人源化抗体的制备.pptx

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制备针对某种肿瘤抗原并应用于临床治疗的人源化抗体4月刊自然综述癌症（Nature.Reviews.Cancer.）“Antibodytherapyofcancer”http:

/T细细胞提供第二信号胞提供第二信号寻寻找有效的靶抗原，找有效的靶抗原，设计设计scFvscFv，对对TCRTCR进进行特异性行特异性基因修基因修饰饰肿肿瘤瘤细细胞表达胞表达FasLFasL，而淋巴，而淋巴细细胞表达胞表达FasFas，接触后会，接触后会诱导诱导淋巴淋巴细细胞凋亡胞凋亡借助有效的靶向机制向借助有效的靶向机制向肿肿瘤瘤细细胞胞导导入入FasLmRNAFasLmRNA互互补链补链，阻止阻止FasLFasL转录转录后表达；后表达；设计对肿设计对肿瘤瘤细细胞有特异性的胞有特异性的FasFas抗抗体，使体，使FasFas单单抗特异性与抗特异性与肿肿瘤瘤细细胞的胞的FasFas结结合，合，诱导诱导凋亡凋亡为什么要制备人源化抗体？

鼠源单克隆抗体神奇的子弹单克隆抗体的若干缺陷人抗鼠抗体Humanantigenmouseantibody（HAMA）不能有效激活人体中补体和受体相关的效应系统体内半衰期较短人源化抗体优点减少降低了机体的免疫排斥反应募集效应因子或效应细胞在体内的半衰期长对于该现象的解释是：

人源化抗体中的Fc段可以特异结合人血管内皮细胞上的Fc受体（FcRn），使抗体内化到血管内皮细胞而不被降解，并能够回到血液中参与循环。

鼠抗体由于不能有效的与人FcRn结合而很快从循环系统中清除。

抗体人源化的基本原则保持或提高抗体的亲和力和特异性大大降低或基本消除抗体的免疫原性所以，构建人源化抗体的关键在于选择合适的人抗体轻链和重链作为鼠cDRs的框架区。

鼠单抗人源化鼠单抗人源化将小鼠将小鼠Ig基因敲除，转染人基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠基因，在小鼠体内产生人体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体量完全人源化抗体恒定区人源化恒定区人源化人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体可变区人源化可变区人源化人改型抗体人改型抗体用抗体库技术进行人源化用抗体库技术进行人源化鼠单抗人源化鼠单抗人源化鼠抗体（红）和人源化抗体（绿）Fv结构的叠合图表面氨基酸残基人源化方法步骤方法步骤获得鼠源单抗重轻链可变区基因获得鼠源单抗重轻链可变区基因可变区基因定点突变可变区基因定点突变构建人鼠嵌合基因构建人鼠嵌合基因构建真核表达系统构建真核表达系统1.获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段肿瘤抗原免疫小鼠肿瘤抗原免疫小鼠取小鼠脾细胞（含取小鼠脾细胞（含B细胞）细胞）骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞株杂交瘤细胞株分别获得抗体分别获得抗体VH、VL基因基因PEGRT-PCR设计引物设计引物参照发表的该鼠源单抗重轻链可变区基因2.重轻链可变区基因片段分别连接克隆载体重轻链可变区基因片段分别连接克隆载体获得的两个可变区基因获得的两个可变区基因酶切、连接酶切、连接克隆载体克隆载体转化转化原核表达系统检测原核表达系统检测抽质粒、测序鉴定抽质粒、测序鉴定第一代人源化抗体：

人鼠嵌合抗体CDR序列序列CDR序列序列鼠单克隆抗体鼠单克隆抗体人抗体人抗体人源化抗体人源化抗体在选择人FR时一般有两条途径：

起初的一条是起初的一条是，根据已有晶体结构数据的人源抗体的可变区框架，借助序列比较与分子模建确定在人、鼠间的种源差异，由其是鼠FR中与CDR有密切作用的氨基酸残基，要保留在替换的人源FR中。

第二条途径第二条途径是，在已有的抗体序列库中搜寻与鼠单克隆抗体FR有最大同源性的人源FR用以替换。

在选择同源的人FR时,先前倡导将VL和VH作为一个整体来考虑,寻找最高同源的人FR。

后来则认为,将VL和VH分开考虑,分别寻找最高同源的对应序列3.鼠源可变区编码基因进行鼠源可变区编码基因进行PCR定点突变定点突变根据突变位点设计引物进行多轮突变，获得重塑的鼠源可变区基因质粒转化大肠杆菌，培养测序鉴定4.构建真核表达系统构建真核表达系统l基因片段基因片段插入含有插入含有人人IgG重轻重轻链恒定区链恒定区的表达载的表达载体体l转染酵母转染酵母l产生抗体产生抗体