α淀粉酶抑制剂的研究进展模板.docx
- 文档编号:26260290
- 上传时间:2023-06-17
- 格式:DOCX
- 页数:11
- 大小:24.30KB
α淀粉酶抑制剂的研究进展模板.docx
《α淀粉酶抑制剂的研究进展模板.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《α淀粉酶抑制剂的研究进展模板.docx(11页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
α淀粉酶抑制剂的研究进展模板
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Keywords1
引言2
1α-淀粉酶抑制剂的介绍2
1.1α-淀粉酶抑制剂的来源2
1.2α-淀粉酶抑制剂的特性研究3
2α-淀粉酶抑制剂的制备4
2.1来源于天然植物的α-淀粉酶抑制剂4
2.11豆类植物5
2.12麦类植物5
2.13齿苋类植物6
2.14其他植物7
2.2来源于微生物的α-淀粉酶抑制剂7
3α-淀粉酶抑制剂的分离纯化8
4α-淀粉酶抑制剂的检测方法9
4.1碘比色法9
4.23,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法9
5α-淀粉酶抑制剂的筛选方法10
6α-淀粉酶抑制剂的研究进展11
6.1国内外研究概况11
α淀粉酶抑制剂的研究进展
摘要:
α-淀粉酶抑制剂是一种糖苷水解酶抑制剂。
抑制糖类消化吸收药物,减少糖分的摄取,降低血糖和血脂含量,还可作为抗虫基因。
目前在医学和农业上具有广泛的用途。
本文对α-淀粉酶抑制剂的制备、检测、筛选方法、特性以及发展进行了综述,并对其前景作了展望。
关键词:
α-淀粉酶抑制剂,制备,检测,筛选方法,特性
Researchprogressofα-amylaseinhibitor
Abstract:
α-amylaseinhibitorisakindofglycosidehydrolaseinhibitor,Itcanbepotentiallyuseasmedicinesofdiabetesowingtoinhibitingglucosefrombeingabsorbedinthedigestivetracts.Whichcanreduceingestionofsugarandbloodfatcontetandhashypoglycemicactivity,anditsgenecanbeusedasinsect-resistantgenesincropsbreeding.Thereiscomprehensive,applicationinagricultureandmedicine.Thepreparation、detection、screeningmethods、characteristicsanddevelopmentoftheα-amylaseinhibitorswerereviwedinthispaper,andtheprospectswereforecasted.
Keywords:
α-amylaseinhibitor,preparation,detection,screeningmethods,characteristics.
引言
α-淀粉酶抑制剂属于糖苷酶抑制剂的一种,是一种纯天然生物活性物质,主要存在于植物种子、胚乳和微生物代谢产物中,目前在医药和农业上具有广泛的用途。
α-淀粉酶抑制剂能够有效的抑制肠道内唾液及胰淀粉酶的活性,阻碍食物中碳水化合物的水解和消化,减少糖分的摄取,降低血糖的血脂含量水平。
食用后不产生高血糖,从而胰岛素分泌减少,脂肪合成降低,体重减轻。
临床医学上用于防治糖尿病、高血糖、高血脂等病症;农业上α-淀粉酶抑制剂基因可以作为抗虫基因,减少杀虫剂的使用。
另外,在酶学研究方面,可作为探究α-淀粉酶活性部位的分析工具,作为通过选择作用测定α-淀粉酶同工酶的反应物,作为蛋白质与蛋白质之间识别和相互作用的模林体系等方面具有内在效应。
α-淀粉酶抑制剂应用已被广泛深入研究,本文对α-淀粉酶抑制剂研究进展作一概述。
1α-淀粉酶抑制剂的介绍
1.1α-淀粉酶抑制剂的来源
大多数α-淀粉酶抑制剂已从微生物源(主要集中在链霉菌属)、植物源(植物中普遍存在,尤其是禾谷作物和豆类作物的种子)获得,少数从哺乳动物中获得,而且也在合成物质中发现过。
天然存在的
α-淀粉酶抑制剂有三种类型[1]分别为:
(1)微生物产带一个寡生物胺单位的含氮碳水化合物;
(2)微生物产多肽,如paim(来自微生物的猪胰腺α-淀粉酶抑制剂)和Haim(微生物起源人α-淀粉酶抑制剂);(3)在谷类、豆类以及其它较高等植物中发现的大分子蛋白质抑制剂。
1.2α-淀粉酶抑制剂的特性研究
通常的α-淀粉酶抑制剂都是些有机化合物,它们与酶形
成酶抑制剂复合物而使酶失活。
在化学结构上,它们可以是蛋
白质、多肽和碳水化合物[2]。
根据它们的化学性质,因来源不同
其化学物理特性而不同。
由多种不同的链霉菌属种产生的淀粉酶抑制剂具有低的分子量,大约在500~2000Da(道尔)之间,而且是α-淀粉酶中非常有效的抑制剂,它们有三种类型
(1)oligostatins寡糖制菌素:
(2)amylosatins制淀粉酶素:
(3)tresatins。
它们共用有拟双糖单元工寡生物胺或脱氢寡生物胺,不同数目α-D-葡萄糖基团以α-1,4糖苷键连接,而在tresatins中与一个α-1,1-糖苷键葡萄糖连接。
这个含N个碳水化合物对几个葡萄苷酶包括α-淀粉酶有抑制作用。
Tajiri等报道从链霉菌属中产生α-淀粉酶抑制剂具有14种肽,一些是如上所述的含N个碳水化合物,另一些是分子量为3936-8500Da之间的聚合肽,它们是由单个多肽链组成,且不含碳水化合物,具有质序列同源性,特别重要的是位于18~20的WRY序列和位于59~70的氨基酸,它们被认为和α-淀粉酶的结合有关。
X射线衍射晶体分析法显示的三级结构,表明WRY序列在分子表面显著呈现,而位于59~70氨基酸残基邻近DEF序列。
具有活性的蛋白质从小麦、大麦、小米、高粱、谷物、花生、大豆、芋头根和一些其它植物中分离。
抑制剂分子量范围为9KD~63KD。
另外复合抑制剂因其抑制的特异性不同一般可能为同工酶,已有一些复合抑制剂从小麦、大麦及小米中被分离。
2α-淀粉酶抑制剂的制备
目前,国内外对于α-淀粉酶抑制剂的研制大都经历以下程序:
原料→粉碎→水浸→离心分离→上清液→盐析(沉淀再溶解)→加热灭酶→离心分离α-淀粉酶抑制→上清液→透析→浓缩→干燥→成品
但是根据原料的不同,α-淀粉酶抑制剂的生产过程又存在着较大的差别,下面就从天然植物和微生物两个方面介绍α-淀粉酶抑制剂的加工工艺。
2.1来源于天然植物的α-淀粉酶抑制剂
天然的α-淀粉酶抑制剂主要存在于植物种子的胚乳中,目前已经从小麦、豆类、薯蓣、野生苋属等植物种子中分离得到α-淀粉酶抑制剂。
2.11豆类植物
从白豆中提取的α-淀粉酶抑制剂活性较高,对哺乳动物胰α-淀粉酶有很强的抑制作用。
杨明琰等采用乙醇分级沉淀、CMⅡ纤维素离子交换柱层析及凝胶柱层析,从白豆中分离纯化得到相对分子量为3ku的白豆α-淀粉酶抑制剂,其对淀粉酶的抑制类型属于非竞争性抑制剂[3]。
杨秀芳等将白豆在20℃水中浸泡24h,向浸透的白豆中加入0.1mol/L的磷酸钠缓冲溶液,研磨,匀浆[4]。
浆液离心,上清液用0.1mol/L的HCl酸化至pH5.0,再用冷冻离心机4℃离心10min,在该酸化液中加入硫酸铵使饱和度达到50%,静置20h,离心沉淀蛋白,溶于0.05mol/L的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液中,放入透析袋,在相同缓冲溶液中透析1d,得酶液。
Dayler等利用酸性缓冲液从一种名为P.Vulgaris的豆中提取出α-淀粉酶抑制剂,用DEAE-Cellulose和反相高效液相特殊设备,经梯度洗脱得到α-淀粉酶抑制剂的异构体α-淀粉酶抑制剂Ⅰ。
Yamada等从宽叶菜豆中提取分离出2种α-淀粉酶抑制剂,这两种抑制剂对害虫体内α-淀粉酶均有抑制作用,但表现不同的特异性。
米切尔·什科普等利用超临界CO2提取技术,从豆类物质中提取和纯化了α-淀粉酶抑制剂[5]。
2.12麦类植物
王转花等研究了甜荞和苦荞这2种荞麦中的α-淀粉酶抑制剂。
先用水浸泡荞麦3h,再用丙酮脱脂,对脱脂后的荞麦粉用pH6.8的磷酸盐缓冲液水浴提取3h,离心分离,上清液在磷酸盐缓冲液中透析,得到活性大于0.037u/mg的α-淀粉酶抑制剂[6]。
张万山等将小麦和水以1∶4的比例混合浸提,离心分离出上清液,经过硫酸铵盐析、水浴加热灭酶、离心分离和醋酸钠溶液透析制得粗品,经过柱层析纯化,获得比活为921.7u/mg的高纯度α-淀粉酶抑制剂[7]。
Franco等将BR35小麦磨碎后,用固液比为1∶5的NaCl溶液提取小麦粉,并经高速离心、硫酸铵沉淀、反相高效液相洗脱层析,得到α-淀粉酶抑制剂的成品[8]。
Miyazaki等提出了用弱酸弱碱、水和醇溶液对小麦粉和蛋白粉进行处理,提取α-淀粉酶抑制剂的工艺[8]。
加工过程中用多聚糖对初提上清液进行沉淀,随后用金属离子除去多聚糖,再用离子交换柱脱除金属离子,得到高抑制活性的α-淀粉酶抑制剂。
2.13齿苋类植物
王琳等从野生苋属植物(Amaranthuspaniculatus)籽实中分离纯化出α-淀粉酶的一种新型蛋白质类抑制剂,是目前报道的α-淀粉酶的蛋白质类抑制剂中相对分子质量最小的。
初步分析结果表明,这种抑制剂由9个氨基酸残基组成,其N端为焦谷氨酸。
在弱酸性条件,下它能以非竞争性抑制作用方式有效抑制美洲蜚蠊消化道α-淀粉酶的活性,但对人唾液淀粉酶活性无影响。
2.14其他植物
高小平等对126种经水煮、醇沉提取的常用中药进行α-葡萄糖苷酶抑制剂活性筛选,在0.1mg/mL反应体系下,5种中药提取物抑制α-淀粉酶活性[9]。
张冬英等对普洱茶中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺进行了研究。
通过正交实验方法确定普洱茶中α-淀粉酶抑制剂的最佳提取工艺条件为:
浸提时间为3h,固液比为1:
5,乙醇浓度为90%[10]。
王琳等从野生苋属植物籽实中分离纯化出了α-淀粉酶的一种新型蛋白质类抑制剂,初步分析结果表明,这种抑制剂有9个氨基酸残基组成,其N端为焦谷氨酸。
2.2来源于微生物的α-淀粉酶抑制剂
国外对于微生物α-淀粉酶抑制剂的研究开展得较早1970年Niwa等报道在一种链霉菌培养液中发现了可以抑制α-淀粉酶抑制剂诺吉利霉素。
日本Narimasa报道了由真菌CladosporiumherbarumF-28产生的蛋白类抑制剂,打破了传统认为只有放线菌才能产生抑制剂的观点[8],并且此种酶抑制剂对哺乳动物α-淀粉酶有极高的特异性。
Namiki等报道从一株链霉菌发酵液中分离出一种新的寡糖类α-糖苷类水解酶抑制剂Adiposin[11],体内实验对胰腺或唾液的α-淀粉酶有很强的抑制作用,并能降低血糖和血脂的浓度。
Tajiri等报道从链霉菌属中产生的α-淀粉酶抑制剂具有14种肽,一些是含N碳水化合物,另一些是由单个多肽链组成的分子量为3926~8500Da之间的聚合肽[11]。
国内酶抑制剂方面的研究始于70年代末。
福建省微生物研究所从土壤中筛选出产生酶抑制剂的产生菌S-2-35菌株,并对其代谢产物的分离及其理化性质进行深入研究,成果显著。
上海医药工业研究所也与日本和美国的多家公司及研究机构共同研究,建立了淀粉酶抑制剂等筛选模型[8]。
河北省科学院生物研究所从链霉菌中获得产生α-淀粉酶抑制剂的菌种S-19-1,系国内首先从淡紫灰类群中筛选出该抑制剂菌株,建立了适合S-19-1菌株的发酵工艺。
王欣荣等采用α-淀粉酶及蔗糖酶抑制实验,从2000株放线菌发酵液中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂,结果从淡紫灰链霉菌HW110(StreptomyceslavedulaeHW110)发酵液中分离到HW110,其抑酶活性与阿卡波糖(Acarbose)相当[12]。
3α-淀粉酶抑制剂的分离纯化
α-淀粉酶抑制剂的来源不同,其分离纯化的方法也有所
不同。
从植物源获得的α-淀粉酶掏剂分离纯化方法,据Ho等报道,主要步骤包括磨碎、热处理或用水浸提、用硫酸铵沉淀或乙醇分离、过EDTA-cellulose柱层析、SephadexG-75柱凝胶层析以及CM-cellulose柱层析后分离,冻干得白色粉末状酶。
从微生物来源获得的α-淀粉酶制剂的分离纯化方法,据Jajiki
报道,主要步骤是将发酵液过滤除去不溶物,清液中加活性炭,活性炭吸附后,用乙醇洗脱,经多次柱层柱和纸层柱,再经SephadexG-15柱凝胶过滤,再经HPCL得单个活力峰,收集活力峰,冻干得白色粉末状酶。
4α-淀粉酶抑制剂的检测方法
目前,对于α-淀粉酶抑制剂的检测项目主要包括活性、含量纯度及相对分子质量文。
献显示,α-淀粉酶抑制剂一般都为蛋白质类物质,其含量、纯度和相对分子质量都可依照蛋白质的测定方法进行。
而抑制活性的测定方法主要包括碘比色法和3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法(Bernfeld法)2种[11]。
4.1碘比色法
测定过程在试管中进行。
取0.25mL浓度为1mg/mL用磷酸盐缓冲液配制的α-淀粉酶,加入0.25mL待测液,37℃结合30min。
加入1%可溶性淀粉溶液1mL、37℃恒温反应15min后加碘显色,于660nm处测定吸光度值。
空白管不加淀粉酶和抑制剂,对照管不加抑制剂。
根据吸光度的差异计算抑制剂的相对活度。
4.23,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法
取适量用0.12mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.10)制备的α-淀粉酶储备液,加入100μL浓度为10g/L的可溶性淀粉,37℃反应5min。
反应完成后加入500μL3,5-DNS,沸水浴10min,取出反应液
室温冷却15min,在546nm处测定吸光度值。
调整抑制剂溶液及α-淀粉酶溶液的浓度或用量,使A546nm的值在0.4~0.7范围内为宜。
程秀丽[13]根据α-淀粉酶活性的测定方法,将淀粉降解产物还原糖在特定条件(添加DNS)下比色,测定其含量,通过标准曲线计算出酶活性,求出α-淀粉酶抑制剂的活性。
此种方法可作为高通量
筛选抗糖尿病药物的有效方法。
α-淀粉酶抑制剂是目前治疗糖尿病和减肥领域较为安全的一类药物。
它广泛分布在许多天然植物中,尤其在麦类和豆类这些大宗粮食作物中含量较高。
开发α-淀粉酶抑制剂等产品,有利于激发农民
种粮积极性,对增加农民收入有意义。
5α-淀粉酶抑制剂的筛选方法
目前在α-淀粉酶抑制剂的体外筛选实验中,α-淀粉酶的主要来源多为胰α-淀粉酶,胰α-淀粉有着来源不易、成本高等缺点。
α-淀粉酶抑制剂测定方法多采用3,5-二硝基水杨酸法,其测定原理:
α-淀粉酶抑制剂特异性地抑制α-淀粉酶,减少α-淀粉酶对淀粉水解,使得淀粉降解产物减少,3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原的棕红色氨基化合物减少,在一定波长下吸光度值降低。
通过对添加抑制剂前后生产还原糖的量进行定量测定,可从前后变化测得α-淀粉酶抑制剂的活性。
在Bemfeld法测定α-淀粉酶活性中,要求调整抑制剂及α-淀粉酶液浓度使得A值在0.4~0.7之间,范围较窄,不利于比较不同抑制剂活性及量效关系。
6α-淀粉酶抑制剂的研究进展
6.1国内外研究概况
国外α-淀粉酶抑制剂研究起步较早,早在上世纪四十年代就有小麦种子中α-淀粉酶抑制剂的报道。
它是一种电迁移率为0.2,分子量为21000的蛋白质。
但在随后的25年间很少有这方面的报道[8]。
之后Shainkin和Birk[9]提出小麦粉中存在两种α-淀粉酶抑制剂,并阐述了它们的分离和性质。
它们的电迁移率不同,对不同来源的α-淀粉酶专一性不同。
从后来的研究知道:
它们在小麦种子中是多分子形式的蛋白质,能不同程度的抑制昆虫和哺乳动物的淀粉酶。
1945又在普通大豆上有过报道,1972年α-淀粉酶抑制剂曾经在微生物上有过报道,因其在医药上的价值而被广泛研究。
α-淀粉酶抑制剂在20世纪70年代被深入研究,在20世纪80年代和90年代,由于发现其在医学上的重要性,尤其在抑制糖尿病和高血糖以及对昆虫选择性控制等方面具有重要作用而加速研究。
70年代以来,已研究发现100多种来自植物和微生物的抑制α-淀粉酶的活性物质,有的已经进入临床实验。
微生物来源的糖苷水解酶抑制剂的筛选研究在近些年来已成为比较活跃的领域之一,尤其在联邦德国和日本。
现已报道的这类酶抑制剂20~30种。
Namiki等报道从一株链霉菌发酵液中分理出一种新的寡糖类α-糖苷水解酶抑制剂Adiposin。
体内实验Trestatins对胰腺或唾液的α-淀粉酶有很强的抑制作用,并能降低血糖和血脂的浓度,是一种新的α-淀粉酶抑制剂[2]。
国内酶抑制剂方面的研究始于70年代末,福建省微生物所从土壤中筛选到产生的淀粉酶抑制剂的产生菌S-2-35菌株,并对其代谢产物的分离及其理化性质进行深入研究,研究成果显著[1],上海医药工业研究所在80年代初就开始与日本东京微生物化学研究所,日本麒麟啤酒和美国辉瑞公司等合作从土壤中寻找新的有为生物产生的生理物质的研究,建立淀粉酶抑制剂等的筛选模型[2]。
国内研究突出得是河北科学院生物研究所从链霉菌中获得产生α-淀粉酶抑制剂的菌种S-19-1,是国内首次从淡紫灰类群中筛选出该抑制剂菌株,建立适合S-19-1菌株的发酵工艺,并对其化学性质进行研究。
发酵滤液中的α-淀粉酶抑制剂活性超过70%。
经BALB小鼠试验,无任何毒副作用。
该研究已获得中国科技成果奖。
江西省中医药研究所从小麦中提取一种α-淀粉酶抑制剂,并对其理化性质及结构组成作了进一步研究。
目前,建立在分子生物学基础上的植物基因工程技术,研究得较多的抗虫基因是α-淀粉酶抑制剂基因,α-淀粉酶抑制剂在禾谷类和豆科作物的种子中含量较为丰富。
它的杀虫机理就在于其能抑制昆虫消化道内淀粉酶的活性,使食入的淀粉不能消化水解,阻断了主要能量来源,同时,α-AI和淀粉消化酶结合形成EI复合物,也会刺激昆虫的消化腺过量分泌消化酶,使昆虫产生厌食反应,导致发育不良或死亡。
在小麦或大麦中已克隆出多个淀粉酶抑制剂基因。
转化烟草地实验证实,该基因在体内可正确表达,中科院从事菜豆淀粉酶抑制剂基因地研究正处于实验阶段。
参考文献:
[1]徐成勇,诸葛建.微生物来源的酶抑制剂研究进展.微生物学报,1999,39
(2):
185~187.
[2]柳钟勋.微生物来源的酶抑制剂的研究进展.抗生素,1984,(93):
166~175.
[3]杨明琰,宋纪蓉,等.白豆α-淀粉酶抑制剂糖蛋白的提纯及性质研究[J].西北大学学报,2007,37(5):
753~757.
[4]杨秀芳,吴明鑫,等.白豆中α-淀粉酶抑制剂的提取及其酶学性质的研究[J].应用化工,2007,36(8):
755~757.
[5]米切尔·什科普,迪利普·肖科希.纯化淀粉酶抑制剂及用于获得该纯化淀酶抑制剂的新颖方法[P].CN03815393.2003.
[6]王转花,张政,等.荞麦α-淀粉酶抑制剂的初步研究[J].食品科学,2004,25(10):
84~87.
[7]张万山,杨华英.小麦α-淀粉酶抑制剂的提取[J].中国生化药物杂志,1999,20(3):
143~144.
[8]贾光锋.α-淀粉酶抑制剂的制备及检测[J].食品与药品,2007,9
(2):
34~36.
[9]高小平,张蔚瑜,等.中药提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选[J].天然产物研究与开发,2003,15(6):
536~538.
[10]张冬英,施兆鹏,等.优化普洱茶中α-淀粉酶抑制剂的提取工艺[J].普洱,2007
(1):
104~106.
[11]吕凤霞,陈兆新.等.α-淀粉酶抑制剂的研究进展[J].食品科学,2002,23(3):
152~155.
[12]王欣荣,孙敏,等.α-葡萄糖苷酶抑制剂HW110产生菌的研究[J].生物技术,2005,15
(2):
39~41.
[13]程秀丽.α-淀粉酶抑制剂的活性测定[J].药剂探讨,2004、3(4):
71-72.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 淀粉酶 抑制剂 研究进展 模板