DNS试剂.docx

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DNS试剂

混菌发酵马铃薯渣与汁水产单细胞蛋白的工艺优化及其活性物质的研究

2材料与方法

2.1单一菌种酶液的提取及粗酶液性质的研究

2.1.1实验菌种

黑曲霉（A.niger）、棘孢木霉（TrichodermaAsperellum）、酿酒酵母（SaccharomycesCerevisiae）、地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis）。

以上菌种由哈尔滨工业大学微生物工程中心提供。

2.1.2培养基

（1）LB培养基：

蛋白胨10g；酵母提取物5g；NaCl10g；pH7.0；（制作固体培养基加入20g琼脂粉）；1000ml蒸馏水。

（2）PDA培养基：

马铃薯200g，去皮切块，煮沸20-30min，纱布过滤，薯汁中加入蔗糖20g，溶化后定容至1000mL。

制作固体培养基时需加入20g琼脂粉。

（3）发酵培养基：

马铃薯薯渣与汁水半固体培养基。

市售新鲜马铃薯，切成小块后，按马铃薯：

水=1:

1混合，通过料理机搅打25s，以4层纱布过滤，滤液静置2h使其中的淀粉沉降，上清即为汁水。

固体薯渣以流水冲洗充分去除淀粉剩余为发酵用薯渣。

250mL三角瓶发酵培养基的薯渣与汁水比例为25g:

80mL。

100ml三角瓶发酵培养基的薯渣与汁水比例为10g:

30ml。

（4）基础产CNM酶培养基：

羧甲基纤维素钠（CMC-Na）10g；磷酸氢二钠2.5g；磷酸二氢钾1.5g；蛋白胨2.5g；酵母粉0.5g；水1000ml；PH值7.0-7.2（自然）。

（5）基础产淀粉酶培养基：

牛肉膏0.03%，大豆蛋白胨0.5%，糊精1.0%，氯化钙0.2%，磷酸二氢钾0.05%，硫酸铁0.05%，pH7.0。

2.1.3实验仪器与设备

（1）手提式高压蒸汽灭菌锅

（2）空气浴恒温振荡器

（3）离心机

（4）冰箱

（5）紫外分光光度计

（6）恒温水浴锅

（7）万能电阻炉

（8）100mL三角瓶；500mL三角瓶；9cm培养皿；温度计。

（9）PL303型电子天平，精确度0.001g，梅特勒–托利多仪器有限公司；

（10）PHS–25型酸度计，上海伟业仪器厂；

（11）可调微量移液器，范围40~200μl、200~1000μl、500~5000μl，Finnpipette（Shanghai）Co.Ltd；

2.1.4实验药品

去离子水；蒸馏水：

实验用水应符合GB/T6682中一级水标准。

其它药品和试剂均为分析纯。

有。

。

。

。

。

。

。

。

。

等

2.1.5试剂

（1）DNS试剂[40]：

称取3,5-二硝基水杨酸10.1g,置于约600ml水中。

逐渐加入氢氧化钠10g（注意此时水浴不能超过48℃），不断搅拌至澄清。

50℃水浴再依次加入酒石酸钾钠200g、苯酚（重蒸）2g和无水亚硫酸钠5g，全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000ml，过滤。

储存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

（轻工业部标准DNS试剂的配制方法）

（2）柠檬酸钠缓冲液（0.05mol/L，PH4.8）

称取一水柠檬酸4.83g，溶于约750ml水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000ml，调节PH到4.8±0.05备用。

（3）磷酸缓冲液（0.1mol/L，PH6.0）

分别称取一水磷酸二氢钠121.0g和二水磷酸二氢钠21.89g，将其溶解在10L去离子水中。

调节溶液PH到6.0±0.05备用。

（4）葡萄糖标准储备液：

准确称取1g无水葡萄糖（预先在60℃干燥至衡重），用少量蒸馏水溶解后，定容至100ml。

（5）葡萄糖标准使用液：

分别吸取葡萄糖标准储备液0.00ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、2.50ml、3.00ml、3.50ml于10ml容量瓶中定容，摇匀备用。

（6）CMC-Na溶液：

称取2gCMC-Na，精确至1mg，缓慢加入缓冲液200ml并加热至80-90℃，边加热边磁力搅拌器，待CMC-Na全部溶解后，室温冷却，再用磷酸缓冲液稀释至小于300ml，2mol/L盐酸或氢氧化钠调节PH至4.8±0.05，最后磷酸缓冲液定容到300ml，搅拌均匀，贮存于冰箱中备用。

（7）原碘液

称取1.10g碘，用少量水完全溶解加入2.20g碘化钾，溶解后定容至50mL,存于棕色瓶中。

（8）稀碘液

取原碘液2.0mL，加碘化钾20.0g，溶解，定容至500mL，存于棕色中。

（9）3.2%可溶性淀粉（现配现用）

取约70mL水加热至沸腾，称取可溶性淀粉2.000g于小烧杯中，加入少量常温下的水，搅拌至糊状。

将糊状淀粉逐滴缓慢加入在沸腾中的水中，边加边变搅拌，洗液也加入，最后成透明状液体，冷却后定容至100mL。

（10）盐酸溶液（0.1mol/L）

量取0.9mL盐酸注入水中，定容至100mL。

（11）氢氧化钠溶液（NaOH）＝0.5mol/L

称取氢氧化钠片剂2.00g，加90mL水搅拌溶解，待溶液降至室温后定容至100mL。

（12）2%可溶性淀粉溶液

称取2.000g淀粉于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，取大约70ml沸水逐渐加入烧杯中，边搅拌边加入，最后使溶液成透明状，在100ml容量瓶中定容（烧杯中的洗液也要加入）。

2.2酶活力测定和酶活力定义方法

2.2.1标准曲线的绘制

（1）葡萄糖标准曲线的绘制

取7支烘干试管，编号（1,2，，7）。

按下表数据配置不同浓度的葡萄糖标准溶液。

摇匀后沸水浴中放置10min，取出迅速冷却至室温后，定容至25ml，充分摇匀。

用10mm比色杯，于分光光度计540nm波长处测定吸光度。

以葡萄糖浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制曲线。

获得线性回归方程，线性回归系数在0.9990以上时可使用。

管

号

标准葡萄糖使用液

DNS试剂吸取量（ml）磷酸缓冲液吸取量（ml）

3.02.0

3.01.5

3.01.5

3.01.5

3.01.5

3.01.5

3.01.5

浓度（mg/ml）吸取量（ml）

10.00.0

21.00.5

31.50.5

42.00.5

52.50.5

63.00.5

73.50.5

（2）淀粉标准曲线的绘制

取九只试管分别编号（1,2，，6），按下表配置混合溶液。

在660nm处测OD值。

以淀粉溶液浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程，当线性回归系数大于0.9990时，可使用。

管号淀粉溶液稀释液/ml蒸馏水/ml磷酸缓冲液/ml稀碘液（代替粗酶液）/ml

12（0.0%）1.01.01.0

22（0.2%）1.01.01.0

32（0.5%）1.01.01.0

42（0.8%）1.01.01.0

52（1.0%）1.01.01.0

62（1.2%）1.01.01.0

72（1.5%）1.01.01.0

82（1.8%）1.01.01.0

92（2.0%）1.01.01.0

实验组淀粉溶液稀释液/ml粗酶液/ml磷酸缓冲液/ml稀碘液/ml

样品组2（2.0%）1.01.01.0

对照组2（2.0%）1.01.01.0

2.2.2酶活力测定方法

（1）粗酶液的提取

基础产酶培养基发酵4d后取出培养液，于离心机中5000r/min离心10min,其上清液为粗酶液。

（2）羧甲基纤维素钠酶活力测定法

取四支25ml刻度具塞的试管，一支用作空白管，另外三支作平行管。

分别向四支试管中准确加入CMC-Na溶液2.0ml、1.5mL磷酸缓冲液，50℃条件下水浴1min。

分别加入待测粗酶液0.5ml于三支平行管中，摇匀，塞盖。

将四支试管同时置于50℃水浴中，准确计时，反应30min取出。

向各试管中加入DNS试剂3.0ml，摇匀后立即将四支试管同时放入沸水浴中，于空白管中加入待测酶液0.5ml,准确及时加热10min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25ml。

以空白管作为空白对照调零点，在分光光度计中，540nm处分别测量三支试管的吸光度，取平均值。

通过线性回归方程求出还原糖的质量。

（3）淀粉酶活力测定方法

取四支试管，一支作为空白管，另外三支作平行管。

于三支平行试管中加入2%淀粉溶液2.0ml，1ml磷酸缓冲液，40℃水浴保温5min。

加入1ml粗酶液摇匀后，准确计时30min。

然后放入沸水浴中5min,加入1ml稀碘液显色，摇匀，在660nm下测定吸光值。

在空白管中先加入加入1ml粗酶液1ml磷酸缓冲液，沸水浴5min后，2%淀粉溶液2.0ml后，吸取1ml稀碘液加入其中摇匀，在660nm下调零。

2.2.3酶活力定义：

酶活力单位定义（U/g）定义：

1961年国际酶学会议规定：

1个酶活力单位是指在特定条件，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。

（1）国际纤维素酶活力定义

在（50±0.1）℃、相应PH条件下，1min水解纤维素底物，产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖量，为一个酶活力单位，以IU/g表示。

CMC酶活力（U/g）计算公式为：

=A×1/0.5×n×2

式中：

A——根据吸光度在标准曲线上查得或计算出还原糖的量，mg；

1/0.5——换算成酶液1ml；

n——酶液的稀释倍数；

2——时间换算系数

国际纤维素酶活力：

换算公式：

=（

×1000）/（180×60）=0.093

式中：

——国际纤维素酶活力，IU/g（或IU/ml）；

180——还原糖的摩尔质量（以葡萄糖计算），g/mol；

60——时间换算系数，s/min；

——CMC酶活力，U/g（或U/ml）

（2）淀粉酶活力定义

以每毫升粗酶液在40℃，PH7.0的条件下每小时分解的淀粉毫克数来定义。

酶活力单位（U/ml）=（A-B）×V/T×N

式中A——为初始淀粉含量mg；

B——为被消耗的淀粉量mg；

V——为酶促反应液的体积（4ml）

T——酶促反应的时间（h）

N——为酶溶液的稀释倍数

2.2.4酶的最适反应温度

在PH7.0的条件下，按照测酶活力的方法，改变反应过程中的温浴温度，分别为：

20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃。

在660nm波长下测吸光值，根据酶活力公式计算出相应的酶活。

2.2.5酶的最适反应PH

将粗酶液与相对应的pH的缓冲液混合后按照测酶活的方法测定酶在40℃的活力。

PH梯度为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。

2.3液体种子液的制作

从斜面上挑取少量的地衣芽孢杆菌（BacillusLicheniformis），无菌条件下接种于LB液体培养基中，37℃，150rmp,培养24h，每一小时测定在600nm下的吸光值，四小时后每隔4小时测定一次，

当OD值大于1小于1.2时，保证地衣芽孢杆菌菌液浓度能达到

个/ml，方可作为种子液使用。

分别从斜面上挑取少量黑曲霉和棘孢木霉到PDA固体培养基上，28℃，培养72h后，吸取3ml蒸馏水加入到PDA固体培养基中，摇动培养皿是孢子悬浮于液体中。

吸取孢子悬液，在血球计数板上计数，孢子数达到

个/ml，可作为种子液使用。

从斜面上挑取少量酿酒酵母菌，无菌条件下接种到PDA液体培养基中，30℃，150rmp，24h。

每个一小时，在600nm下测定OD值，四小时后每隔4小时测定一次。

当OD值大于1小于1.2时，可作为种子液使用。

2.4菌种发酵马铃薯渣与汁水研究的实验材料与方法

1仪器与设备

（1）手提式高压蒸汽灭菌锅

（2）空气浴恒温振荡器

（3）离心机

（4）电热恒温干燥箱

（5）冰箱

（6）食品料理机（榨汁机）

（7）紫外分光光度计

（8）恒温水浴锅

（9）可调微量移液器，范围40~200μl、200~1000μl、500~5000μl，Finnpipette（Shanghai）Co.Ltd；

（10）凯氏定氮消化炉

（11）万能电阻炉

（12）100mL三角瓶；250mL三角瓶；500mL三角瓶；9cm培养皿；温度计。

（13）PL303型电子天平，精确度0.001g，梅特勒–托利多仪器有限公司；

（14）PHS–25型酸度计，上海伟业仪器厂；

2实验药品

3试剂

（1）茚三酮试剂

称取3g茚三酮溶于95%乙醇中，溶解后加入160mg二氯化锡，搅拌溶解后加100ml柠檬酸缓冲液，搅匀备用。

称取2g茚三酮溶于100ml蒸馏水中制得2%的茚三酮水溶液。

（2）谷氨酸标准溶液

准确称取100mg谷氨酸溶于100ml的蒸馏水中，即为1mg/ml谷氨酸标准溶液。

（3）磷酸缓冲液（PH6.0）同2.1.5

（4）24%TCA

（5）标准蛋白质溶液：

用牛血清蛋白预先微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成20μg/ml的溶液。

（6）蛋白试剂：

100mg考马斯亮蓝G—250溶于50mL95%乙醇中，再加100mL85%磷酸，用双蒸水补至1000mL，置于棕色瓶中待用。

2.4.1发酵液中游离氨基酸含量的测定（最好应用高效液相色谱法）

（1）谷氨酸标准曲线的绘制

取标准氨基酸母液将其稀释成0μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、80μg/ml、100μg/ml的标准溶液。

取不同浓度的氨基酸溶液1ml，加入磷酸缓冲液1ml,充分混合，然后加入茚三酮试剂1ml，充分混匀后在100℃水浴15min。

取出后加入3ml60%乙醇进行稀释，然后冷却，在波长为570nm处测定吸光度，绘制A570—氨基酸浓度曲线，计算线性回归方程和相关系数，相关系数大于0.9990。

（2）样品液的制备

发酵培养基中发酵4d后，取出发酵液于离心机中5000rmp离心10min,其上清液为样品液。

取上清液5ml，加入2ml饱和CaCl2溶液和4mlKH2PO4（100g/ml），待白色絮凝物出线后，离心，5000rmp，1min。

取上清液0.5ml于容量瓶中，定容至50ml。

（3）茚三酮比色法测定发酵液中游离氨基酸方法

取四支试管，一支作为空白对照，另外三支为平行管。

平行管中加入1ml样品液，空白管中以1ml蒸馏水代替。

每管分别加入1ml磷酸缓冲液，1ml茚三酮试剂，充分混匀后在100℃水浴15min。

取出后加入3ml60%乙醇进行稀释，然后冷却，在波长为570nm处测定吸光度，以空白管调零。

2.4.2发酵液中活性肽含量的测定

（1）样品液制备

取5ml发酵液，离心4000rmp，20min。

取3ml上清液加入1ml三氯乙酸（TCA）静止30min。

然后离心（4000rmp，20min）取上清液用考马斯亮蓝法测定活性肽的含量。

（2）牛血清蛋白标准浓度曲线

取20μg/mL的标准蛋白溶液，分别取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL，然后分别加入900μL、800μL、700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、100μL重蒸水，配制成1mL体系。

然后加入5mL蛋白试剂，充分震荡混匀2min后，于波长595nm下测定吸光值，以1mL重蒸水代替上述不同浓度标准蛋白溶液作为空白对照，595nm处调零。

求出线性回归方程，线性回归系数至少大于0.9900。

（3）考马斯亮蓝法测发酵液中活性肽

取3.2.2

（1）中处理后的发酵液1mL，加入5mL蛋白试剂，充分振荡2min，于595nm测定吸光值，以1mL重蒸水作空白对照调零点。

以牛血清蛋白标准曲线做参照，求出蛋白含量。

如果样品液蛋白质浓度过高则要进行适当的稀释。

2.4.3发酵液中精蛋白的测定

（1）样品液制备

发酵培养基中发酵4d后，取出发酵液于离心机中5000rmp离心10min,其上清液为样品液。

（2）牛血清蛋白标准曲线绘制

取20μg/mL的标准蛋白溶液，分别取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、600μL、700μL、800μL、900μL，然后分别加入900μL、800μL、700μL、600μL、500μL、400μL、300μL、200μL、100μL重蒸水，配制成1mL体系。

然后加入5mL蛋白试剂，充分震荡混匀2min后，于波长545nm下测定吸光值，以1mL重蒸水代替上述不同浓度标准蛋白溶液作为空白对照，595nm处调零。

求出线性回归方程，线性回归系数至少大于0.9900。

（3）考马斯亮蓝法测发酵液中精蛋白

取1mL上清液加入5mL蛋白试剂，充分震荡混匀2min后，于波长545nm处进行比色测定，取3次测定平均值。

以1mL重蒸水代替发酵液作空白对照，调零点。

以牛血清蛋白标准曲线做参照，求出蛋白含量。

如果样品液蛋白质浓度过高则要进行适当的稀释。

2.4.4发酵产品粗蛋白含量测定

3.2.5.1试剂

（1）纳氏试剂：

17g二氯化汞溶解于300mL水中，另取35g碘化钾溶解在100mL蒸馏水中。

然后将二氯化汞溶液慢慢加入到碘化钾溶液中，直到形成红色沉淀为止。

再加入600mLNaOH溶液（200g/L）。

将此溶液静置1-2d，取上清液于棕色瓶中备用。

（2）酒石酸钾钠溶液：

取10g酒石酸钾钠，溶于100mL蒸馏水中煮沸，至约减少20mL为止。

冷却后，再用蒸馏水稀释至100mL。

（3）100μg/mLN（NH+4-N）标准储备溶液：

取烘干NH4Cl（分析纯）0.3817g溶于水中，定容至1000mL，此为100μg/mLN（NH+4-N）标准溶液。

（4）10μg/mLN（NH+4-N）标准工作液：

吸取标准储备液50mL，稀释至500mL，即为10μg/mLN（NH+4-N）标准工作液。

3.2.5.2NH4Cl标准曲线绘制方法

分别吸取10μg/mLN（NH+4-N）标准工作液0.00mL、2.50mL、5.00mL、7.50mL、10.00mL、12.50mL，置于6个容积为50mL容量瓶中，加100g/L酒石酸钾钠溶液2mL，充分摇匀，加蒸馏水至40mL，摇匀，加纳氏试剂2.5mL，用蒸馏水定中后充分摇匀。

30min后，用分光光度计比色，波长为425nm。

此标准液浓度梯度分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.50μg/mLN（NH+4-N）。

以空白液作对照调零点。

3.2.5.3样品液的制备及粗蛋白测定

将发酵液于60℃条件下烘干至衡重。

对固体发酵产物进行粉碎过40目筛子。

准确称取其中的0.2g发酵产物加入硝化瓶中，并向其中加入0.4g五水硫酸铜、6.00g无水硫酸钾、12mL浓硫酸，放入凯氏定氮硝化炉中进行硝化，使样品中的氮类化合物全部转化为铵根离子的形式，2h后关火。

冷却至室温，将硝化液稀释至100mL。

取上述待测液5mL置于50mL容量瓶中，加100g.L酒石酸钾钠溶液2mL，充分摇匀，再加入100g/LKOH溶液中和溶液中的酸,（KOH加入量：

另取一份待测液，测定中和这份溶液所需KOH的体积数，用酚酞作指示剂）[N（NH+4-N）在0.2-0.3mg/L]。

加水至40mL，摇匀，加纳氏试剂2.5mL，用蒸馏水定容至50mL。

30min后在波长425nm测定OD值。

空白对照：

用稀消化液5mL于50mL容量瓶中，加纳氏试剂2.5mL，2mL酒石酸钾钠，最后定容至50mL，作为空白对照调零点。

稀消化液配制：

取0.4g五水硫酸铜、6.00g无水硫酸钾、12mL浓硫酸制成消化液，取5mL，加蒸馏水稀释至250mL。

3.2.5.4计算公式

粗蛋白%=

×6.25

式中：

ρ——从标准曲线查得显色液N（NH+4-N）的质量浓度（μg/mL）；

V——显色液体积（mL）；

——分取倍数，即硝煮液定容体积（mL）/吸收硝煮液体积（mL）；

m——干样品质量（g）；

6.25——1g氮相当于6.25粗蛋白质。

2.4.5发酵液上清中化学需氧量的测定

将水样混匀后取20mL置于250mL回流锥形瓶中，准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数粒玻璃珠，连接磨口冷凝管，从冷凝管上口慢慢地加入

硫酸—硫酸银溶液30mL，轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流2h。

冷却后加入90mL蒸馏水冲洗冷凝管壁。

取下锥形瓶，再度冷却后加3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点。

记录硫酸亚铁标准溶液的用量。

以20.00mL蒸馏水，按照相同步骤作空白试验作为对照。

2.4.6发酵液中还原糖的测定

（1）葡萄糖标准曲线绘制

（2）还原糖测定方法

将发酵液以4000rmp离心10min，取上清液备用。

取四支25ml刻度具塞的试管，一支用作空白管，另外三支作平行管。

分别向四支试管中准确加入离心的上清液2.0ml，向各试管中加入DNS试剂3.0ml，摇匀后立即将四支试管同时放入沸水浴中，准确计时加热2min取出，迅速冷却至室温，用水定容至25ml。

以空白管加入等体积的蒸馏水作为空白对照调零点，在分光光度计中，540nm处分别测量三支试管的吸光度，取平均值。

通过线性回归方程求出还原糖的质量。

3发酵马铃薯渣与汁水产单细胞蛋白的研究

3.1发酵实验方法

细菌：

斜面菌种→活化→接入液态培养基→28℃、150rmp摇床培养48h→OD值大于1小于1.2时，以1%的接种量接入马铃薯渣与汁水液体发酵培养基30℃、150rmp培养4d。

真菌：

斜面菌种→活化→28℃、72h→取3mL蒸馏水加入培养基中晃动摇匀→血球计数板计数，孢子数在107个/mL时，O以1%的接种量接入马铃薯渣与汁水液体发酵培养基。

3.2单一菌株发酵马铃薯渣与汁水的研究

3.2.1黑曲霉及木霉还原糖转化率的研究

按1%的接种量将两种种子液分别接种到100/250mL马铃薯渣与汁水发酵培养基中，30℃，180rmp，培养6d，每12h按照2.2.6中的方法测发酵液中还原糖的量。

按1%的接种量将两种种子液（1:

1）接种到100/250mL马铃薯渣与汁水发酵培养基中，30℃，180rmp，培养6d，每12h按照2.2.6中的方法测发酵液中还原糖的量。

为菌种组合优化及酵母菌和芽孢杆菌的接种时间作依据。

3.2.2四种菌株对发酵培养基COD降低的影响

按1%的接种量将四种种子液分别接种到100/250mL马铃薯渣与汁水发酵培养基中，30℃，180rmp，培养6d，2.2.5中的方法测发酵液COD。

按1%的接种量将四种种子液（1:

1:

1:

1）共同种到100/250mL马铃薯渣与汁水发酵培养基中，30℃，180rmp，培养6d，2.2.5中的方法测发酵液COD。

3.2.3芽孢杆菌及酵母菌发酵产单细胞蛋白及活性物质的研究

按1%的接种量将种子液分别接种到马铃薯渣与汁水发酵培养基中，30℃，180rmp，培养6d，每24h测发酵液中精蛋白、游离氨基酸、活性肽的量。

按1%的