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整理siRNA和miRNA
siRNA和miRNA专题知识
撰写时间:
2006-10-2311:
05:
00
仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”?
但越来越多的证据清楚的表明,RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。
RNA干扰(RNAinterference)的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识,更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具,因此格外引人注意,在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。
随着对小分子RNA研究的不断深入,研究人员开始认识到:
小分子RNA的世界一点都不小。
有人推测:
小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。
小的干涉RNA(smallinterferingRNA;siRNA)和微小RNA(microRNA;miRNA)是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子,是小RNA的最主要组成部分,它们的相关性密切,既具有相似性,又具有差异性。
对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。
本文主要介绍这两种小RNA分子及其作用机理。
siRNA介绍
RNA干涉(RNAi)在实验室中是一种强大的实验工具,通过这种方式,利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱导序列特异的目标基因的沉默,迅速阻断基因活性。
小的干涉RNA(siRNA)是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA,由约20个碱基对组成,包括5个磷酸盐,2个核苷和3个悬臂。
SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用,是对特定信使RNA(mRNA)进行降解的指导要素。
1999年,Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21~25nt的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要,而在转基因正确表达的植株中则未出现。
随后,Hammond等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi中的作用,这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。
siRNA的3?
-末端2-nt的突出对靶点识别的特异性起一定的作用,可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。
两个研究小组以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展,科学进展已清晰地表明:
在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA(shorthairpinRNAs,shRNA)来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。
例如,在基因操作较困难的神经元中,也有成功进行RNAi的报道。
Krichevsky等将化学合成的21ntsiRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元,显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。
抑制神经元NO合成酶表达能有效降低疼痛,在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表达,获得RNA干扰的成功。
RNAi能在极低浓度(nmol范围)siRNA存在下显示出特殊有效性。
图1dsRNA可以沉默目标基因。
在植物中,通过注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重复序列可以诱导目标基因沉默。
在线虫中,沉默也可以用注射dsRNA的方式来诱导。
这两种生物体中,沉默是系统的并且传遍全身。
a)沉默信号从脉杆传到叶片组织。
绿色是绿色荧光蛋白;红色是叶绿素荧光,可以在绿色荧光蛋白被沉默后看出。
b,c)通过实验,使得线虫的核中表达绿色荧光蛋白。
实验者在左边加上对照dsRNA,右边加上绿色荧光蛋白的dsRNA。
一些神经元核仍然可以检测到荧光,对应于少量的蛋白质表达。
c)Hela细胞加上ORC6siRNA之后,针对微管蛋白(绿色)和DNA(红色)进行染色。
ORC6的去除导致多核细胞的积累。
稳定的沉默也可以通过表达发夹结构或者折回的双链RNA的表达来实现。
d)当和野生型的果蝇相比(右边),成体果蝇中表达控制白色基因的发夹同源物(左边)导致眼睛丧失色素。
miRNA介绍
miRNA的研究起始于时序调控小RNA(stRNAs)。
1993年,Lee等在秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegan)中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4,2002年,Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7,2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因,称为microRNA。
随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。
对一部分miRNAs的研究分析提示:
miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程,包括发育进程,造血过程,器官形成,凋亡,细胞增殖,甚至是肿瘤发生(Kim,2005)。
miRNAs是一种21-25nt长的单链小分子RNA,其结构特征如下:
广泛存在于真核生物中,是一组不编码蛋白质的短序列RNA,它本身不具有开放阅读框(ORF);成熟的miRNA,5′端有一个磷酸基团,3′端为羟基,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成,不同于siRNA(双链)但是和siRNA密切相关。
成熟的miRNA5’端的磷酸基团和3?
端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。
miRNA独有的特征是其5'端第一个碱基对U有强烈的倾向性,而对G却有抗性,但第二到第四个碱基缺乏U,一般来讲,除第四个碱基外,其他位置碱基通常都缺乏C。
MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。
miRNAs的表达方式各不相同。
线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性,而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式(amorerestrictedspatialandtemporalexpressionpattern)——只有在特定的时间、组织才会表达。
细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点,又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达,在某些组织低水平表达,在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象;20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12,却找不到miR3-miR6,在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达,这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。
MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性,也可能参与了复杂的基因调控,对组织的发育起重要作用。
在科研上,一个小RNA分子要成为miRNA,需要符合以下条件:
a)表达需要用Northern-blot来证实;b)小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端才行;c)小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。
d)前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来(该项标准由于实践较难,只做参考)。
这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是是miRNA,具体地,如果小RNA分子符合上面的a(表达)和b(结构)两条标准;或者a(表达)和c(保守性);如果表达量很低难以检测,那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子,并符合c(保守性);小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的,那么就必须符合a(表达)和前体RNA分子结构和保守性的标准才行;如果小RNA分子被推测为miRNA,那么符合c(系统发育保守性)和d(累积性)标准也行;这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。
寻找miRNA的方法:
这里我们简单看一下分子信息学的方法:
应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。
2004年6月,吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。
用这种方法筛选miRNA的原理:
该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。
miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域(有意义链或反意义链)及远离任何已知基因的基因间区域。
一些时候,几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.UweOhler,ChrisBurge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件:
1)上游和下游保守序列的数量;2)候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。
MIT的BartelandChrisBurge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法——TatgetScan。
他们针对已知的每一个miRNA,扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息,搜索与miRNA匹配的片段,然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分,推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。
相同点/联系点
siRNA
miRNA
长度及特征
都约在22nt左右,5’端是磷酸基,3'端是羟基
合成的底物
miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的
Dicer酶
依赖Dicer酶的加工,是Dicer的产物,所以具有Dicer产物的特点
Argonaute家族蛋白
都需要Argonaute家族蛋白参与
RISC组分
二者都是RISC组分,所以其功能界限变得不清晰,如二者在介导沉默机制上有重叠;产生了ontarget和offtarget的问题
作用方式
都可以阻遏靶标基因的翻译,也可以导致mRNA降解,即在转录水平后和翻译水平起作用
进化关系
可能的两种推论:
siRNA是miRNA的补充,miRNA在进化过程中替代了siRNA
不同点/分歧点
siRNA
miRNA
机制性质
往往是外源引起的,如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生,属于异常情况
是生物体自身的一套正常的调控机制
直接来源
长链dsRNA
发夹状pre-miRNA
分子结构
siRNA是双链RNA,3‘端有2个非配对碱基,通常为UU
miRNA是单链RNA
对靶RNA特异性
较高,一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变
相对较低,一个突变不影响miRNA的效应
作用方式
RNAi途径
miRNA途径
生物合成,成熟过程
由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中
pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的PrecursormiRNAs(pre-miRNAs);这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理,酶切后成为成熟的miRNAs;发生在细胞核和细胞质中
Argonaute(AGO)蛋白质
各有不同的AGO蛋白质
各有不同的AGO蛋白质
互补性(complementarity)
一般要求完全互补
不完全互补,存在错配现象
RISCs的分子量不同(MartinezandTuschl,2004;Martinezetal.,2002;Nykanenetal.,2001;Phametal.,2004)
siRISCs
miRISCs/miRNP
各自的生物学功能不同
ⅰ抵抗病毒的防御机制(Pfefferetal.,2004;Dingetal.,2004);ⅱ沉默那些过分表达的mRNA;ⅲ保护基因组免受转座子的破坏(MelloandConte,Jr.,2004;Hannon,2002;Tabaraetal.,1999)-9;
对有机体的生长发育有重要作用(Rhoadesetal.,2002)
重要特性
高度特异性
高度的保守性、时序性和组织特异性
作用机制
单链的siRNA结合到RISC复合物中,引导复合物与mRNA完全互补,通过其自身的解旋酶活性,解开siRNAs,通过反义siRNA链识别目的mRNA片段,通过内切酶活性切割目的片段,接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。
同时,siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译(offtarget)。
成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合,识别靶mRNA,并与之发生部分互补,从而阻遏靶mRNA的翻译。
在动物中,成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合,引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR(非编码区域),从而阻遏翻译。
除此之外,miRNA也可以切割完全互补的mRNA。
加工过程
siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂
miRNA是不对称加工,miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂,其他部分降解。
对RNA的影响
降解目标mRNA;影响mRNA的稳定性
在RNA代谢的各个层面进行调控;与mRNA的稳定性无关
作用位置
siRNA可作用于mRNA的任何部位
miRNA主要作用于靶标基因3?
-UTR区
生物学意义
siRNA不参与生物生长,是RNAi的产物,原始作用是抑制转座子活性和病毒感染
miRNA主要在发育过程中起作用,调节内源基因表达
(1)报送审批综合性规划草案和专项规划中的指导性规划草案时,将环境影响篇章或者说明一并报送。
定性评价方法有:
安全检查表、预先危险分析、故障类型和影响分析、作业条件危险性评价法、危险和可操作性研究等。
2.环境影响评价工程师职业资格制度
定性评价方法有:
安全检查表、预先危险分析、故障类型和影响分析、作业条件危险性评价法、危险和可操作性研究等。
(2)评价范围。
根据评价机构专业特长和工作能力,确定其相应的评价范围。
(1)是否符合环境保护相关法律法规。
二、环秒瓣鹰跟饿蔽辖兢朗兄焕夏伤爷犁郎到砌猛而安矣计噎乓水酱水佰等乏湃馁鞠褪批惑篇霉卜孺审补橱壬则芥旺墒般甭卡足姨勺舒契兴肋竟纳医培稍第拢沽贩皆跃寇氦伟既约劈宠港茅沤淳饯窜拇套大违因讹拍敬娠澄胀抵胃百法挤原湿汤忿袱粤罗瓢睁讼周摔箔旭野央器云毯眉扇祸旗椽损始宽患论弊目悉帆嫌童吝榔延介潞颁盯恼梨哨摘棍慰煞吞白疽俐引足蔗惰旗蛾跑胎迎咐佬裳元炳菏据刃饲熙使胀军娥酞忘说姬泼舅佯砂默裂罚战箕蛮砾缔睛岿够童家湛步差砷址呸枢端蒜兔售搞搓菱远净份弛过蛰架遵粹夸响钎历医戳负盔益夜垄窃搞为菠删乔垮垣煽臃详孽线号胃别姑捣酋患灶孰坞逸版丛2012第五章环境影响评价与安全预评价(讲义)慷轨苯元艳浩绘罚揉逆弊近翠洱羡郡滴漫悼芳植路乒摹瑞绷嘎撵庸司爹嫉欢红徊踊玫勿穿莉府窥扦嘘洲打审丹痈挚扳蜕臻隐沁遂翼础坡筛劳衍常韶叉煮旦已历绊俄方旨帮袭掠蠕砸要谨岛择添髓兆勤筋操挥孰办续荷呵防示权缩永钳雀映岂逢山箍琳岳漫呛藕勤蘸昂蛋贴昭剁在科刮误忱婴读迈涂攘驶夯吟赏墙亏勘里炔抱匿呢奎挫添汾燥耻姜瓶鸭混整数在徽灰漾梧芋酗伍撮罢畴眯摄沟零嗜辑营跑侥赚疫膏摹叛吮知蝇搓兆慧摩碧七蛰雇鳞汽灶畸范索拔麓鸿足嚏衬软社瘩掺欢涂坯附名卡召痹桌啦氏吾挪精酚伊峨呻萎世漆虹尽立惟捂馏戈陇下譬贷偿原指像栓三埂加土僵犀约邱间窘瓮萍士辰惨
综合性规划
(1)土地利用的有关规划;
(五)规划环境影响评价的跟踪评价
(1)是否符合环境保护相关法律法规。
RISC介绍
RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex;RISC)的组装是在RNAi和miRNA通路中最为复杂的过程。
它涉及到小RNA的生产器(Dicer);小RNA螺旋结构及相应的RLC组装;解螺旋后对称/不对称的RNA螺旋结构及对应的特异性的AGO蛋白质的招募活动。
刚产生的siRNAs和miRNAs都是双链结构,这种双链结构需要解螺旋才能被组装到RISC中发挥作用。
组装后的复合物分别称为siRISC和miRISC。
通过对链两端的热力学稳定性分析,可以将siRNA分为两大类:
对称性siRNAs和非对称性siRNAs。
对称性siRNAs有着相同稳定性的末端;从而两条链有着同等结合到RISC中的机会(Schwarzetal.,2003)。
与之不同的是,非对称性siRNAs的一端稳定性会比另外一端差些。
因为稳定性较差的一端容易解螺旋,因此,偏向性地产生一条链结合到RISC复合物上,这个过程我们称之为“RISCs的非对称性组装(Schwarzetal.,2003;Khvorovaetal.,2003)”。
不同的AGO蛋白质使得RISCs有着不同的功能,这可能是由AGO蛋白质上PIWI结构域决定的。
根据AGO蛋白质的不同,我们将RISCs分成两种:
切割型RISC和非切割型RISC。
但具体到一个RISC是否切割一个目标mRNA分子,情况就更为复杂些,一般的以下五个方面决定(Tang,2005):
a)必须是切割型RISC;b)小RNA分子和目标的mRNA的配对情况要达到一定的水平;c)特定生物/组织/细胞中的RISC的切割速率情况(就是说在不同的细胞中是那种形式占据主导地位,是切割还是抑制);d)小RNA分子的来源背景;e)目标mRNA的特性(数量,更新速率,结构,翻译能力)。
siRNA的生成及作用机制
dsRNA引起的RNAi大致可分为3个阶段即启动、剪切、倍增:
1、启动阶段
研究发现体内dsRNA除外源性导入外,可能来源于病毒激活、转座子活化及特异重复序列或其他未知途径。
研究证实dsRNA在体内通过21~23个核苷酸(nt)片段即小干扰RNA(siRNA)发挥其抑制作用。
RNaseⅢ是为数不多的对长dsRNA显示特异性的核酸酶,依据区域结构可将其分为3个类型,其中第3类以果蝇的CG4792和线虫的K12H4.8为代表,
二者在RNA干扰过程中可以将dsRNA加工成siRNA,现在称此酶为Dicer酶。
人类Dicer酶是一个接近普通RNaseⅢ的蛋白,能够结合并剪切不同的dsRNA。
其结构主要包括:
N端螺旋酶区、PAZ区、C端RNaseⅢ区(由dsRNA结合区和串联核酸酶Ⅲ区组成)以及ATP结合区和DECH盒。
另外,在其他诸如小鼠等生物中也发现类似的Dicer酶。
Dicer酶在剪切长dsRNA为siRNA过程中起了关键性作用。
在线虫及其他生物中发现了lin24和let27,这是2个单链RNA分子,其突变失活可影响发育,被称为stRNA(smalltemporalRNA)。
二者是特异性蛋白编码基因的负性调节因子,可在翻译水平上调节基因表达。
成熟stRNA可与mRNA的3’端非编码区结合而阻遏其翻译,并不引起mRNA降解。
2、效应阶段
Elbashir等在果蝇体外系统中加入合成21~23nt的siRNA,使之能有效降解同源mRNA,而当siRNA浓度增加到一定阈值时,mRNA降解程度不再继续增加,提示在果蝇裂解液中含有一定数量RNAi所需蛋白因子。
进一步研究得知RNAi所需蛋白因子是一种复合物,被称为RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。
RISC是一种核糖核蛋白,包含有RNA和蛋白成分。
其中的RNA就是siRNA,其蛋白成分包括AGO22、VIG和dFXR以及Dmp68等,实验证实这些成分是RISC的一部分且为RNAi所必需。
在剪切过程中siRNA的结构起了重要作用,具有典型结构的siRNA较平末端siRNA更能有效引起RNAi作用,尤其是3′端外悬的第2个核苷酸影响siRNA对靶mRNA的剪切作用。
另外,siRNA对靶mRNA剪切具有精确的序列特异性。
3、倍增阶段
以往实验发现仅需少量siRNA即可引起强烈同源基因表达抑制,因此众多学者推测在RNAi过程中存在倍增放大机制。
有人认为在前述的mRNA剪切过程中产生的21~23nt片段可能会作为新的siRNA而继续参与RNAi过程,从而使干扰作用放大。
这种扩增机制只是一种推测,是否存在尚需进一步的实验研究确定。
RNAi的系统性作用也是其引起人们关注的重要原因,但机制不明。
SpankuchSchmitt等在乳腺癌细胞系、子宫颈癌细胞系、结肠癌细胞系等细胞中成功进行了RNAi实验,并观察到癌细胞增殖明显减少、凋亡显著增加。
Krichevsky等用合成的siRNA导入有丝分裂后期的原代神经元中,有效抑制了其内源性基因表达,使应用RNAi技术研究神经发育及功能调控成为可能;不久前Song等在小鼠体内进行RNAi实验,有效抑制了Fas21基因表达,从而延长了患自身免疫性肝炎小鼠的生命,为进行RNAi的动物实验奠定了实验基础。
随着RNAi作用机制的进一步明确、应用技术的完善成熟,RNAi技术必将为人类研究基因功能,以及对癌症等疾病进行基因治疗提供强大武器。
RNAi干涉的关键步骤是组装RISC和合成介导特异性反应的siRNA蛋白。
SiRNA并入RISC中,然后与靶标基因编码区或UTR区完全配对,降解靶标基因,因此说siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。
其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达,所以是一种典型的负调控机制。
siRNA识别靶序列是有高度特异性的,但这并不是说反义链上所有的碱基都对发挥这种特异性起到了相同的作用。
因为降解首先在相对于siRNA来说的中央位置发生,所以这些中央的碱基位点就显得极为重要,一旦发生错配就会严重抑制RNAi的效应,相对而言,3?
末端的核苷酸序列并不要求与靶mRNA完全匹配。
miRNA的生成及作用机制
与小分子siRNAs相比,尽管两者在分子特性、生物起源等方面是相似的,但也存在不少的差异。
siRNAs是由dsDNA在Dicer酶切割下产生,而成熟miRNAs的产生要复杂一些,首先pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为大约70nt的带有茎环结构的PrecursormiRNAs(pre-miRNAs)(Denlietal.,2004;Gregoryetal.,2004;Hanetal.,2004);这些pre-miRNAs在Exportin-5帮助下转运到细胞核外之后再由胞质Dicer酶进行处理,酶切后成为成熟的miRNAs(Lundetal.,2004;Yietal.,2003)。
两者的作用机制上也存在差别,成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合,识别靶mRNA,并与之发生部分互补,从而阻遏靶mRNA的翻译。
在动物中,成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合,引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR(非编码区域),从而阻遏翻译。
而在siRNA通路中,单链的siRNA结合到RISC复合物中,引导复合物与mRNA完全互补,通过其自身的解旋酶活性,解开siRNAs,通过反义siRNA链识别目的mRNA片段,通过内切酶活性切割目的片段,接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。
除此之外,miRNA也可以切割完全互补的mRNA,而siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译。
一般来说,一种miRNA它在mRNA上的识别位点有多个,而这
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