流免疫电泳对流免疫电泳特点：

定量试验；敏感性较高。

特点：

定量试验；敏感性较高。

应用：

应用：

测定血清中测定血清中IgG、IgM、IgA等含等含量和量和C3、C4等补体含量等补体含量（11）单向琼脂扩散试验）单向琼脂扩散试验（singleagardiffusion）单项琼脂扩散试验：

单项琼脂扩散试验：

定量测定血清中定量测定血清中IgG、M、A和单一补体含量和单一补体含量方法与原理方法与原理22、双向琼脂扩散试验、双向琼脂扩散试验（doubleagardiffusion）应用应用

（1）定性试验：

定性试验：

鉴定可溶性抗原和抗体。

鉴定可溶性抗原和抗体。

分析复杂抗原成分和抗体分析复杂抗原成分和抗体

（2）半定量试验：

免疫血清稀释后进行的血清）半定量试验：

免疫血清稀释后进行的血清效价测定。

效价测定。

优点：

敏感性同单扩散；所需时间短。

优点：

敏感性同单扩散；所需时间短。

应用：

快速测定标本中可溶性抗原的含量。

应用：

快速测定标本中可溶性抗原的含量。

44火箭电泳火箭电泳（rocketelectrophoresis）又称电泳免疫扩散又称电泳免疫扩散免疫荧光技术免疫荧光技术免疫组化技术免疫组化技术免疫印迹技术免疫印迹技术Westernblotting法法免疫层析技术免疫层析技术金标免疫层析法金标免疫层析法免疫测定技术免疫测定技术酶免疫测定法：

酶免疫测定法：

ELISA放射免疫测定法放射免疫测定法化学发光免疫分析化学发光免疫分析酶免疫组化技术酶免疫组化技术免疫胶体金技术免疫胶体金技术免疫电镜技术免疫电镜技术3、免疫标记技术免疫标记技术第三节第三节免疫细胞的检测免疫细胞的检测一、免疫细胞的分离一、免疫细胞的分离

（一）外周血单个核细胞的分离

（一）外周血单个核细胞的分离

（二）淋巴细胞及其亚群的分离

（二）淋巴细胞及其亚群的分离1.1.玻璃粘附分离法玻璃粘附分离法2.2.尼龙毛分离法尼龙毛分离法3.3.E花结分离法花结分离法4.4.免疫吸附分离法（洗淘法）免疫吸附分离法（洗淘法）5.5.免疫磁珠分离法（免疫磁珠分离法（IMB法）法）6.6.流式细胞术分离法流式细胞术分离法常用的分离方法：

常用的分离方法：

葡聚糖葡聚糖-泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密泛影葡胺（又称淋巴细胞分离液）密度梯度离心法。

度梯度离心法。

一、外周血单个核细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheralbloodmononuclearcells,PBMC）包括淋巴细胞和单核）包括淋巴细胞和单核细胞，它们是免疫学实验中最常用的细胞。

细胞，它们是免疫学实验中最常用的细胞。

二、淋巴细胞及其亚群的分离二、淋巴细胞及其亚群的分离2、免疫磁珠（、免疫磁珠（immunemagneticbead，IMB）分离法：

）分离法：

将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋将已知抗淋巴细胞表面标志的抗体包被聚苯乙烯培养板，加入淋巴细胞悬液，使表达相应表面标志的淋巴细胞结合在培养板上，洗脱巴细胞悬液，使表达相应表面标志的淋巴细胞结合在培养板上，洗脱后即可获得具有相应表面标志的淋巴细胞。

后即可获得具有相应表面标志的淋巴细胞。

例例用抗用抗CD4抗体包被聚苯乙烯培养板，可将抗体包被聚苯乙烯培养板，可将CD4+T细胞与细胞与CD8+T细胞相分离。

细胞相分离。

1、免疫吸附分离法（洗淘法）：

、免疫吸附分离法（洗淘法）：

免疫磁珠由抗淋巴细胞表面标志的抗体与磁性微珠交联结合组成。

免疫磁珠由抗淋巴细胞表面标志的抗体与磁性微珠交联结合组成。

将免疫磁珠加入细胞悬液中后，可使表达相应表面标志的淋巴细胞将免疫磁珠加入细胞悬液中后，可使表达相应表面标志的淋巴细胞与之结合。

然后，在磁场作用下，结合相应淋巴细胞的免疫磁珠吸附在与之结合。

然后，在磁场作用下，结合相应淋巴细胞的免疫磁珠吸附在靠近磁铁的管壁上。

弃去悬液中游离的细胞，将免疫磁珠结合的细胞分靠近磁铁的管壁上。

弃去悬液中游离的细胞，将免疫磁珠结合的细胞分离，即可获得具有某种表面标志的淋巴细胞。

离，即可获得具有某种表面标志的淋巴细胞。

该法所获细胞纯度高（该法所获细胞纯度高（93%-99%），活细胞率），活细胞率95%，比流式细，比流式细胞术省时、费用低，操作简单。

胞术省时、费用低，操作简单。

荧光激活细胞分类仪（简称流式细胞仪）集光学、流体力学、电力学和计荧光激活细胞分类仪（简称流式细胞仪）集光学、流体力学、电力学和计算机技术于一体，可对细胞作多参数定量测定和综合分析。

算机技术于一体，可对细胞作多参数定量测定和综合分析。

是借助荧光激活细胞分类仪是借助荧光激活细胞分类仪（fluorescenceactivatedcellsorter,FACS）将荧光）将荧光抗体标记的细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。

抗体标记的细胞进行快速准确鉴定和分类的技术。

3、流式细胞术（、流式细胞术（flowcytometry）分离法：

）分离法：

程序原理程序原理将待测细胞悬液与荧光素标记的抗体反应后，在压力作用下（细胞）排成将待测细胞悬液与荧光素标记的抗体反应后，在压力作用下（细胞）排成单列经喷嘴喷出形成液滴射流（每个液滴包裹一个细胞）；在液滴射流与高速单列经喷嘴喷出形成液滴射流（每个液滴包裹一个细胞）；在液滴射流与高速聚焦激光束相交处，液滴中细胞受激发光照射可产生散射光并激发各种荧光信聚焦激光束相交处，液滴中细胞受激发光照射可产生散射光并激发各种荧光信号；荧光信号被光电检测器接受可转化为电信号；电信号经加工处理存储于计号；荧光信号被光电检测器接受可转化为电信