新项目方法验证能力确认报告水质 细菌总数的测定 平皿计数法 HJ 1000.docx
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新项目方法验证能力确认报告水质细菌总数的测定平皿计数法HJ1000
XXXX有限公司
新项目方法验证能力确认报告
项目名称:
水质细菌总数的测定平皿计数法
(HJ1000-2018)
项目负责人:
项目审核人:
项目批准人:
批准日期:
年月日
水质细菌总数的测定平皿计数法
(HJ1000-2018)
方法验证能力确认报告
1.方法依据及适用范围
本方法依据《水质细菌总数的测定平皿计数法》(HJ1000-2018)。
本方法适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水中细菌总数的测定。
2.方法原理及干扰
2.1方法原理
将样品接种于营养琼脂培养基中,在特定的物理条件下(36℃培养48h)培养,生长的需氧菌和兼性厌氧菌总数即为样品中细菌菌落的总数。
2.2干扰及消除
2.2.1活性氯具有氧化性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集时加入硫代硫酸钠溶液消除干扰。
2.2.2重金属离子具有细胞毒性,能破坏微生物细胞内的酶活性,导致细胞死亡,可在样品采集时加入乙二胺四乙酸二钠溶液消除干扰。
3.主要仪器、设备及试剂
3.1试剂和材料
除非另有说明,分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂或生物试剂,实验用水为蒸馏水或去离子水。
3.1.1营养琼脂培养基。
成分:
蛋白胨10g
牛肉膏3g
氯化钠5g
琼脂15~20g
将上述成分或含有上述成分的市售成品溶解于1000ml水中,调节pH至7.4~7.6,分装于玻璃容器中,经121℃高压蒸汽灭菌20min,储存于冷暗处备用。
避光、干燥保存,必要时在5℃±3℃冰箱中保存,不得超过1个月。
配制好的营养琼脂培养基不能进行多次融化操作,以少量勤配为宜。
当培养基颜色变化或脱水明显时应废弃不用。
3.1.2无菌水:
取适量实验用水,经121℃高压蒸汽灭菌20min,备用。
3.1.3硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)。
3.1.4乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na2·2H2O)。
3.1.5硫代硫酸钠溶液:
ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml。
称取15.7g硫代硫酸钠,溶于适量水中,定容至100ml,临用现配。
3.1.6乙二胺四乙酸二钠溶液:
ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15g/ml。
称取15g乙二胺四乙酸二钠,溶于适量水中,定容至100ml,此溶液可保存为30d。
3.1.7玻璃珠:
直径3~8mm。
3.1.8细菌总数标准样品:
95MPN/ml,检定证书编号:
XXXX,检定有效期限,XXXX年XX月XX日。
3.2主要仪器和设备
3.2.1采样瓶:
250ml带螺旋帽或磨口塞的广口玻璃瓶。
3.2.2高压蒸汽灭菌器:
115℃、121℃可调,1台,型号:
XXXX,编号:
XXXXXXXX,检定证书编号:
XXXX,检定有效期限,XXXX年XX月XX日。
3.2.3恒温培养箱:
允许温度偏差36℃±1℃,1台,型号:
XXXX,编号:
XXXXXXXX,检定证书编号:
XXXX,检定有效期限,XXXX年XX月XX日。
3.2.4恒温水浴锅:
47℃可调,1台,型号:
XXXX,编号:
XXXXXXXX,检定证书编号:
XXXX,检定有效期限,XXXX年XX月XX日。
3.2.5pH计:
准确到0.1pH单位,1台,型号:
XXXX,编号:
XXXXXXXX,检定证书编号:
XXXX,检定有效期限,XXXX年XX月XX日。
3.2.6放大镜,1台,型号:
XXXX,编号:
XXXXXXXX。
3.2.7菌落计数器,1台,型号:
XXXX,编号:
XXXXXXXX。
3.2.8一般实验室常用器皿和设备。
注:
玻璃器皿及采样器具试验前要按无菌操作要求包扎,121℃高压蒸汽灭菌20min备用。
4.样品
4.1样品采集
点位布设及采样频次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相关规定执行。
采集微生物样品时,采样瓶不得用样品洗涤,采集样品于灭菌的采样瓶中。
采集河流、湖库等地表水样品时,可握住瓶子下部直接将带塞采样瓶插入水中,约距水面10~15cm处,瓶口朝水流方向,拔瓶塞,使样品灌入瓶内然后盖上瓶塞,将采样瓶从水中取出。
如果没有水流,可握住瓶子水平往前推。
采样量一般为采样瓶容量的80%左右。
样品采集完毕后,迅速扎上无菌包装纸。
从龙头装置采集样品时,不要选用漏水龙头,采水前将龙头打开至最大,放水3~5min,然后将龙头关闭,用火焰灼烧约3min灭菌或用70%~75%的酒精对龙头进行消毒,开足龙头,再放水1min,以充分除去水管中的滞留杂质。
采样时控制水流速度,小心接入瓶内。
采集地表水、废水样品及一定深度的样品时,也可使用灭菌过的专用采样装置采样。
在同一采样点进行分层采样时,应自上而下进行,以免不同层次的搅扰。
如果采集的是含有活性氯的样品,需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液,以除去活性氯对细菌的抑制作用(每125ml容积加入0.1ml硫代硫酸钠溶液);如果采集的是重金属离子含量较高的样品,则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液,以消除干扰(每125ml容积加入0.3ml乙二胺四乙酸二钠溶液)。
注:
15.7mg硫代硫酸钠可去除样品中1.5mg活性氯,硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
4.2样品保存
采样后应在2h内检测,否则,应10℃以下冷藏但不得超过6h。
实验室接样后,不能立即开展检测的,将样品于4℃以下冷藏并在2h内检测。
5.分析步骤
5.1样品稀释
将样品用力振摇20~25次,使可能存在的细菌凝团分散。
根据样品污染程度确定稀释倍数。
以无菌操作方式吸取10ml充分混匀的样品,注入盛有90ml无菌水的三角烧瓶中(可放适量的玻璃珠),混匀成1:
10稀释样品。
吸取1:
10的稀释样品10ml注入盛有90ml无菌水的三角烧瓶中,混匀成1:
100稀释样品。
按同法依次稀释成1:
1000、1:
10000稀释样品。
每个样品至少应稀释3个适宜浓度。
注:
吸取不同浓度的稀释液时,每次必须更换移液管。
5.2接种
以无菌操作方式用1ml灭菌的移液管吸取充分混匀的样品或稀释样品1ml,注入灭菌平皿中,倾注15~20ml冷却到44~47℃的营养琼脂培养基,并立即旋摇平皿,使样品或稀释样品与培养基充分混匀。
每个样品或稀释样品倾注2个平皿。
5.3培养
待平皿内的营养琼脂培养基冷却凝固后,翻转平皿,使底面向上(避免因表面水分凝结而影响细菌均匀生长),在36℃±1℃条件下,恒温培养箱内培养48h±2h后观察结果。
5.4空白试验
用无菌水做实验室空白测定,培养后平皿上不得有菌落生长,否则,该次样品测定结果无效,应查明原因后重新测定。
6.结果计算与表示
6.1结果判读
平皿上有较大片状菌落且超过平皿的一半时,该平皿不参加计数。
片状菌落不到平皿的一半,而其余一半菌落分布又很均匀时,将此分布均匀的菌落计数,并乘以2代表全皿菌落总数。
外观(形态或颜色)相似,距离相近却不相触的菌落,只要它们之间的距离不小于最小菌落的直径,予以计数。
紧密接触而外观相异的菌落,予以计数。
6.2结果计算
以每个平皿菌落的总数或平均数(同一稀释倍数两个重复平皿的平均数)乘以稀释倍数来计算1ml样品中的细菌总数。
各种不同情况的计算方法如下:
优先选择平均菌落数在30~300之间的平皿进行计数,当只有一个稀释倍数的平均菌落数符合此范围时,以该平均菌落数乘以其稀释倍数为细菌总数测定值(见表1例1)。
若有两个稀释倍数平均菌落数在30~300之间,计算二者的比值(二者分别乘以其稀释倍数后,较大值与较小值之比)。
若其比值小于2,以两者的平均数为细菌总数测定值;若大于或等于2,则以稀释倍数较小的菌落总数为细菌总数测定值(见表1例2、例3、例4)。
若所有稀释倍数的平均菌落数均大于300,则以稀释倍数最大的平均菌落数乘以稀释倍数为细菌总数测定值(见表1例5)。
若所有稀释倍数的平均菌落数均小于30,则以稀释倍数最小的平均菌落数乘以稀释倍数为细菌总数测定值(见表1例6)。
若所有稀释倍数的平均菌落数均不在30~300之间,则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数为细菌总数测定值(见表1例7)。
表1稀释倍数选择及菌落总数测定值
示例
不同稀释倍数的平均菌落数
两个稀释倍数
菌落数之比
菌落总数(CFU/ml)
10
100
1000
1
1365
164
20
—
16400
2
2760
295
46
1.6
37750
3
2890
271
60
2.2
27100
4
150
30
8
2
1500
5
无法计数
1650
513
—
513000
6
27
11
5
—
270
7
无法计数
305
12
—
30500
6.3结果表示
测定结果保留至整数位,最多保留两位有效数字,当测定结果≥100CFU/ml时,以科学计数法表示;若未稀释的原液的平皿上无菌落生长,则以“未检出”或“<1CFU/ml”表示。
7.方法能力验证
7.1培养基检验
将标准菌株配成浓度为30~300CFU/ml的菌悬液,充分混匀后取1ml菌悬液按接种和培养进行操作,平皿内均匀地产生30~300个菌落,表明该批次培养基合格。
7.2精密度和准确度
实验室分别对低浓度(地下水,浓度均值约为39CFU/ml)、中浓度(地表水,浓度均值约为2.5×103CFU/ml)和高浓度(生活污水,浓度均值约为1.3×105CFU/ml)三个不同浓度细菌总数的样品及有证标准样品(浓度为95MPN/ml,可接受范围为22~168MPN/ml)进行了6次重复测定,结果如表2所示:
表2方法精密度和准确度测定数据
标准样品
测定结果
标准值
低
中
高
95MPN/ml
样品浓度(CFU/ml)
1
2
3
4
5
6
平均值
(CFU/ml)
相对误差RE(%)
/
/
/
标准偏差S(CFU/ml)
相对标准偏差RSD(%)
注:
微生物检测数据为偏态分布,其测定结果全部经以10为底对数转换后进行计算。
由表2可知,本实验室水质中细菌总数的6次测试结果所得的相对误差为x.x%,准确度符合要求;相对标准偏差为x.x%~xx%,精密度符合标准方法要求。
8.监测实例
本单位实验室两组人员分别对某河流、某场地内地下水、某工厂生产废水和员工生活污水进行采样监测。
测定结果如表3-6所示:
表3监测实际样品测定数据(地表水)
实际样品测定结果
人员1
人员2
空白试验
细菌总数(CFU/ml)
人员相对误差(%)
由表3可知,本实验室两组人员测定结果相对误差为XX%,小于10%,符合实验室人员比对分析质量控制要求。
表4监测实际样品测定数据(地下水)
实际样品测定结果
人员1
人员2
空白试验
细菌总数(CFU/ml)
人员相对误差(%)
由表4可知,本实验室两组人员测定结果相对误差为XX%,小于10%,符合实验室人员比对分析质量控制要求。
表5监测实际样品测定数据(工业废水)
实际样品测定结果
人员1
人员2
空白试验
细菌总数(CFU/ml)
人员相对误差(%)
由表5可知,本实验室两组人员测定结果相对误差为XX%,小于10%,符合实验室人员比对分析质量控制要求。
表6监测实际样品测定数据(生活污水)
实际样品测定结果
人员1
人员2
空白试验
细菌总数(CFU/ml)
人员相对误差(%)
由表6可知,本实验室两组人员测定结果相对误差为XX%,小于10%,符合实验室人员比对分析质量控制要求。
9.结论
通过验证,依据《水质细菌总数的测定平皿计数法》(HJ1000-2018)对地表水、地下水、生活污水和工业废水中细菌总数的监测,本实验室设备、人员能力、方法的精密度、准确度等均满足标准方法要求。
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