细胞培养技术_第一讲.pptx
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细胞培养技术_第一讲.pptx
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绪论,细胞培养的基本概念细胞培养的发展简史细胞培养的优缺点细胞培养的应用领域,绪论,细胞培养(cellculture),细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行体外培养和研究的技术。
即:
从活体中取出小块组织分离出细胞,在一定条件下进行培养,使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。
细胞培养(cellculture),是指用机械或化学的方法将组织分散成单个细胞而进行的培养。
组织培养(tissueculture)是指把活体的组织取出分成小块,直接置于培养瓶底或通过胶原纤维血浆支持物的培养瓶底来进行培养。
其特点是:
组织不失散,细胞保持原有的组织关系。
器官培养(organculture)是将活体中器官或器官一部分取出,在体外生长、生存,并使其保持器官原有的结构和功能特征的培养。
其特点是:
培养的器官在合适的条件下能生长和分化,存活数周或1年。
体外培养种类,绪论细胞培养可分为群体培养和克隆培养两种。
群体培养(massculture):
即将大量细胞置于培养瓶中,让其贴壁或悬浮生长,形成均匀的单层细胞或单细胞悬液。
克隆培养(cloneculture):
即将少数细胞加入培养瓶中,贴壁后彼此间隔距离较远,经过繁殖每一个细胞形成一个集落,称为克隆。
群体培养(左)和克隆培养(右),原代培养第4天,成纤维样细胞散布于培养瓶底,个别集落形成,细胞围绕中心漩涡状排列100,原代培养第7天,多个集落形成并融合100,组织培养常用术语,原代培养(primaryculture):
从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。
传代培养(passageculture):
将细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代培养。
注:
传代(passage,subculture),术语细胞系(cellline):
原代培养经首次传代成功后即成细胞系,由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cellstrain):
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的特殊性质或标志,并能稳定保持这些特性的培养物。
克隆(clone):
指单个细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
术语细胞周期(cellcycle):
从上一次分裂结束至下一次分裂终了结束经历的时相过程,由分裂间期和分裂期构成。
二倍体细胞系或株(diploidcelllineorstrain):
具有二倍体核型的细胞系或株。
有限细胞系或株:
指仅能有限传代次数,通常50代左右,然后衰亡。
无限细胞系或株:
具有无限增值能力的细胞系或株。
细胞凋亡:
指体内外因素触发导致的程序性细胞自杀死亡。
干细胞(stemcell):
指体内未分化的具有继续分化潜能的细胞。
细胞接触抑制(cantactinhibition):
贴壁生长的正常细胞一旦汇合、相互接触后变停止分裂细胞杂交(cellhebridization):
指2个或多个细胞融合导致一个多核细胞。
术语,有分化特性的细胞系和细胞株,细胞培养的发展简史,德国人Roux(1885)用温生理盐水体外培养鸡胚组织神经板并存活数天,被认为是组织培养的萌芽试验。
1903年Jolly用盖片悬滴培养法,培养蝾螈白细胞生活一月,提示组织或细胞离体后,在人工培养条件下,仍能生存。
1907年Harrison创建了“哈里森悬滴培养法”,将蛙胚原始脊髓节段,移到事先滴有从成体蛙淋巴囊吸取的新鲜淋巴的盖玻片上,淋巴很快凝固,使组织小块固定在一定的位置上。
然后将盖玻片倒置于一块中央凹陷的厚载玻片上,盖玻片的周缘用蜡封固。
蛙胚神经组织存活了数周,由此建立了体外培养组织和细胞的基本模式系统。
1923年,Carrel设计了卡式瓶培养法,扩大了组织的生存空间。
组织培养发展示意图,美国学者LewisWH等人工合成培养基代替血浆和胚胎提取液等天然培养液的培养方法。
1957年Dulbecco等采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法,获得了的单层细胞培养,单层培养成了组织培养普遍应用的技术。
促进了细胞系(cellline)的建立。
近年各种条件已商品化系列化,应用冷冻技术,各国建立细胞库,发展简史,我国组织培养的发展,20世纪30年代传入我国。
20世纪50年代起步。
20世纪70年代,成为医学和生物学研究中普遍应用的手段。
细胞培养的优点,1、活细胞:
能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动。
2、可控制:
选择对象:
均一性、重复性(类型、性质、阶段)调节条件:
各种因素(物理、化学、生物等因素)利用方法:
研究技术、记录方法,3、应用广:
领域多:
医学研究、生物技术、基因工程等对象广:
各种动物(低等动物-高等动物-人类)一种动物(不同年龄、不同组织)正常或异常(肿瘤),4、较经济:
可提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。
优点,细胞培养的缺点,人工模拟的培养环境与体内相比仍然存在一定差异,培养的细胞或组织,其形态或功能会发生不同程度的改变。
与体内主要不同,相对孤立、相对单一、缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响。
主要表现失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋向单一化。
提示要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。
缺,点,细胞培养的应用领域,一、在病毒学研究中的应用二、在免疫学研究中的应用三、在分子生物学研究中的应用四、在遗传学研究中的应用五、在药理学研究中的应用六、在毒理学研究中的应用七、在肿瘤学研究中的应用八、在器官移植中的应用九、细胞生物学的基础研究十、细胞工程学的应用研究,病毒检验方法,病毒培养全程5-30天,病毒培养:
细胞培养接种至细胞,细胞病变判定,荧光染色:
病毒涂片血清型专一抗体荧光染色,中和试验:
培养出的病毒与血清型专一性抗血清作用,再接种至细胞,病毒学,检测病毒,CPE,正常细胞,病变细胞,Hybridomas,杂交瘤技术,克隆抗体制备,在分子生物学研究中的应用,1、体外培养细胞的转化2、DNA转导技术3、基因诊断和基因治疗,器官移植组织工程,种子细胞(干细胞)支架材料,目前应用较多的主要有胶原(以I型胶原为主)、明胶、甲壳素、壳聚糖、天然珊瑚及其衍生物等。
可降解高分子材料目前应用较多人工合成可降解高分子材料主要是聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)以及它们之间的各种共聚物。
细胞培养基本技术,洗刷,细胞培养,人基因猪等,细胞培养(cellculture)技术,即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术,是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
细胞培养的基本条件,无菌条件细胞生长条件细胞检测条件细胞保存条件实验室安全条件,一、细胞培养的无菌环境,无菌室的结构:
一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。
(使用前)紫外照射(1小时)每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸(2小时)和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒,生物安全柜,使用前开启柜内紫外灯照射1030分钟,预工作1015分钟,以除去臭氧和使用工作台面空间呈净化状态。
使用完毕后,要用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净。
还要定期用福尔马林熏蒸。
常用培养器皿及清洗消毒,玻璃器皿的清洗一般经过浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四个步骤新的橡胶制品洗涤方法0.5MNaOH煮沸15分钟,流水冲洗,0.5MHCl煮沸15分钟,流水冲洗,自来水煮沸2次,蒸馏水煮沸20分钟,50烤干备用。
消毒前包装,常用的包装材料牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒、铝箔,火焰消毒,在无菌环境进行培养时,首先要点燃酒精灯。
以后一切操作,如打开或封闭瓶口等,都需在火焰近处并经过烧灼进行。
培养瓶滴管、试管、吸管,细胞培养的实验用品,细胞培养瓶25平方厘米,正方斜颈25平方厘米,三角斜颈75平方厘米,正方斜颈75平方厘米,三角斜颈150平方厘米,正方斜颈,细胞培养板,6孔,12孔,24孔,48孔96孔,细胞培养皿,35mm60mm100mm,冻存管,1.2ml2ml,5ml,离心管,15ml50ml细胞刮,滤器,大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
液氮罐,何处购买细胞,ATCC细胞库(www.atcc.org).美国菌种保藏中心又称美国模式菌种收集中心(ATCC)是位于马里兰洲洛克菲勒的一家私营的,非赢利性组织。
目前它可以提供以下物品细胞系3000种细菌和噬菌体15000种动植物病毒2500种原生动物1200种以及重组物品欧洲动物细胞库(ECACC)和日本细胞库(RCB),国内细胞库,中国科学院细胞库中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心联系方法:
地址:
上海市岳阳路320号,200031电话:
021-54920404,54920405Fax:
021-54920406联系人:
陈松华,徐惠均e-mail:
http:
/培养物/生物材料菌种保藏机构,订购程序,向中心订购培养物,可查阅CCTCC培养物目录,并向CCTCC提出订购培养物的名称、CCTCC保藏号等内容。
联系方式可通过电话、传真,信函,电子邮件等方式。
电话:
027-87682319传真:
027-87883833E-mail:
细胞系:
500元/每株菌种准备时间一般情况CCTCC收到订购人的汇款后的3-4天寄出,每周寄送二次(周一,周五)。
二、细胞的生长条件细胞的营养,碳水化合物、氨基酸和脂类三大类也需要一定量的无机盐、维生素和微量元素,细胞培养常用液体,水平衡盐溶液pH调节液消化液抗生素溶液培养基,水:
新鲜制备的三蒸水或去离子水,细胞培养用液的配制,
(一)水,平衡盐溶液,主要由无机盐和葡萄糖配制而成作用维持渗透压、缓冲和调节酸碱度常用的缓冲液生理盐水PBSHanks液(D-Hanks常用于配制胰酶溶液),H调节液,碳酸氢钠液Hepes缓冲液是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂通常使用浓度为1015mM,消化液,胰蛋白酶溶液主要作用是使细胞间的蛋白质水解,从而使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞游离分散开来常用浓度为0.25%或5%胰蛋白酶。
EDTA溶液作用机制是破坏细胞间的连接。
对于一些贴壁特别牢固的细胞,可用EDTA和胰酶的混合液EDTA溶液的使用浓度为0.02%,配制时应加碱助溶(3)胶原酶溶液胶原酶在上皮类细胞原代培养时经常使用,胶原酶作用的对象是胶原组织,因此不容易对细胞产生损伤。
抗生素溶液,通常是青霉素和链霉素联合使用,俗称“双抗溶液”。
青霉素主要是对革兰阳性菌有效,链霉素主要对革兰阴性菌有效。
加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌污染。
培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。
庆大霉素:
每毫升100单位,培养基,分天然培养基和合成培养基天然培养基:
血清血浆组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液),合成培养基,根据细胞生存所需物质的种类和数量,用人工方法模拟合成的。
包括四大类物质:
无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物目前常用培养基:
RPMI-1640、DMEM、TC199、MEM、另有无血清培养基、无蛋白培养基,RPMI-1640MediumRPMI-1640mediumwasdevelopedbyMooreetal.,atRoswellParkMemorialInstitute,hencetheacronymRPMI.TheformulationisbasedontheRPMI-1630seriesofmediautilizingabicarbonatebufferingsystemandalterationsintheamountsofaminoacidsandvitamins.RPMI-1640mediumh
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