基因治疗现状(研究生)(6).ppt
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基因治疗现状(研究生)(6).ppt
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基因治疗基因治疗GeneTherapyGeneTherapy第一节第一节基因治疗基因治疗概念概念n经典的基因治疗:
经典的基因治疗:
指正常的基因整合入细胞基指正常的基因整合入细胞基因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。
因组以校正或置换致病基因的一种治疗方法。
n广义的基因治疗:
广义的基因治疗:
将某种遗传物质转移到患者将某种遗传物质转移到患者细胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾细胞内,使其在体内发挥作用,以达到治疗疾病目的的方法。
病目的的方法。
n目前基因治疗:
目前基因治疗:
凡是采用分子生物学的方法和凡是采用分子生物学的方法和原理,在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可原理,在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可以称为基因治疗。
以称为基因治疗。
基因治疗分类基因治疗分类体细胞(somaticcell)(somaticcell)基因治疗生殖细胞(germlinegermline)基因治疗v只限于某一体细胞的基因的改变v只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进行矫正v当代及子代1973年第一例人体实验1978年第二例基因治疗实验基因治疗动物实验广泛开展Dr.Anderson(1980)首先阐明基因治疗前景和发展方向Rosenberg(1990)利用逆转录病毒将基因导入肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),并将TIF输回体内,TIF集中在肿瘤部位,表达neoR。
n1990年年9月月14日:
第一例正式批准的基因治疗日:
第一例正式批准的基因治疗实验开始进行实验开始进行n(美国,世界上开展基因治疗最早的国家)(美国,世界上开展基因治疗最早的国家)大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段大规模进行基因治疗临床实验必须经历以下阶段:
体外试验和动物试验体外试验和动物试验I期临床试验期临床试验6-10名志愿者名志愿者II期临床试验期临床试验20-30名志愿者名志愿者III期临床试验期临床试验充分分析疗效、安全性充分分析疗效、安全性n中国中国1991年年7月开始进行基因治疗试验月开始进行基因治疗试验基因治疗的策略基因治疗的策略TheStrategyofGeneTherapy基因治疗的策略大致可分为以下几种基因治疗的策略大致可分为以下几种n基因置换基因置换genereplacementn基因修复基因修复genecorrectionn基因修饰基因修饰geneaugmentationn基因干预基因干预geneinactivationn自杀基因治疗自杀基因治疗suicidegenetherapyn基因免疫治疗基因免疫治疗immuneadjustmentn其他其他
(一)基因置换
(一)基因置换(genereplacementgenereplacement)定义:
定义:
将特定的目的基因导入特定细胞,通将特定的目的基因导入特定细胞,通过定位重组,以导入的正常基因置换基因组内原过定位重组,以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。
有的缺陷基因。
目的:
目的:
将缺陷基因的异常序列进行矫正。
将缺陷基因的异常序列进行矫正。
对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复,对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复,不涉及基因组的任何改变。
不涉及基因组的任何改变。
n又称为又称为基因打靶基因打靶(genetargeting)n定点整合的条件定点整合的条件:
转转导导基基因因的的载载体体与与染染色色体体上上的的DNA具具有有相相同同的的序序列列。
带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点,进进行行部部分分基基因因序序列列的的交交换换,使使基基因因置换这一治疗策略得以实现。
置换这一治疗策略得以实现。
基因同源重组技术基因同源重组技术n要要实实现现基基因因置置换换,需需要要采采用用同同源源重重组组技技术术使使相相应应的的正正常常基基因因定定向向导导入入受受体体细细胞胞的基因缺陷部位。
的基因缺陷部位。
n定定向向导导入入的的发发生生率率约约1/1001/100万万,采采用用胚胚胎胎干干细细胞胞培培养养的的方方法法,这这种种同同源源重重组组的的检出率最高可达检出率最高可达1/101/10。
基因置换必要条件基因置换必要条件:
1、对导入的基因及其产物有详尽的了解、对导入的基因及其产物有详尽的了解2、外来基因能有效地导入靶细胞、外来基因能有效地导入靶细胞3、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在、导入基因能在靶细胞中长期稳定存在4、导入基因能有适度水平的表达、导入基因能有适度水平的表达5、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害、基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害
(二)
(二)基因修饰基因修饰基因添加或称基因增补(基因添加或称基因增补(geneaugmentationgeneaugmentation):
通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
的基因。
类型类型:
n在在有有缺缺陷陷基基因因的的细细胞胞中中导导入入相相应应的的正正常常基基因因,而而细细胞胞内内的的缺缺陷陷基基因因并并未未除除去去,通通过过导导入入正正常常基因的表达产物,补偿缺陷基因的功能;基因的表达产物,补偿缺陷基因的功能;n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表达达的的基基因因,利利用其表达产物达到治疗疾病的目的。
用其表达产物达到治疗疾病的目的。
基因基因干预干预(geneinterferencegeneinterference)指采用特定的方式抑制某个基因的表指采用特定的方式抑制某个基因的表达,或者通过破坏某个基因而使之不达,或者通过破坏某个基因而使之不表达,以达到治疗疾病的目的。
表达,以达到治疗疾病的目的。
1.反义核酸:
反义核酸:
封闭基因表达封闭基因表达2.核酶:
核酶:
裂解特异的靶裂解特异的靶mRNA3.RNA干涉技术:
干涉技术:
(三)基因干预(三)基因干预(四)自杀基因治疗(四)自杀基因治疗自杀基因治疗自杀基因治疗(suicide(suicidegenetherapygenetherapy)n自自杀杀基基因因治治疗疗:
恶恶性性肿肿瘤瘤基基因因治治疗疗的的主主要要方方法法之一。
之一。
n原原理理:
将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中,这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体体在在体体内内转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物,诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自杀自杀”效应,从而达到清除肿瘤细胞的目的。
效应,从而达到清除肿瘤细胞的目的。
自杀基因的作用机制TK/GCVTK/GCV单单纯纯疱疱疹疹病病毒毒(herpsherpssimplexsimplexvirus,virus,HSVHSV)型型胸胸苷苷激激酶酶(thymidinethymidinekinasekinase,tktk)基基因因编编码码胸胸苷苷激激酶酶,特特异异性性地地将将无无毒毒的的核核苷苷类类似似物物丙丙氧氧鸟鸟苷苷(ganciclovirganciclovir,GCVGCV)转转变变成成毒毒性性GCVGCV三三磷磷酸酸核核苷苷,后后者者能抑制能抑制DNADNA聚合酶活性,导致细胞死亡。
聚合酶活性,导致细胞死亡。
CD/5-FCCD/5-FC大大肠肠杆杆菌菌胞胞嘧嘧啶啶脱脱氨氨酶酶(cytosinecytosinedeaminasedeaminase,CDCD)基基因因,在在细细胞胞内内将将无无毒毒性性5-5-氟氟胞胞嘧嘧啶啶(5-FC5-FC)转变成毒性产物)转变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶(氟尿嘧啶(5-FU5-FU)。
)。
1.1.自杀基因系统自杀基因系统5-5-氟尿嘧啶通过氟尿嘧啶通过竞争性抑制竞争性抑制胸苷酸合酶胸苷酸合酶的活性,从而抑的活性,从而抑制脱氧胸苷三磷酸的合成。
制脱氧胸苷三磷酸的合成。
旁旁观观者者效效应应:
“自自杀杀基基因因”治治疗疗不不仅仅使使转转导导了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死,而而且且与与其其相相邻邻的的未未转转导导“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细胞也被杀死。
细胞也被杀死。
2.2.旁观者效应旁观者效应(五)基因免疫治疗(五)基因免疫治疗nimmuneadjustment通过将抗癌免疫增强细胞因子或通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHCMHC基基因导入肿瘤组织,以增强肿瘤微环境中的因导入肿瘤组织,以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。
抗癌免疫反应。
第二节第二节基因治疗的必要条件基因治疗的必要条件1、发病机制在发病机制在DNA水平上已经清楚;水平上已经清楚;2、要转移的基因已经克隆分离,其表达产物有详尽要转移的基因已经克隆分离,其表达产物有详尽的了解;的了解;3、该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作;该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作;1、外源基因可有效导入靶细胞外源基因可有效导入靶细胞2、外源基因能在靶细胞中长期稳定存留外源基因能在靶细胞中长期稳定存留3、导入基因能适量表达导入基因能适量表达4、导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害理想的基因治疗还必须:
理想的基因治疗还必须:
基因转移技术基因转移技术TheTechniqueofGeneTransfer基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因invivoexvivo靶细胞基因治疗途径基因治疗途径1、间接体内治疗途径(、间接体内治疗途径(exvivo)是先从患者体内取出某一器官组织的细胞,体外扩增后,是先从患者体内取出某一器官组织的细胞,体外扩增后,将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞,将目的基因转入靶细胞形成表达外源基因的遗传修饰细胞,选择高表达的细胞扩增培养,以一定数量移植患者体内。
选择高表达的细胞扩增培养,以一定数量移植患者体内。
(安全、易控制但操作复杂)(安全、易控制但操作复杂)22、直接体内治疗途径(、直接体内治疗途径(invivoinvivo)将目的基因体内直接转移到靶细胞,所用载体必须具有特将目的基因体内直接转移到靶细胞,所用载体必须具有特异的导向性和转移效率。
(操作简单但疗效短、免疫排斥异的导向性和转移效率。
(操作简单但疗效短、免疫排斥等)等)基因转移基因转移(genetransfer)(genetransfer)技术:
技术:
1.1.病毒介导的基因转移系统。
病毒介导的基因转移系统。
2.2.非病毒介导的基因转移系统非病毒介导的基因转移系统。
1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高,因此它也是使用介导的基因转移效率较高,因此它也是使用最多的基因治疗载体。
据统计,有最多的基因治疗载体。
据统计,有72%72%的临床的临床实验计划和实验计划和71%71%的病例使用了病毒载体,其中的病例使用了病毒载体,其中用得最多的是逆转录病毒载体。
用得最多的是逆转录病毒载体。
Retrovirus(11)逆转录病毒)逆转录病毒(11)两端各有一长末端重复序列)两端各有一长末端重复序列LTRLTR。
逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点(22)LTRLTR由由U3U3、RR和和U5U5三部分组成。
三部分组成。
(1)
(1)在在U3U3内有增强子和启动子;内有增强子和启动子;
(2)U3
(2)U3和和U5U5两两端端分分别别有有病病毒毒整整合合序序列列(IS)(IS);(3)(3)在在RR内还有内还有poly(Apoly(A)加尾信号。
加尾信号。
(33)病毒有三个结构基因)病毒有三个结构基因
(1)gag
(1)gag基因,编码核心蛋白及属特异性抗原;基因,编码核心蛋白及属特异性抗原;
(2)pol
(2)pol基因,编码逆转录酶;基因,编码逆转录酶;(3)env(3)env基基因因,编编码码病病毒毒外外壳壳或或包包膜膜糖糖蛋蛋白白(包包括括外膜糖蛋白和穿膜蛋白外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。
(44)55端端LTRLTR下下游游有有一一段段病
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