体外抗菌实验-18.ppt

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第十九章第十九章药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验药物的体外抗菌试验antimicrobialtestinvitro药物的体外抗菌试验是在体外测定微生物对药物的体外抗菌试验是在体外测定微生物对药物敏感程度的试验，药物敏感程度的试验，已广泛地应用于科研、生产和临床。

如抗菌药物的已广泛地应用于科研、生产和临床。

如抗菌药物的筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、药物含量的测筛选、提取过程中的追踪、抗菌谱的定、药物含量的测定、药物血浓度测定、指导临床用药的药敏试验等。

定、药物血浓度测定、指导临床用药的药敏试验等。

抗菌试验包括抑菌试验和杀菌试验。

抗菌试验包括抑菌试验和杀菌试验。

抑菌：

抑菌：

即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微生物，生物，在药物除去后微生物又能生长在药物除去后微生物又能生长.杀菌：

杀菌：

即能杀死微即能杀死微生物，当药物除去后，微生生物，当药物除去后，微生物也不物也不能再生长繁殖。

能再生长繁殖。

第一节第一节常用的体外抑菌试验常用的体外抑菌试验连续稀释法色连续稀释法色serialdilutiontest可用于测定药物的最低抑菌浓度可用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀和最低杀菌浓度菌浓度（MBC）。

可以用液体培养基，也可用固体培养。

可以用液体培养基，也可用固体培养基。

基。

1液体培养基连续稀释法液体培养基连续稀释法（见下图见下图）2固体培养基连续稀释法固体培养基连续稀释法分平板法和斜面分平板法和斜面法。

法。

琼脂扩散法琼脂扩散法agardiffusiontest是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药是利用药物可以在琼脂培养基中扩散，在药物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以物有效浓度的范围内形成抑菌圈或抑菌距离，以抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作抑菌圈直径或抑菌距离的大小来评价药物抗菌作用强弱。

用强弱。

inhibitionzones1、滤纸片法、滤纸片法适用于新药的初筛试验适用于新药的初筛试验。

2打孔法打孔法适于药物血浓度的监测。

适于药物血浓度的监测。

3挖沟法挖沟法适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验适用于在一个平板上试验一种药物对几种试验菌的抗菌作用。

菌的抗菌作用。

第二节第二节杀菌试验杀菌试验用以评价药物对微生物的致死活性用以评价药物对微生物的致死活性。

最低杀菌浓度：

最低杀菌浓度：

指该药物能杀死细菌的最低浓度。

从对微生指该药物能杀死细菌的最低浓度。

从对微生物广义而言，也可称之为最低致死浓度物广义而言，也可称之为最低致死浓度（MLC）。

是将待检药物先以合适的液体培养基在试管内进行连续稀释，每管内再加入一定量的试验菌液，培养后可得该药物的MIC，取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别移种于另一无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度即为该药物的MBC（或MLC）。

活菌计数法活菌计数法是在一定浓度的定量药物内加入定量的试验菌，是在一定浓度的定量药物内加入定量的试验菌，作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生作用一定时间后，取样进行活菌计数，从存活的微生物数计算出药物对微生物的致死率。

物数计算出药物对微生物的致死率。

石炭酸系数（又称酚系数）石炭酸系数（又称酚系数）是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用是以石炭酸为标准，在规定的试验条件下，作用一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门一定时间，将待测的化学消毒剂与石炭酸对伤寒沙门菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，菌或金黄色葡萄球菌的杀菌效力相比较，所得杀菌所得杀菌效力的比值。

效力的比值。

棋盘格法棋盘格法是由于在试验时，含两种不同浓度是由于在试验时，含两种不同浓度药物的试管排列呈棋盘状而得名，药物的试管排列呈棋盘状而得名，用以用以评价两种药物同时用不同浓度进行联合评价两种药物同时用不同浓度进行联合试验时的抗菌活性。

试验时的抗菌活性。

第三节第三节联合抗菌试验联合抗菌试验在药学上作中，常需检查两种抗菌药物在药学上作中，常需检查两种抗菌药物在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不在联合应用时的相互作用以及抗菌药物与不同同pH值或不同离子溶液的相互影响。

如加强值或不同离子溶液的相互影响。

如加强药物抗菌作用的为药物抗菌作用的为协同协同（synergism）；减弱药；减弱药物作用的为物作用的为拮抗拮抗（antagonism）；相互无影响；相互无影响的为的为无关无关（indjfference）；作用为二者之和；作用为二者之和的为的为累加累加（addition）。

纸条试验纸条试验即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有即在已接种试验菌的平板表面垂直放置两条各浸有一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或一种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱或无影响来判断它们在联合应用时的效应。

无影响来判断它们在联合应用时的效应。

梯度平板纸条试验梯度平板纸条试验需先制备含药的梯度平板。

将试验菌悬液涂布于需先制备含药的梯度平板。

将试验菌悬液涂布于平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板平板表面，取滤纸条浸透另一待检药液，按梯度平板中药物浓度递减的方向置于平板表面。

培养后，如该中药物浓度递减的方向置于平板表面。

培养后，如该待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条待检药液对平板内的药物有加强作用，则可见沿纸条两边的抑菌区被扩大。

两边的抑菌区被扩大。

第四节第四节体外抗菌试验的影响因素体外抗菌试验的影响因素1试验菌试验菌在抗菌试验中所用试验菌一般应该用标在抗菌试验中所用试验菌一般应该用标准菌株。

准菌株。

2培养基培养基培养基的质量须加控制。

培养基的质量须加控制。

3抗菌药物抗菌药物药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的药物的浓度和总量直接影响抗菌试验的结果，需要精确配制。

结果，需要精确配制。

第二十章第二十章药物制剂的微生物学检查药物制剂的微生物学检查药物制剂的微生物学检查药物制剂的微生物学检查药物制剂的微生物学检查主要包括药物制剂的微生物学检查主要包括:

规定灭菌药品规定灭菌药品-无菌检验无菌检验非规定灭菌药品非规定灭菌药品-微生物限度检查微生物限度检查第一节无菌检查一、无菌检查的概念及应用范围

（一）概念p333

（二）无菌检查的基本原则采用严格的无菌操作方法，将被检查的药品取一定量分别接种于适合各种微生物生长的不同培养基中（通常为需氧菌培养基、厌氧菌培养基和真菌培养基），置适宜温度下培养一定时间后，观察有无微生物生长，以判断被检药品是否合格。

由于无菌检查是用部分样本的结果推断整体的含菌情况，故被检药品的取样及程序必须按照国家药典的规定进行。

（三）应用范围1各种注射制剂2眼用及外伤用制剂3植入剂4可吸收的止血剂5外科用敷料及器材第二节第二节无菌制剂的无菌检查无菌制剂的无菌检查

（一）一般药品的无菌检查

（一）一般药品的无菌检查一般药品的无菌检查法属于一般药品的无菌检查法属于直接接种法直接接种法，即，即将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌将检品按规定量直接分别接种于适宜需氧菌、厌氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时氧菌和真菌生长繁殖的一定量的培养基中，同时以同样的培养基作以同样的培养基作阳性对照试验阳性对照试验。

我国药典规定以我国药典规定以金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、生袍梭状芽胞杆菌、生袍梭状芽胞杆菌CMCC（B）64941、白、白假丝酵母菌假丝酵母菌CMCC（F）98001作为需氧菌、厌氧作为需氧菌、厌氧菌和真菌的阳性对照菌株。

菌和真菌的阳性对照菌株。

然后分别按不同的需要条件培养一定时然后分别按不同的需要条件培养一定时间间,如需氧菌、厌氧菌在如需氧菌、厌氧菌在3035培养培养5天天,真菌在真菌在2025培养培养7天天.观察结果时观察结果时,阳性对照必须长菌阳性对照必须长菌,才能判定供试品是否才能判定供试品是否合格合格;若阳性对照管不长菌若阳性对照管不长菌,说明该药物说明该药物可能有抗菌作用或是油剂等特殊制剂可能有抗菌作用或是油剂等特殊制剂,还还应考虑实验条件的合用性应考虑实验条件的合用性.

（二）特殊药品的无菌检查法

（二）特殊药品的无菌检查法如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处理如果阳性对照管不长菌，则必须进行特殊处理后方可按照一般药品的无菌检查法进行。

后方可按照一般药品的无菌检查法进行。

1油类药物的无菌检查油类药物的无菌检查一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的一般油剂因与常规培养基不混溶，药品中的微生物不易生长，所以一般可采用微生物不易生长，所以一般可采用吐温吐温（聚山梨酯聚山梨酯）培养基培养基，其余同一般药品无菌检查法。

，其余同一般药品无菌检查法。

2抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查抗菌药物或含防腐剂药物的无菌检查如果被检药品具有抗菌作用，阳性对照管及试验如果被检药品具有抗菌作用，阳性对照管及试验管均可能不长菌。

因此在进行无菌检查前必须采用一管均可能不长菌。

因此在进行无菌检查前必须采用一些方法除去药物本身的抗菌作用，然后再依上述方法些方法除去药物本身的抗菌作用，然后再依上述方法进行无菌检查。

进行无菌检查。

（1）加入灭活剂加入灭活剂:

e.g.在青霉素的无菌检查时在青霉素的无菌检查时,加加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液,然后再按一然后再按一般方法进行无菌检查般方法进行无菌检查.

（2）微孔滤膜法微孔滤膜法（3）稀释法稀释法（4）离心沉淀法离心沉淀法第三节第三节-口服药及外用药物的微生物学口服药及外用药物的微生物学检查检查1概念概念2应用范围应用范围3供试品供试品

（1）供试品的一般要求供试品的一般要求

（2）供试液供试液p334二二常用微生物限度检查方法常用微生物限度检查方法目前对口服药及外用药物的微生物学检验主目前对口服药及外用药物的微生物学检验主要是微生物限度检验，即要是微生物限度检验，即:

（1）染菌量检查染菌量检查:

包括细菌总数、霉菌总数测定。

包括细菌总数、霉菌总数测定。

（2）控制菌检查：

大肠杆菌、沙门菌、金黄色控制菌检查：

大肠杆菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌等。

葡萄球菌、铜绿假单胞菌等。

我国规定的项目有：

我国规定的项目有：

细菌总数测定，霉菌总数测定。

病原菌细菌总数测定，霉菌总数测定。

病原菌（大肠埃希大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌和破伤风梭菌风梭菌）的检验和活螨的检验的检验和活螨的检验等。

等。

判断合格与否的标准是：

判断合格与否的标准是：

口服药及外用药中微生物总量须低于规定限量外，口服药及外用药中微生物总量须低于规定限量外，并须在并须在口服药物每克或每毫升中不得含有大肠埃希菌、口服药物每克或每毫升中不得含有大肠埃希菌、沙门菌；外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单沙门菌；外用药物每克或每毫升中不得含有铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风梭菌，此外均不得检胞菌、金黄色葡萄球菌和破伤风梭菌，此外均不得检出活螨出活螨。

细菌总数的测定细菌总数的测定:

是了解被检药品在单位重量或体积是了解被检药品在单位重量或体积（每克每克或每毫升或每毫升）内所含有的活菌数内所含有的活菌数（实际是需氧菌实际是需氧菌的活菌数的活菌数），以判断供试药物被细菌污染的程，以判断供试药物被细菌污染的程度，是对该药品整个生产过程的卫生学总评度，是对该药品整个生产过程的卫生学总评价的一个重要依据。

价的一个重要依据。

方法方法:

琼脂倾注平皿法琼脂倾注平皿法方法：

方法：

取一定量的供试品药物以无菌生理盐水按比取一定量的供试品药物以无菌生理盐水按比例进行系列稀释，加入定量的稀释液于无菌平皿例进行系列稀释，加入定量的稀释液于无菌平皿中，再加入一定量的已熔化的、温度在中，再加入一定量的已熔化的、温度在55左左右的琼脂培养基混匀，凝固后于右的琼脂培养基混匀，凝固后于37培养培养2448h,计数平板内菌落数。

一般取菌落数在计数平板内菌落数。

一般取菌落数在30300之间之间的平板进行计数，然后乘以稀释倍数即的平板进行计数，然后乘以稀释倍数即可得每毫