分子生物学常用技术(简化版).ppt
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z第第第第1919章:
分子生物学常用技术章:
分子生物学常用技术章:
分子生物学常用技术章:
分子生物学常用技术44学时学时学时学时y分子杂交、分子杂交、分子杂交、分子杂交、PCRPCR、基因测序、基因测序、基因测序、基因测序y蛋白质研究技术蛋白质研究技术蛋白质研究技术蛋白质研究技术(双向电泳,酵母双杂交双向电泳,酵母双杂交双向电泳,酵母双杂交双向电泳,酵母双杂交)y基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除基因转移与基因剔除(含含含含RNARNA干扰干扰干扰干扰)z第第第第2020章:
基因工程章:
基因工程章:
基因工程章:
基因工程44学时学时学时学时z第第第第2121章:
基因诊断与基因治疗章:
基因诊断与基因治疗章:
基因诊断与基因治疗章:
基因诊断与基因治疗44学时学时学时学时第四篇:
分子生物学技术与应用第四篇:
分子生物学技术与应用第十九章第十九章分子生物学常用技术分子生物学常用技术分子生物学技术能帮助我们干什么?
分子生物学技术能帮助我们干什么?
z揭示生物大分子揭示生物大分子揭示生物大分子揭示生物大分子(DNA(DNA、RNARNA、蛋白质、蛋白质、蛋白质、蛋白质)的结构与功能的结构与功能的结构与功能的结构与功能yDNADNA水平:
基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平:
基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平:
基因序列分析、拷贝数和染色体定位水平:
基因序列分析、拷贝数和染色体定位yRNARNA水平:
定量分析、基因表达产物的可变剪接水平:
定量分析、基因表达产物的可变剪接水平:
定量分析、基因表达产物的可变剪接水平:
定量分析、基因表达产物的可变剪接分析分析分析分析y蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质水平:
蛋白质定量、定位、功能水平:
蛋白质定量、定位、功能水平:
蛋白质定量、定位、功能水平:
蛋白质定量、定位、功能y细胞细胞细胞细胞与与与与整体整体整体整体水平:
基因在活体中的功能水平:
基因在活体中的功能水平:
基因在活体中的功能水平:
基因在活体中的功能z目的:
了解疾病发生的规律,提供治疗与预防手段目的:
了解疾病发生的规律,提供治疗与预防手段目的:
了解疾病发生的规律,提供治疗与预防手段目的:
了解疾病发生的规律,提供治疗与预防手段我们需要了解和掌握哪些基本技术?
我们需要了解和掌握哪些基本技术?
z基本技术:
基本技术:
基本技术:
基本技术:
y核酸:
测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸:
测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸:
测序、印迹、杂交、体外扩增技术核酸:
测序、印迹、杂交、体外扩增技术y蛋白质:
电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质:
电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质:
电泳与印迹、组学技术、相互作用蛋白质:
电泳与印迹、组学技术、相互作用z综合技术:
综合技术:
综合技术:
综合技术:
y基因工程技术基因工程技术基因工程技术基因工程技术y转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术转基因生物与基因敲除技术z应用技术:
应用技术:
应用技术:
应用技术:
y基因诊断基因诊断基因诊断基因诊断y基因治疗基因治疗基因治疗基因治疗zMolecularhybridizationMolecularhybridization:
利用已知核酸序列利用已知核酸序列利用已知核酸序列利用已知核酸序列(探针探针探针探针/probeprobe)检测与其互补的检测与其互补的检测与其互补的检测与其互补的未知核酸序列未知核酸序列未知核酸序列未知核酸序列z用途:
用途:
用途:
用途:
y确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性确认核酸序列间同源性y对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量对特定核酸序列进行定量y自核酸混合体中辨认特定核酸序列自核酸混合体中辨认特定核酸序列自核酸混合体中辨认特定核酸序列自核酸混合体中辨认特定核酸序列第一节:
核酸分子杂交第一节:
核酸分子杂交一、基本原理一、基本原理变性变性变性变性(denaturedenature)复性复性复性复性(renaturerenature)杂交杂交杂交杂交(hybiridizationhybiridization)核酸核酸变性变性z在特定变性因素作用下,在特定变性因素作用下,在特定变性因素作用下,在特定变性因素作用下,DNADNA双螺旋解离的过程双螺旋解离的过程双螺旋解离的过程双螺旋解离的过程z破坏氢键与疏水作用可导致变性破坏氢键与疏水作用可导致变性破坏氢键与疏水作用可导致变性破坏氢键与疏水作用可导致变性热变性:
热变性:
热变性:
热变性:
高温高温高温高温可使核酸变性,温度高于可使核酸变性,温度高于可使核酸变性,温度高于可使核酸变性,温度高于9090时任时任时任时任何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性何核酸双链都将变性酸碱变性:
酸碱变性:
酸碱变性:
酸碱变性:
pH3pH11pH11时核酸将变性,时核酸将变性,时核酸将变性,时核酸将变性,DNADNA使用碱变性使用碱变性使用碱变性使用碱变性,RNARNA则不可则不可则不可则不可化学试剂变性:
能够破坏氢键的化学试剂如化学试剂变性:
能够破坏氢键的化学试剂如化学试剂变性:
能够破坏氢键的化学试剂如化学试剂变性:
能够破坏氢键的化学试剂如尿素尿素尿素尿素或或或或甲酰胺甲酰胺甲酰胺甲酰胺可使核酸变性可使核酸变性可使核酸变性可使核酸变性变性温度变性温度zzTmTm:
meltingtemperaturemeltingtemperature,解链温度或变性温度,解链温度或变性温度,解链温度或变性温度,解链温度或变性温度zz影响变性温度的因素:
影响变性温度的因素:
影响变性温度的因素:
影响变性温度的因素:
yy溶液的离子强度溶液的离子强度溶液的离子强度溶液的离子强度xx变性温度与离子强度变性温度与离子强度变性温度与离子强度变性温度与离子强度正相关,低盐利于变性正相关,低盐利于变性正相关,低盐利于变性正相关,低盐利于变性yyDNADNA分子的分子的分子的分子的GCGC含量含量含量含量xxGCGC(Tm(Tm69.3)2.2469.3)2.24核酸复核酸复性性z变性的变性的变性的变性的DNADNA单链相互识别并结合,恢复其天然双单链相互识别并结合,恢复其天然双单链相互识别并结合,恢复其天然双单链相互识别并结合,恢复其天然双螺旋结构的过程螺旋结构的过程螺旋结构的过程螺旋结构的过程z复性类似与化学反应,需要一定反应时间复性类似与化学反应,需要一定反应时间复性类似与化学反应,需要一定反应时间复性类似与化学反应,需要一定反应时间影响影响DNA复性速度的因素复性速度的因素zDNADNA分子的浓度:
浓度高,复性快分子的浓度:
浓度高,复性快分子的浓度:
浓度高,复性快分子的浓度:
浓度高,复性快zDNADNA分子的长度:
长片段复性速度慢分子的长度:
长片段复性速度慢分子的长度:
长片段复性速度慢分子的长度:
长片段复性速度慢zDNADNA分子的复杂性:
重复序列复性速度快分子的复杂性:
重复序列复性速度快分子的复杂性:
重复序列复性速度快分子的复杂性:
重复序列复性速度快不同物种不同物种不同物种不同物种CC00tt曲线比较曲线比较曲线比较曲线比较人类基因组人类基因组人类基因组人类基因组CC00tt曲线曲线曲线曲线二、核酸探针二、核酸探针zProbeProbe:
用于测定未知核酸片段的已知序列:
用于测定未知核酸片段的已知序列:
用于测定未知核酸片段的已知序列:
用于测定未知核酸片段的已知序列z探针为探针为探针为探针为DNADNA或或或或RNARNA,可以为可以为可以为可以为单链单链单链单链或或或或双链双链双链双链z探针必需经过标记探针必需经过标记探针必需经过标记探针必需经过标记:
放射性标记放射性标记放射性标记放射性标记或或或或非放射性标记非放射性标记非放射性标记非放射性标记1.探针有哪些种类?
探针有哪些种类?
zDNADNA探针探针探针探针:
常规探针:
常规探针:
常规探针:
常规探针利用基因组利用基因组利用基因组利用基因组DNADNA序列或序列或序列或序列或cDNAcDNA序列合成的探序列合成的探序列合成的探序列合成的探针,一般为双链,也可制备成单链针,一般为双链,也可制备成单链针,一般为双链,也可制备成单链针,一般为双链,也可制备成单链zRNARNA探针探针探针探针:
高灵敏度:
高灵敏度:
高灵敏度:
高灵敏度探针探针探针探针一般是通过体外转录而来,均为单链一般是通过体外转录而来,均为单链一般是通过体外转录而来,均为单链一般是通过体外转录而来,均为单链z寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸探针探针探针探针(oligooligo-nucleotide-nucleotide):
用于用于用于用于点突变检测点突变检测点突变检测点突变检测人工合成的短序列人工合成的短序列人工合成的短序列人工合成的短序列(20nt)(20nt),可自由选择序列,可自由选择序列,可自由选择序列,可自由选择序列2.标记物有哪些?
标记物有哪些?
z标记物的要求:
标记物的要求:
标记物的要求:
标记物的要求:
y高度的高度的高度的高度的灵敏性灵敏性灵敏性灵敏性:
足以检测到极微量的核酸序列:
足以检测到极微量的核酸序列:
足以检测到极微量的核酸序列:
足以检测到极微量的核酸序列y高度的高度的高度的高度的特异性特异性特异性特异性:
足以在大量非特异性序列中检:
足以在大量非特异性序列中检:
足以在大量非特异性序列中检:
足以在大量非特异性序列中检测到特异的靶序列测到特异的靶序列测到特异的靶序列测到特异的靶序列z标记物的种类:
标记物的种类:
标记物的种类:
标记物的种类:
y放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素(radioisotoperadioisotope)y非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物(non-radioactivelabelnon-radioactivelabel)放射性同位素放射性同位素z特点:
灵敏度最高的标记物,足以检测到飞克特点:
灵敏度最高的标记物,足以检测到飞克特点:
灵敏度最高的标记物,足以检测到飞克特点:
灵敏度最高的标记物,足以检测到飞克级微级微级微级微量的核酸序列量的核酸序列量的核酸序列量的核酸序列gmggngpgfggmggngpgfgz常用的放射性同位素常用的放射性同位素常用的放射性同位素常用的放射性同位素放射性标记的核苷酸单体放射性标记的核苷酸单体zdNTPdNTPorNTPorNTPz5or3P5or3P3232labellinglabelling非放射性标记物非放射性标记物z特点:
安全且易于存放,但灵敏度与特异性均不及特点:
安全且易于存放,但灵敏度与特异性均不及特点:
安全且易于存放,但灵敏度与特异性均不及特点:
安全且易于存放,但灵敏度与特异性均不及放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素y地高辛:
地高辛:
地高辛:
地高辛:
通过地高辛抗体结合并检测通过地高辛抗体结合并检测通过地高辛抗体结合并检测通过地高辛抗体结合并检测y生物素:
生物素:
生物素:
生物素:
结合亲和素结合亲和素结合亲和素结合亲和素/链亲和素链亲和素链亲和素链亲和素(avidinavidin/streptavidinstreptavidin)y化学发光物质:
通过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质:
通过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质:
通过紫外激发或化学反应而发光化学发光物质:
通过紫外激发或化学反应而发光y电子密度标记物:
金等重金属电子密度标记物:
金等重金属电子密度标记物:
金等重金属电子密度标记物:
金等重金属3.如何检测杂交信号?
如何检测杂交信号?
z同位素标记物:
同位素标记物:
同位素标记物:
同位素标记物:
y盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器盖革计数器、液体闪烁计数器y放射自显影放射自显影放射自显影放射自显影(autoradiographyautoradiography)如何检测杂交信号?
如何检测杂交信号?
z非放射性标记物:
非放射性标记物:
非放射性标记物:
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- 分子生物学 常用 技术 简化