发掘和定位与水稻高产稳产优质有关的基因12个以上包括大穗.docx

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发掘和定位与水稻高产稳产优质有关的基因12个以上包括大穗

国家重点基础研究发展规划

课题结题研究报告

项目编号：

G1*******00

项目名称：

农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究

课题编号：

G1*******04

课题名称：

水稻新基因发掘及利用研究

课题负责人：

张启发

联系地址：

华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，430070

电话：

（027）87282429传真：

（027）87287092

课题依托单位：

华中农业大学

主要承担单位：

华中农业大学

上海农业生物基因资源中心

2003年9月11日

1.计划任务完成情况

1.1研究计划

定位涉及水稻产量、抗性、米质等性状的12个以上的优异基因；明确所定位基因的基因效应及其利用价值。

创造一批具有以上优异基因，易于育种利用的水稻新种质。

1.2完成情况

从水稻资源库里筛选大量的材料，建立了旱、低氮、低磷胁迫的筛选和评价体系；通过多种筛选方法，获得了具大穗，大粒、小粒，高蛋白，理想粒形，抗旱，养分高效利用等有利性状的水稻资源。

利用这些特色材料构建了14个重组自交系群体和5个双单倍体群体，已经定位了包括水稻穗大小，千粒重，稻米外观品质和食味品质等性状的主效QTL50多个，这些QTL加性效应较大，可以借助标记辅助选择技术，应用于水稻遗传改良。

利用cDNA芯片技术分离了一批低氮胁迫，低磷胁迫，干旱胁迫和螟虫胁迫条件下的显著差异表达基因。

利用转基因技术获得了磷高效率利用的中间材料。

抗旱，磷利用效率和氮利用效率相关基因定位工作正在进行中，大穗主效QTL近等基因系即将建成，粒形主效QTL近等基因系正在构建中。

选育了一大批包含以上优异基因的中间材料。

具体完成情况

1.2.1新种质资源的筛选

对品种资源攻关研究中获得的2000余份含有本研究所需基因的优异种质初步筛选，重复鉴定，获得包括大穗、大粒、抗旱、抗寒、高蛋白、食味品质优良，等优异稻种资源20多份。

对品种资源攻关研究中获得的2000余份和本项目课题一提供的水稻核心种质库503份材料采用成对试验法进行苗期低氮低磷筛选。

经过分析，确定在苗期进行耐低磷品种筛选的方法：

一般情况下以相对单株分蘖率和相对单株干重比较可靠。

对于筛选期间正常磷处理和低磷处理都无分蘖的品种，应以相对干重的大小作为筛选指标；对于分蘖发生早，正常磷处理有分蘖，缺磷处理有或无分蘖的品种，则应以单株相对分蘖数作为主要指标，而以相对干重作为辅助指标。

从2000余份材料中通过筛选指标和外部生物学特征表现筛选出较为典型的耐低磷品种49个品种，低磷敏感品种35个。

采用对比试验，对1200份水稻种质资源进行氮高效筛选，根据相对分蘖率和相对干重表现出很大的差异初步筛选出12份氮高效材料。

表1列出部分典型新基因源材料。

对创建的530份特青/Lemont双向导入系、240份中413导入系，设置低氮处理组和正常氮肥对照组进行大田筛选，每小区种植4行，每行6株。

分苗期、最高分蘖期、抽穗期等不同时期考察株高、分蘖数、穗数、叶绿素含量、光合速率等形态指标，成熟期考察生物学和籽粒产量。

同时，对初步筛选的氮高效品种资源和“特青/Lemont”单向导入跨叠系，进行水培成对试验，营养池中保持营养液循环流动，于最高分蘖期考察苗高、分蘖数、茎叶和根部干重、叶绿素含量、植株重氮量等营养生理指标。

在湖北省襄樊市布置了耐低氮的大田筛选试验，参试材料为“中413”导入系共1800株系，分施氮和不施氮相邻田块进行对比试验，根据初筛和田间目测筛选结果，对部分株系进行叶绿素含量、有效穗数和产量等性状分析。

筛选结果将在年底获得。

表1筛选出的具有特异性状的水稻种质材料

品种资源

特性

品种资源

特性

HR5

每穗实粒数280左右

中旱1号

抗旱

SLG－1

千粒重55

中旱5号

抗旱

南洋占

千粒重45克

BG4087

磷高效利用

Chuan7

千粒重12克

中早18

磷高效利用

HR94

粒长1.1厘米

Lagrue

磷敏感

多年生稻

抗寒

IRGC78042

抗螟虫

德陇208

软米

IRGC6303

抗螟虫

HA84494

高蛋白

沿潮

氮高效

岳早籼6号

高蛋白

沈农265

氮高效

1.2.2群体构建

新基因发掘的基本方法之一是进行基因定位，基因定位往往离不开群体，因此，本课题相当长的时间和相当大的精力用于群体构建。

又因为永久性群体DHs和RILs方便于多年多点试验，因此，构建永久性群体是本课题前三年研究工作的主要任务之一。

构建DH群体受基因型影响，多数组合获得的独立克隆苗较少，因此，大多组合以构建RILs为目标。

经过武汉，杭州正季加代和海南冬季南繁相结合，已经获得18个各具特征的群体用于本课题的研究（表2），分子标记工作已经证实这些群体质量较高，非常适于QTL定位工作。

1.2.3基因定位

1.2.3.1连锁图谱构建

以下列10个群体（表3）为基础，开始构建SSR标记连锁图，大多群体的连锁图在完善之中。

1.2.3.2水稻外观品质基因的定位

以珍汕97/明恢63的F2:

3群体及其衍生的重组自交系群体为材料，鉴定并定位了控制稻米外观品质的4个性状（粒长、粒宽、长宽比、垩白）的主效基因（或主效QTLs），其中控制粒长的基因位于第3染色体，粒宽基因位于第5染色体，长宽比主要受控于这两个基因，垩白基因定位于第5染色体，与粒宽基因的定位相同（表4）。

表2已经构建成的18个群体

群体组合

群体类型（世代）

群体大小

群体目的

建成年份

珍汕97/武育粳2号

DH

190

持绿性

2001、4

珍汕97B/德陇208

F7

239

软米

2002、4

II-32B/岳早籼6号

F7

178

高蛋白

2002、4

珍汕97B/HR5

F7/F6

302/39

大穗

2001、4

珍汕97B/南洋占

F8/F7

175/67

长粒

2002、4

珍汕97B/南洋占

DH

115

长粒

2002、4

珍汕97B/多年生稻

F7/F6

151/35

抗寒

2001、4

珍汕97B/多年生稻

DH

389

抗寒

2001、4

珍汕97B/SLG-1

F8/F7

180/57

大粒

2002、4

珍汕97B/中旱5号

F8/F7

145/58

抗旱

2002、4

南洋占/Chuan7

F7/F6

269/83

大小粒

2001、4

珍汕97B/H94

DH

120

长粒

2002、4

II-32B/H94

DH

155

长粒

2002、4

珍汕97/特青

F7

236

产量

2002、10

明恢63/特青

F7

218

产量

2002、10

协青早/9308

F7/F6

80/210

产量

2003、10

珍汕97/中早18

F7/F6

143/27

磷高效

2003、9

BG4087/Lagrue

F4（构建中）

240

磷高效

2003．10

表3遗传连锁图谱构建情况

组合名称

作图群体大小

群体类型

连锁图全长cM

标记数目

ZS97/武育粳

190

DH

1849.4

179

ZS97B/H94

92

DH

1458.9

191

II-32B/H94

103

DH

1079.9

160

ZS97/HR5

190

RIL

1563.6

185

ZS97B/德陇208

186

RIL

160

IRAT109/ZS97

178

RIL

正在构建中

120

ZS97B/南洋占

190

RIL

正在构建中

71

珍汕97B/多年生稻

190

DH

正在构建中

100

ZS97/SLG-1

190

RIL

正在构建中

95

南洋占/Chuan7

190

RIL

正在构建中

65

表4珍汕97/明恢63组合衍生的群体稻米外观品质QTL定位

Trait

Chrom-

osome

Interval

LOD

%Vara

Addb

Dom

F2-3population

Grainlength

3

RG393-C1087

32.7

59.0

-0.42

-0.24

7

C1023-R1440

2.7

5.1

-0.08

0.14

Total

33.8

59.9

Grainwidth

1

C161-R753

4.1

15.2

0.04

0.11

5

RG360-C734a

19.9

52.3

0.16

-0.04

Total

21.8

55.9

Length-widthratio

3

C1087-RZ403

12.8

29.4

-0.18

-0.10

5

RG360-C734a

9.9

31.3

-0.17

-0.02

Total

30.1

62.4

Chalkiness

1

C161-R753

2.6

8.9

1.97

16.33

5

RG360-C734a

29.3

70.3

30.91

-20.73

5

RG528-C1447

5.8

11.3

13.74

-5.19

6

R1952-C226

2.5

5.0

8.24

3.11

10

R2625-C223

2.5

4.9

8.57

0.94

Total

36.8

73.2

RILpopulation

Grainlength

3

RG393-C1087

19.8

40.7

-0.55

6

Wx-R1952

4.0

8.0

0.24

Total

25.5

48.6

Grainwidth

5

RG360-C734a

15.3

41.6

0.22

8

C347-R727

2.5

4.9

0.08

Total

17.2

44.7

Length-widthratio

3

RG393-C1087

9.6

21.8

-0.25

5

RG360-C734a

10.2

30.0

-0.30

6

R1952-C226

2.4

5.1

0.12

Total

26.1

61.1

Whitebelly

5

RG360-C734a

35.2

87.2

72.9

7

R1245-R1789

2.7

9.5

24.5

Total

36.6

87.9

Whitecore

5

RG360-C734a

4.5

11.6

-12.2

6

Wx-R1952

4.0

7.5

9.8

Total

8.8

17.5

利用ZS97B/H94，II-32B/H94两个组合的DH群体（简写为群体A和B）和珍汕97/德陇208组合的RIL群体（简称群体C）对稻米部分品质性状进行QTL定位。

II-32与珍汕97基因组水平差异小，600个SSR标记中表现3％多态性，两品种间除糊化温度存在一定的差异外，其他品质性状基本一致。

在AB两个群体间除了糊化温度和垩白率两个性状存在较大差异外，其他性状表现相似的分离规律。

主效QTL定位结果在两个群体间基本一致（表5），微效QTL结果存在差异。

粒长主要由第3染色体基因控制，粒宽由第5染色体基因控制。

群体A在第5染色体检测到垩白率和垩白度主效QTL，群体B则在第5和第6染色体上分别检测到影响垩白率和垩白度的主效QTL。

对于群体C，稻米和谷粒粒长和粒宽在第3和5染色体上均没有检测到QTL，只是在第1和9染色体上检测到两个QTL，LOD值均较小。

同时2003年在武汉，通过分期播种和遮光处理，调整生育期，使群体A的所有株系分别在8月上旬和9月上旬抽穗，使得两批材料的各个生长季节处于完全不同的光温环境，分析环境对稻米品质的影响，这部分结果将在年底获得初步结果。

表5三群体稻米外观性状共同主效QTL

群体

性状

LOD

染色体

标记区间

加性效应

贡献率％

A

精米长

14.4

3

RM16-MRG2538

-0.36

35.7

B

精米长

13.8

3

RM16-MRG2538

-0.60

54.9

C

精米长

3.1

1

RM312-RM81

0.25

15.3

A

精米宽

3.7

3

RM16-MRG2538

0.09

19.7

A

精米宽

2.8

5

MRG2381-RM473B

0.06

8.3

B

精米宽

9.3

5

RM574-RM289

0.11

33.2

C

精米宽

2.6

9

RM105-RM257

-0.05

27.7

A

精米厚

4.6

10

RM311-RM200

-0.04

15

B

精米厚

12.1

5

RM593-RM574

0.11

38.4

A

精米形

22.9

3

RM16-MRG2538

-0.24

58.2

B

精米形

11

3

MX6-RM16

-0.23

39.3

B

精米形

7.2

5

RM593-RM574

-0.19

24.7

A

垩白率

3.8

6

RM508-RM170

10.21

13.9

B

垩白率

12.6

5

RM593-RM574

23.55

45.2

B

垩白率

10.9

6

RM170-RM589

17.56

27.5

A

垩白度

3.7

6

RM508-RM170

4.65

12.4

B

垩白度

5.1

5

RM593-RM574

0.07

14.9

B

垩白度

8.4

6

RM170-RM589

0.08

23.8

1.2.3.3水稻蒸煮食味品质基因定位

基因定位结果见表6，群体A和B均在第6染色体的短臂MX21-RM190和长臂RM402-RM276各定位到一个影响糊化温度主效QTL，分别解释性状变异的11.3%和78.4%，加性效应作用方向相反。

MX21-RM190区间同时影响直链淀粉含量和胶稠度。

群体C也在第6染色体上的相应区间定位到控制直链淀粉含量，胶稠度和糊化温度的主效QTL，但在MX21-RM190附近区间没有检测到糊化温度QTL。

表6两群体稻米外观性状共同主效QTL

群体

性状

LOD

Chr.

标记区间

Add.

贡献率

A/B

直链淀粉含量（AC）

37.4

6

MX21-RM190

6.7

85.7

A/B

胶稠度（GC）

16.5

6

MX21-RM190

-20.2

44.1

A/B

糊化温度（GT）

6.6

6

MX21-RM190

0.6

11.3

A/B

糊化温度（GT）

19.8

6

RM402-RM276

-1.6

78.4

C

糊化温度（GT）

40.1

6

RM549-RM276

1.8

90.5

C

直链淀粉含量（AC）

55.6

6

RM204-dull

-9.8

95.6

C

胶稠度（GC）

6.7

6

Dull-RM190

5.8

28.7

1.2.3.4水稻持绿性基因定位

武育粳2号在成熟期表现较好的持绿性，利用珍汕97与它配组获得的DH群体在抽穗期和抽穗30天后分别测定剑叶和倒二叶的SPAD值、叶绿度、叶绿a、叶绿素b和总叶绿素等持绿指标。

以抽穗后30天各性状测定值与抽穗时相应性状的测定值的比值进行QTL定位。

剑叶比SPAD（rrgf）：

共检测到了4个QTL（表7）。

它们分别分布在第2（rrgf2）、7（rrgf7）、10（rrgf10）和第12（rrgf12）染色体上。

它们都表现以武育粳2号基因型对表型有增效作用。

这些QTL效应值在0.03-0.07之间。

表型贡献率为1.01%-4.43%。

二叶比SPAD（rrgs）:

共检测到5个QTL（表8）。

它们分别分布在第2（rrgs2）、3（rrgs3）、6（rrgs6）、7（rrgs7）和第10（rrgs10）染色体上。

其中rrgs3表现珍汕97基因型有对表型增效作用，加性效应为0.03，表型贡献率为1.19%；其余4个QTL表现为武育粳2号对表型有增效作用，效应值为0.04-0.05，表型贡献率为1.59%-2.45%。

剑叶持绿时间（lfyhd）：

共检测到5个QTL（表9）。

它们分别分布在第2（lfyhd2）、3（lfyhd3）、4（lfyhd4）、6（lfyhd6）和10（lfyhd10）等染色体上，其中一个QTLlfyhd2表现为以珍汕97基因型对性状表型有增效作用，而其余4个QTL表现为武育粳2号基因型对表现型有增效作用，这些QTL效应值在1.2-2.0d，解释表型方差的1.7%-4.8%。

二叶持绿时间（lsyhd）：

发现在第6（lsyhd6）和第8（lsyhd8）两条染色体上有QTL（表10）。

lsyhd6表现为武育粳2号基因型对表型有增效作用，效应值为1.9d，解释表型方差达4.5%；而lsyhd8表现为珍汕97基因型对该性状表型有增效作用，效应值为2.5d，解释表型方差达7.9%。

表7剑叶比SPAD的QTL

Ch-Ini1）

QTL

FlankingMarker

Ch-Inj1）

QTL

FlankingMarker

LR

ai2）

h2ai5）

aj2）

h2aj5）

2-2

RM154-RM211

4-9

RM241-RM303

28.2

2-16

rrgf2

RM263-RM221

5-12

RM87-RM334

39.0

-0.07

4.43

4-1

RM335-MRG5943

7-6

rrgf7

RM2-RM11

27.5

-0.03

1.14

7-5

RM125-RM2

12-4

rrgf12

RM277-RM309

18.8

-0.03

1.01

10-7

rrgf10

RM304-RM147

12-2

RM117-RM155

22.4

-0.04

1.94

表8二叶比SPAD的QTL

Ch-Ini1）

QTL

FlankingMarker

Ch-Inj1）

QTL

FlankingMarker

LR

ai2）

h2ai5）

aj2）

h2aj5）

2-3

RM211-RM233A

4-9

RM241-RM303

38.9

2-16

rrgs2

RM263-RM221

8-1

RM337-RM152

33.1

-0.05

2.45

3-3

rrgs3

RM175-RM36

7-7

rrgs7

RM11-RM346

31.3

0.03

1.19

-0.04

2.04

3-8

MRG2803-RM282

7-2

RM427-RM298

21.9

3-17

RM293-RM143

6-3

rrgs6

RM510-RM314

31.9

-0.04

1.67

7-6

RM2-RM11

9-1

RM245-RM215

20.7

0.04

1.50

10-1

rrgs10

RM222-RM216

12-1

RM19-RM117

39.3

-0.04

1.59

11-1

RM286-RM20B

12-1

RM19-RM117

20.4

表9剑叶持绿时间的QTL

Ch-Ini1）

QTL

FlankingMarker

Ch-Inj1）

QTL

FlankingMarker

LR

ai2）

h2ai5）

aj2）

h2aj5）

1-5

RM259-RM312

8-11

RM210-RM80

30.0

1-16

RM473B-RM302

4-2

lfyhd4

MRG5943-RM261

20.5

-2.0

4.8

2-6

lfyhd2

RM555-RM53

8-9

RM342A-RM284

32.2

2.0

4.7

3-20

lfyhd3

RM570-RM85

10-2

lfyhd10

RM216-RM311

25.7

-1.8

3.6

-1.2

1.7

4-2

MRG5943-RM261

5-10

RM108A-RM274

31.8

-1.9

4.3

4-13

RM348-RM131

7-1

RM295-RM427

22.2

6-3

RM510-RM314

6-7

lfyhd6

RM121-RM136

29.4

-1.9

4.2

表10二叶持绿时间的QTL

Trait

Ch-Ini1）

QTL

FlankingMarker

Ch-Inj1）

QTL

FlankingMarker

LR

ai2）

h2ai5）

aj2）

h2aj5）

lsyhd

2-2

RM154-RM211

11-1

RM286-RM20B

18.7

6-2

RM190-RM510

6-7

lsyhd6

RM121-RM136

25.1

-1.9

4.5

7-1

RM295-RM427

8-4

lsyhd8

RM25-RM126

23.3

2.5

7.9

1.2.3.5产量性状定位

利用珍汕97与大穗亲本HR5组合衍生的RIL群体进行两年田间试验并构建遗传连锁图谱，对产量性状进行了QTL分析（表11）。

第7染色体两年均检测到产量QTL，在2003年贡献率达到22.8％。

两年均在第3和第7染色体上检测到影响每穗颖花数主效QTL，尤其以第7染色体上的QTL加性效应最大（19.6和23.7），同时第7染色体上的QTL影响每穗实粒数。

对灌浆期主要功能叶剑叶长和宽也进行了定位，第7染色体上的QTL影响剑叶长，第4染色体上的QTL控制剑叶宽。

同时第7染色体上的QTL也是控制抽穗期的主效QTL。

表11大穗群体产量性状和剑