核酸的杂交(分子生物学)朱-096学时.ppt
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核酸的杂交(分子生物学)朱-096学时.ppt
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核酸的杂交核酸杂交基本类型1。
Southernblot2.Northernblot3.Westernblot应用:
克隆筛选、特定基因序列测定。
应用:
克隆筛选、特定基因序列测定。
3.1)DNA杂交杂交探针为探针为DNA2)RNA杂交杂交探针为探针为DNA或或cDNA3)蛋白质免疫分析蛋白质免疫分析探针为抗体探针为抗体主要内容主要内容一、核酸杂交的基本原理(掌握)一、核酸杂交的基本原理(掌握)二、核酸探针(熟悉掌握)二、核酸探针(熟悉掌握)三、杂交技术(了解)三、杂交技术(了解)第一节第一节核酸杂交的基本原理核酸杂交的基本原理一、核酸的变性一、核酸的变性1在在某某些些理理化化因因素素的的作作用用下下,核核酸酸双双链链分分子子碱碱基基对对的的氢氢键键断断裂裂,疏疏水水作作用用被被破破坏坏,有有规规则则的的空空间间结结构构被被破破坏坏,形形成成单单链链分分子子,称称为为核酸的变性。
核酸的变性。
2变性方式变性方式
(1)DNA热变性:
热变性:
是最常用的方法,一般加热是最常用的方法,一般加热80-100数分钟即可使数分钟即可使核酸分子氢键断裂,双链分开。
核酸分子氢键断裂,双链分开。
(2)热、酸、碱、化学试剂(如:
尿素、甲酰胺、甲醛等)。
热、酸、碱、化学试剂(如:
尿素、甲酰胺、甲醛等)。
变性的核酸分子失去了生物活性,同时理化性质也随之改变,变性的核酸分子失去了生物活性,同时理化性质也随之改变,其紫外吸收值(其紫外吸收值(A260)也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟)也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪踪DNA的变性过程。
以的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图,得到吸收值对应温度作图,得到DNA的的变性曲线或熔解曲线。
变性曲线或熔解曲线。
1特特点点1)增增色色效效应应:
在在260nm紫紫外外吸吸收收值升高。
值升高。
2)Tm值改变值改变3)粘粘度度下下降降、比比旋旋度度下下降降、沉沉降降系数升高。
系数升高。
4)生物活性丧失。
)生物活性丧失。
影响影响Tm值的因素值的因素1。
碱基组成:
。
碱基组成:
G-C含量多,含量多,Tm值值高;高;A-T含量多,含量多,Tm值值低。
低。
2。
离子强度:
低离子强度,离子强度:
低离子强度,Tm值低,范值低,范围宽;高离子强度,围宽;高离子强度,Tm值高,范围窄。
值高,范围窄。
3。
PH值:
值:
PH5-9,Tm变化不明显,变化不明显,PH小于小于4或大于或大于11,Tm变化明显。
变化明显。
4。
变性剂:
各种变性剂都使。
变性剂:
各种变性剂都使Tm降低。
降低。
2.影响复性的因素影响复性的因素序序列列简简单单的的分分子子复复性性快快,如如poly(dT)和和poly(dA)识别快识别快DNA片段愈大,扩散速度愈低,复性慢片段愈大,扩散速度愈低,复性慢离子强度离子强度有利于复性有利于复性DNA浓度浓度复性复性Tm值的估算值的估算20bpTm=69.3+0.41(G+C)%Tm=81.5+16.6lgM+0.41(G+C)%-500/n-0.61(甲酰胺甲酰胺%)3变性过程DNA变变性性过过程程是是一一个个逐逐渐渐的的过过程程:
AT区先解链,区先解链,GC区后解链。
区后解链。
DNA变性曲线变性曲线AT区先解链区先解链GC区后解链区后解链阶梯式曲线阶梯式曲线GC含量与含量与Tm值之间的关系值之间的关系(G+C)%=(Tm-69.3)2.44Tm=(G+C)%0.41+69.3二、核酸的复性二、核酸的复性1概概念念:
变变性性DNA两两条条互互补补单单链链,在在适适当当条条件件下下重重新新缔缔合合成成双链的过程。
双链的过程。
2特特点点1)理理化化性性质质恢复。
恢复。
2)生物活性)生物活性部分恢复部分恢复3核酸复性的阶段
(1)成成核核阶阶段段:
两两条条单单链链局局部部碰碰撞,形成双链;撞,形成双链;
(2)拉拉练练式式阶阶段段:
在在成成核核基基础础上上,其其余部分碱基互补余部分碱基互补复性过程复性过程
(1)单链分子间碰撞形成局部双链单链分子间碰撞形成局部双链
(2)局部双链周围的碱基如不配对时,双链重新解)局部双链周围的碱基如不配对时,双链重新解离离(3)局部双链周围的碱基如配对,则形成中心序列)局部双链周围的碱基如配对,则形成中心序列(4)形成完整的双链分子)形成完整的双链分子4影响复性过程的因素影响复性过程的因素单链核酸的起始浓度:
反应开始时的总浓度可直接单链核酸的起始浓度:
反应开始时的总浓度可直接影响单链分子碰撞的几率,浓度越高,复性越快。
影响单链分子碰撞的几率,浓度越高,复性越快。
核酸链长度(分子量):
分子越长,扩散越慢,形核酸链长度(分子量):
分子越长,扩散越慢,形成配对的难度也大,复性也慢。
成配对的难度也大,复性也慢。
核酸分子的复杂性:
复杂性即核酸分子中不同序列核酸分子的复杂性:
复杂性即核酸分子中不同序列的总长度,复杂性越高,形成正确配对的难度也越的总长度,复杂性越高,形成正确配对的难度也越大,复性越慢。
大,复性越慢。
温度:
温度过高有利于变性;过低则分子运动减慢,温度:
温度过高有利于变性;过低则分子运动减慢,少数碱基形成的局部双链也不易解离。
适宜的复性少数碱基形成的局部双链也不易解离。
适宜的复性温度是比温度是比TmTm低低2525。
离子强度(盐浓度):
适当的离子强度可中和核酸离子强度(盐浓度):
适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电,减少双链间的静电斥分子上磷酸基团所带的负电,减少双链间的静电斥力,有利于复性。
离子强度过高则不利于复性。
力,有利于复性。
离子强度过高则不利于复性。
三。
核酸杂交概念三。
核酸杂交概念:
利利用用变变性性作作用用将将DNA双双链链分分开开,加加入入不不同同来来源源的的DNA单单链链或或RNA链链,经经过过退退火火处处理理,不不同同来来源源的的两两条条多多核核苷苷酸酸链链依依靠靠碱碱基互补关系基互补关系形成杂种双螺旋形成杂种双螺旋的过程。
的过程。
复性复性RNADNA杂交杂交影响核酸杂交的因素影响核酸杂交的因素1。
探针。
探针浓度:
双链探针浓度大,浓度:
双链探针浓度大,DNA-RNA杂交受影响,杂交受影响,(0.10.5g,)单链)单链探针浓度大核酸杂交率一般增加。
探针浓度大核酸杂交率一般增加。
2。
碱基组成:
碱基组成:
G-C含量多,杂交率增加。
含量多,杂交率增加。
3。
温度:
。
温度:
1)0,杂交非常缓慢,杂交非常缓慢,2)低于低于Tm20-25,杂交率杂交率最大最大3)温度为)温度为Tm-5杂交率杂交率十分低下。
十分低下。
4。
离子强度(盐浓度):
适当的离子强。
离子强度(盐浓度):
适当的离子强度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电,度可中和核酸分子上磷酸基团所带的负电,减少双链间的静电斥力,有利于杂交。
离减少双链间的静电斥力,有利于杂交。
离子强度过高过低则不利于杂交。
子强度过高过低则不利于杂交。
5。
核酸分子:
分子越大,越复杂,杂交。
核酸分子:
分子越大,越复杂,杂交难度大,杂交也慢。
分子越小,易杂交。
难度大,杂交也慢。
分子越小,易杂交。
第二节核酸探针一、探针的概念一、探针的概念核酸探针的概念核酸探针的概念指能与特定核苷酸序列发生指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂特异互补杂交交,杂交后又能被特殊方法,杂交后又能被特殊方法检出检出的的已知已知被被标记标记的核苷酸链的核苷酸链二、探针种类和选择二、探针种类和选择1种类种类基因组基因组DNA探针探针CDNA探针探针RNA探针探针CRNA探针探针寡核苷酸探针寡核苷酸探针基因组基因组DNA探针探针制备制备:
一般从基因一般从基因文库中选取某一基文库中选取某一基因片段与载体连接,因片段与载体连接,克隆后酶切得到克隆后酶切得到优点:
制备方法优点:
制备方法简单,不易降解,简单,不易降解,标记方法成熟标记方法成熟。
1.基因组基因组DNA探针探针从基因从基因组组DNA文库中选取某一基因片段文库中选取某一基因片段与载体连接(质粒、噬菌体)与载体连接(质粒、噬菌体)克隆克隆(PCR扩增扩增)酶切酶切优点:
优点:
无性繁殖、制备方法简单;无性繁殖、制备方法简单;不易降解不易降解(与(与RNA比较);比较);标记方法成熟。
标记方法成熟。
重组DNA导入受体菌目的基因目的基因基因载体基因载体重组体重组体分切接转筛表达总总体体技技术术路路线线EcoRIBoyer和和Cohen的实验的实验Boyer和和Cohen的实验的实验pSC101pRpR6-56-5大肠杆菌大肠杆菌2.cDNA探针(探针(complementaryDNA)S1核酸酶切平两端核酸酶切平两端优点:
优点:
不含内含子及高度不含内含子及高度重复序列但不易获得重复序列但不易获得载体连接载体连接克隆克隆通过逆转录通过逆转录双链双链cDNA加接头加接头限制酶限制酶粘性末端粘性末端3.RNA探针:
检测探针:
检测DNA和和mRNA优点:
杂交效率高,稳定性高,非特异性优点:
杂交效率高,稳定性高,非特异性杂交较少杂交较少,未杂交探针可用未杂交探针可用RNase降解,减少本底的干扰。
降解,减少本底的干扰。
缺点:
易降解,标记方法复杂缺点:
易降解,标记方法复杂2.cDNA探针(探针(complementaryDNA)S1核酸酶切平两端核酸酶切平两端优点:
优点:
不含内含子及高度不含内含子及高度重复序列但不易获得重复序列但不易获得载体连接载体连接克隆克隆通过逆转录通过逆转录双链双链cDNA加接头加接头限制酶限制酶粘性末端粘性末端3.RNA探针:
检测探针:
检测DNA和和mRNA优点:
杂交效率高,稳定性高,非特异性优点:
杂交效率高,稳定性高,非特异性杂交较少杂交较少,未杂交探针可用未杂交探针可用RNase降解,减少本底的干扰。
降解,减少本底的干扰。
缺点:
易降解,标记方法复杂缺点:
易降解,标记方法复杂4.寡核苷酸探针寡核苷酸探针优点:
优点:
可根据需要合成相应序列;可根据需要合成相应序列;探针短探针短,序列复杂性低序列复杂性低,分子量小,分子量小,因此杂交时间短因此杂交时间短;长长度只有度只有1050bp,该识别序该识别序列内列内1个碱基的变化可明显降低杂个碱基的变化可明显降低杂交交Tm值。
值。
可大量合成,价格低,能够用酶可大量合成,价格低,能够用酶学或学或化学方法进行非放射性标记。
化学方法进行非放射性标记。
三、探针设计原则:
三、探针设计原则:
长度:
长度:
1050bp碱基成分碱基成分:
G+C含量为含量为40%60%探针分子内无互补序列。
探针分子内无互补序列。
避免同一碱基重复出现。
避免同一碱基重复出现。
一旦选定某一序列后,尚需与已知的各种基因一旦选定某一序列后,尚需与已知的各种基因序列进行同源性比较,与非靶区域的同源性不应序列进行同源性比较,与非靶区域的同源性不应超过超过70%或有连续或有连续8个或更多的碱基同源。
个或更多的碱基同源。
四、探针标记物的选择四、探针标记物的选择理想的标记物:
理想的标记物:
具有高度的灵敏性具有高度的灵敏性与探针结合后,不影响杂交及探针的主与探针结合后,不影响杂交及探针的主要理化特性要理化特性检测方法高灵敏性、高特异性,假阳性率检测方法高灵敏性、高特异性,假阳性率低,环境污染少,价格低廉;低,环境污染少,价格低廉;若用酶促方法标记,应对若用酶促方法标记,应对Km影响不大影响不大寡核苷酸探针制备:
先设计一个制备:
先设计一个2050个碱基的核苷酸顺个碱基的核苷酸顺序,在序,在DNA合成仪上合成仪上合成合成优点:
可根据需要优点:
可根据需要合成,探针短,杂合成,探针短,杂交时间短,价格低交时间短,价格低设计探针的原则设计探针的原则
(1)探针长度)探针长度1050bp
(2)G-C为为4060%(3)避免同一碱基的连续出现)避免同一碱基的连续出现4个个(4)避免碱基反向互补碱基对应)避免碱基反向互补碱基对应4bp(5)与非靶基因序列有与非靶基因序列有70%以上的同源性,以上的同源性,应重新设计应重新设计三、探针标记原理三、探针标记原理理想探针标记物的特征:
理想探针标记物的特征:
探针标记物:
探针标记物
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- 核酸 杂交 分子生物学 096 学时