农药生物测定.docx

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农药生物测定

《农药生物测定》复习重点

农药生物测定的简史

第一时期：

19世纪末~1920至1923年间:

研究出测定白喉抗毒素含量的标准方法.特点：

都是用单个动物体作直接的效力测定，将待测的药剂与标准药剂相比较来估计其相对药效。

第二时期：

20世纪30年代至20世纪70年代

1937年欧文首先提出了系统的生物测定方法报告;1947年芬尼出版了系统的生物测定统计方法;1950年芬尼及古德温出版《生物测定标准化》一书;1957年布斯维纳（）出版《杀虫剂生物测定评述》;1959年张宗炳在其《昆虫毒理学》一书中,以专章对杀虫剂生物测定及统计分析作了系统的论述;1963年张泽溥等出版《杀虫剂及杀菌剂的生物测定》;1984年张泽溥出版《生物测定统计》专着。

特点：

研究出以生物群体为反应基础的生物测定方法，提高了测定精度。

第三时期：

20世纪70年代至今

1.研究利用昆虫神经电生理方法检测化合物对昆虫的拒食活性已取得进展。

2.杀菌剂也由以传统的病原菌离体试验方法为主，转变为寄主植物上的活体试验为主。

3.20世纪80年代以来介于活体与离体之间的植物组织培养生物测定方法受到了广泛的重视，有可能发展成一类新的杀菌剂生物测定方法。

如适用于细菌性病害筛选的块根法；适用于大麦白粉病筛选的芽鞘表皮法等。

第四时期：

20世纪70年代至今发展趋势：

1.随着分子生物学及生理、生化方面研究技术的提高，运用分子生物学技术和生化技术进行生测的研究亦发展很快，如对新药剂的筛选及利用酶学试验进行害物抗药性的监测和增效剂的筛选等等。

2.由于电子计算机软、硬件的迅速发展，农药生物测定中的统计分析，早已普遍程序化和微机化，使生物测定结果的分析计算更加简便、快捷，也更加准确、可靠。

农药生物测定中应注意的几点：

1.运用特定的试验设计；

2.在一定条件下（局部控制）进行；

3.均以群体反应为基础，以生物统计为工具。

农药生物测定的定义:

运用特定的试验设计，利用生物对农药的反应，并以生物统计为工具，分析供试对象在一定条件下的效应，来度量某种农药的生物活性。

农药生物测定的内容及应用

1.测定农药对昆虫、螨类、病原菌、线虫、杂草以及鼠类等靶标生物的毒力或药效

2.研究农药对植物的生理作用

3.筛选新农药品种

4.研究化合物的化学结构与生物活性关系的规律，为定向创制新农药提供依据

5.研究农药的理化性质及加工剂型与毒效关系，提高农药的使用效果

6.研究有害生物的生理状态及外界环境条件与药效的关系，以便提高农药使用水平，做到适时用药

7.测定不同农药混用的效力，为农药的合理混用及寻找增效剂提供依据

8.对有害生物抗药性的监测和研究克服或延缓抗药性发展的有效措施

9.研究农药的作用机理及生理效应

10.还可利用敏感生物（如蚊幼虫等）来测定农药的有效含量及残留量。

11.测定农药对温血动物及有益生物的毒性

农药生物测定基础

1.药剂浓度的表示方法:

（1）百分浓度

（2）百万分浓度（ppm）（3）倍数法（4）波美度

（1）百分浓度:

分容量百分浓度和质量百分浓度两种。

液体与液体之间配药时常用容量百分浓度。

固体与固体或固体与液体之间配药时多用质量百分浓度。

新增登记和生产许可的农药产品，其有效成分含量原则上统一以质量百分含量（%）表示。

（2）百万分浓度（ppm）

ppm：

partpermillion（百万分之…）10-6

ppb：

partperbillion（十亿分之…）10-9

ppt：

partpertrillion（万亿分之…）10-12

与“％”一样，ppm、ppb、ppt不是浓度单位。

但可定义为摩尔比、体积比、质量比或质量体积比等。

（2）百万分浓度:

即100万份药液或药粉中含有这种药剂成分的份数，以10-6（ppm）表示，其基本单位为百万分之一。

常用mg/kg（μg/g）或mg/L（μg/mL）表示，即每L或每kg物质中所含的物质的mg数。

如：

1ppm阿维菌素丙酮溶液＝1mg/L….

3）倍数法

①内比法：

稀释100倍或100倍以下计算稀释量时，要扣除原有药剂所占的那一份数量。

如：

稀释50倍时，表示用药剂1份加水49份。

②外比法：

稀释100倍以上计算稀释时，则不扣除原有药剂所占的那一份。

如：

稀释1000倍，则用原药剂1份加水1000份。

在稀释农药时,如果未注明按容量稀释则均按质量计算！

（4）波美度

石硫合剂有效成分的表示单位，用“oBe”表示，它表示浓度与比重的正相关。

（1）百分浓度和百万分浓度之间的换算

百万分浓度（ppm）=10000×百分浓度,如:

75%的多菌灵丙酮溶液，为多少ppm？

由上式得：

10000×75=750000（ppm）即:

750000ppm

（2）百分浓度和稀释倍数之间的换算

百分浓度（%）=原药剂浓度÷稀释倍数×100%

如：

90%的敌百虫稀释1000倍后的药液百分浓度为多少？

由上式得90%÷1000=0.09%即得为0.09%

（3）百分浓度与有效成分之间的换算

当原药剂的比重等于或近似1时，百分浓度与有效成分（g）之间的换算关系为:

药液有效成分（g）=毫升数×药液浓度

如：

25%功夫菊酯乳油100毫升，含有多少功夫菊酯有效成分？

解：

100×25%=2.5（g）

波美度和稀释倍数之间的换算

（1）稀释剂用量的计算公式

例：

将10毫升20％杀灭菊酯乳油稀释成50ppm的药液，需用多少水？

　解：

原药剂的量＝10毫升

原药剂浓度＝20%＝20×10000ppm

所配制的药剂浓度＝50ppm

　根据公式10×200000÷50＝40000（毫升）＝40（升）

（2）原药剂用药量的计算公式

例如：

50％敌敌畏配100公斤含量为500ppm的药液，需要原药多少？

　解：

所配药剂量＝100公斤（kg）,所配制药剂浓度＝500ppm,原药剂浓度＝50%＝500000ppm

根据公式100×500÷500000＝0.1（公斤）＝100克

（3）倍数法计算公式

当稀释倍数在100倍以下时（内比法）:

当稀释倍数在100倍以上时（外比法）:

例（内比法）：

需配制98公斤20％敌稗乳油50倍液用于水稻秧苗除草，求用药量是多少？

解：

所需药剂量＝98公斤稀释倍数＝50根据公式98÷（50-1）＝2公斤

例（外比法）：

需配制2.5％敌杀死乳油稀释2000倍液10升，求需加2.5％乳油多少？

解：

所需药剂重量＝10升稀释倍数＝2000根据公式10÷2000＝0.005升＝5豪升

用64%杀毒矾可湿性粉剂750X防治黄瓜霜霉病调查情况如下：

①请计算药前及第一次药后10天及第二次药后15天的病指。

②请计算第一次药后10天及第二次药后15天的防效。

③如果亩用药液为75升，每亩需要多少克64%杀毒矾WP？

室内毒力测定和田间试验

♦一般地，农药生物测定指在室内进行的测定。

♦室内毒力测定主要是测定一种药剂的毒性、毒力或比较几种药剂毒力的大小。

室内试验的结果，除可作为药剂的初步筛选的根据外，还可为田间试验提供参考。

有时在田间发现的问题必须拿回室内作比较精细的试验研究。

♦田间试验主要测定或比较药剂在田间条件下的药效，其结果比较接近实际情况，为生产防治提供可靠的依据。

农药生物测定试验设计的原则

（1）相对控制测定条件

（2）必须设立对照（3）各种处理必须设置平行重复

（4）运用生物统计分析试验结果

（1）相对控制测定条件

♦环境条件：

温度、湿度、光照。

♦供试生物：

标准化生物（同一环境下培养的，发育一致）。

♦供试药剂：

室内生物测定必须纯净（原油或原粉），至少要有确切的有效成分含量。

施药要均匀一致。

（2）必须设立对照

对照（check，符号CK），对照有三种：

♦空白对照：

♦非药剂成分对照：

如丙酮对照。

♦标准药剂对照：

多菌灵

•根据具体情况和测定要求确定试验中所需设置的对照。

（3）各种处理必须设置平行重复

♦任何实验都必须能够重复，这是具有科学性的标志。

♦增加重复是减少误差的一种方法。

♦一般室内毒力测定要求至少重复3次。

田间小区药效试验，则要求重复4-5次。

室内毒力测定线性浓度范围的寻找

（1）浓度（或剂量）范围的寻找

将待测样品分别配制成跨度较大的几个浓度，根据试验所需要的方法测定每个浓度（或剂量）对供试生物的活性，寻找其效应值（如死亡率、抑制率等）在1%-99%之间的浓度（或剂量），即可确定大致的浓度范围

（2）设置浓度（或剂量）

在所得到的大致浓度范围内，设计一系列不同的药剂浓度（或剂量），浓度梯度可以根据药剂特点及初步确定的浓度范围设置成等比、等差或其它形式，然后测定不同浓度药剂对目标生物的效应值。

（3）最终的浓度确定:

若可选出5-7组满足上面两个条件的数据，即所设置浓度合理。

反之，则需要重新设置浓度。

注意：

杀虫实验中对照组的死亡率不能超过20%

杀虫剂室内生物测定

杀虫剂生物测定技术的一般原则

（一）控制影响因素环境条件、昆虫、药剂、溶剂等。

（二）必须设立对照空白对照、溶剂对照、标准药剂对照。

（三）必须设重复一般重复3次，每重复20~50头试虫。

（四）供试的目标昆虫尽量选择农作物害虫，在同一环境条件下人工饲养,或在田间同一环境条件下抓捕，尽量一致。

标准目标昆虫：

是指在生物测定中被普遍采用的，具有一定代表性和经济意义，并且抗药力稳定均匀的农药杀虫毒力和毒效指示的试虫群体。

对标准目标昆虫的要求

1、易饲养，繁殖力强，不互相残杀，不受季节限制，能保证常年充分供应；

2、要求有一定的代表性和经济意义。

3、生活力及抗药力要稳定和均匀一致；

4、选用合适虫期、龄期、年龄的试虫群体或混合群体作为测试对象。

5、便于进行移取处理

标准目标昆虫的移取方法

（一）一般移取法

（二）趋光法（三）麻醉法:

1、CO2法；2、挥发蒸气法；3、冷冻法；4、乙醚低温麻醉法（四）吸虫法（五）自行运动移虫法

二、初步毒力试验

1、应用范围:

①主要用于对大量化合物的杀虫活性筛选②用于为田间防治害虫筛选有效药剂

初步毒力试验又叫过筛试验（screentest）。

其目的是：

确定一种新化合物对某一目标昆虫是否有毒，以便确定是否有必要进一步做毒杀作用方式或精密的毒力测定。

比较粗放的初步试验，对筛选新农药来说是更为主要的。

初步毒力测定的方法:

①喷雾②喷粉③浸渍④食料混药法

精密的毒力测定:

就是我们常说的毒力测定。

指在特定条件下衡量某种杀虫剂对某种昆虫毒力程度的一种方法。

可用来了解某一杀虫剂对某一害虫的毒力程度，也可用来比较几种杀虫剂对某一种昆虫的毒力差别；

1、内容:

①毒杀作用方式的测定②毒力程度的测定

定量取食法、夹毒叶片法、液滴饲喂法、口腔注射法

叶片夹毒法致死中量的计算：

根据取食面积、单位面积上的着药量及试虫体重，求出每头试虫的单位体重受药量，排序，分组:

生存组、生死组、死亡组。

叶片夹毒法致死中量的计算：

A:

中间组每项死虫单位体重药量累加除以总死虫数得A。

B:

中间组每项活虫单位体重药量累加除以总死虫数得B。

经典夹毒叶片法的缺点：

操作麻烦.需要控制取食量。

湿度不好控制，导致叶片干缩，难测定面积。

要求施药均匀。

杀虫剂胃毒毒力测定技术——改进夹毒叶片法

改进夹毒叶片法的特点：

将不定量进食改为定量给食，并用点滴药量代替喷粉或喷雾。

杀虫剂的触杀毒力测定技术－局部施药法

①点滴法（topicalapplication）将一定浓度的药液点滴于虫体的某一部位，多在幼虫的前胸背板上，药剂迅速挥发，药剂在体壁形成药膜而侵入体内。

熏蒸杀虫作用测定方法：

（1）二重皿法

（2）三角瓶法（3）广口瓶法

叶蝶法：

拒食率（%）=（对照取食面积－处理取食面积）/对照取食面积×100

温湿度对杀虫剂的熏蒸毒力影响较大，一般在25℃、相对湿度50%条件下测定。

熏蒸剂的药量计算：

以单位容积内的药剂用量来表示（mg/L或ml/L）。

校正死亡率公式的局限性

1、只有当自然死亡与药剂所引起的死亡没有关系时,自然死亡率在5%～20%之间时才运用；

2、如自然死亡率过大或药剂处理对自然死亡率有影响时均不运用；

3、如自然死亡率在5%以下，可将处理组死亡率减去自然死亡率即可得到校正，即：

校正死亡率=处理组－对照组

4、如自然死亡率>20%时，则表示该目标昆虫种群不宜供试验用，试验结果不可靠。

致死中量（MediumLethalDose）LD50：

指在一定条件下，可致供试生物半数死亡机会的药剂剂量，表示单位：

mg/kg、μg/g或μg/头。

致死中浓（MediumLethalConcentration）LC50：

可致供试生物半数死亡机会的药剂浓度。

致死中时（MediumLethalTime）LT50或击倒中时（MediumKnockdownTime）KT50即杀死或击倒昆虫群体一半个体所需的时间。

相对毒力指数

昆虫对杀虫剂的敏感性分布是一个偏常态分布，杀虫剂对昆虫的效应的增加不是和剂量的增加成比例，而是与剂量增加的比例成比例。

毒力指数（TI）（%）＝标准杀虫剂LD50*100/供试杀虫剂LD50

混剂（M）的实际毒力指数（ATI）（%）＝标准杀虫剂的LD50*100/混剂M的LD50

混剂M的理论毒力指数（TTI）＝A药的TI×M药中的A%＋B药的TI×M药中的B%

混剂M的共毒系数（CTC）＝ATI÷TTI×100

增效与否判定标准：

CTC>120增效作用；CTC＝80~120相加作用；CTC<80拮抗作用

实际死亡率与理论死亡率之差或协同毒力指数大于20％时属增效，小-20％属拮抗。

一般认为预期LD50/实测LD50的毒力比值在0.5~2.6之间属相加作用，大于2.6时属增效，小于0.5属拮抗。

实例：

菊·杀混剂（3:

7混配）对棉铃虫3龄幼虫毒力测定数据为：

　　　氰戊菊酯LD50＝0.6598μg/g　　

　　　杀螟硫磷LD50＝78.2013μg/g

　　　菊·杀混剂LD50＝1.0831μg/g　

　　　通过计算，请说明这两种农药混配后有无增效作用？

菊·杀混剂理论毒力指数（TTI）

＝（0.6598÷0.6598）×30%×100+（0.6598÷78.2013）×70%×100

=30.6

菊·杀混剂实际毒力指数（ATI）＝（0.6598÷1.0831）×100=60.9

菊·杀混剂共毒系数（CTC）＝60.9÷30.6×100＝199＞120

说明：

氰戊菊酯与杀螟硫磷以3:

7混配具增效作用。

杀菌剂的生物测定

杀菌剂生物测定：

以病菌（活体或离体）为测定对象，评价各种杀菌剂的毒效

一、离体测定：

这种测定中仅包括病菌和药剂，判断药剂的毒力主要是根据病菌与药剂接触后的反应（如孢子不萌发，不长菌丝等）。

优点：

易于控制、操作简便迅速、精确度较高。

缺点：

测定结果与生产实际距离较大，而有些化合物必须在寄主植物体内活化后才起杀菌作用。

可能漏筛一些未来颇具潜力的化合物。

二、活体测定:

这一类型的方法包括病原菌、药剂和寄主植物。

杀菌剂毒力以寄主植物的发病情况（普遍程度、严重程度）来评判。

特点：

测定周期较长，操作比较复杂，大田药效测定常受季节限制，测定时受多种因子的影响，致使结果不稳定。

但在应用实际较接近，有很大实用价值

杀菌剂毒力测定步骤：

1、在室内进行杀菌剂生物测定；2、在控制条件下，进行杀菌剂温室盆栽生物测定；3、在自然条件下，进行杀菌剂的大田药效试验。

清洁：

排除其它化合物的影响。

灭菌：

用物理或化学方法灭菌，完全除去或杀死器皿表面和内部的一些微生物。

消毒：

消毒是消灭或减少某些病原微生物，而不是消灭一切微生物。

在进行分离工作时，植物组织表面往往要消毒、去杂而保“真”（病原菌）

1）物理灭菌

　①干热灭菌：

利用干热空气来灭菌

　　温度：

160℃~180℃，不宜超过180℃。

　　时间：

160°，2h；180℃，1h。

　　为提高效果，可用间歇灭菌法，热-冷-热（温度可低些）。

　②湿热灭菌：

高压蒸气灭菌较常用，效率高。

　　干热：

160℃，2h，灭菌

　　湿热：

121℃，20min

2）化学灭菌：

杀菌力极强的洗液有：

1%升汞活液、5%福尔马林、70%酒精次氯酸盐

3）过滤灭菌：

细菌不能通过，如过滤漏斗可用来滤出含蛋白的培养基、血清及抗药素中的细菌。

（二）植物病原菌的培养

步骤（要求：

在无菌条件下进行）　

1、培养基的制备2、接菌　3、保存

对供试菌的要求

1、较易繁殖、菌落边缘明显，产菌丝、孢子量合适；

2、要求有一定代表性、经济意义，为重要的农业病菌；

3、生活力、抗性均匀、稳定、一致；

4、便于操作、移取等。

杀菌剂皿内生物测定:

（一）孢子萌发法

（二）含毒介质培养法（三）叶碟法

（一）孢子萌发法

基本原理：

将供试药剂附着在载玻片上或其它平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在上面（或将孢子悬浮液与药液混合后滴在玻片上），在保温、保湿条件下培养一定时间后镜检以孢子萌发力判断杀菌剂毒力。

优点：

快速、试验当天即可得结果。

步骤：

1.萌发表面的处理2.药剂在玻片上的附着3.孢子悬浮液的准备4.定温保湿培养

5.结果检查及表示

孢子悬浮液的准备:

菌种应是标准菌种，供试菌种应符合以下条件

1菌种纯粹，在一般培养基上易大量产生孢子；

2多代繁殖不易产生变异；

3孢子个体较大，易于在显微镜下观察萌发情况；

4

在分类上有一定的代表性，而且是重要的植物病害病原菌。

调至最高浓度（10×10倍，40个孢子），一定时间后（对照萌发率在85%以上）检查孢子萌发率，一般在低倍镜下，随机检查200个孢子。

（二）含毒介质培养法：

1.水平扩散法（又叫抑菌圈法或平面法）2.生长速率法3.最低抑制浓度法

1.水平扩散法（又叫抑菌圈法或平面法）

步骤：

制备双层培养基、摆放牛津杯\放带滤纸片、低温放置、适温培养、结果检查

优点：

精确度高，操作简单，很快可得到结果.缺点：

测定结果受药剂溶解后和扩散能力影响很大，有一定局限性，另外，对严格的寄生菌不适合。

2.生长速率法

步骤：

制备菌饼；制备带毒培养基；移菌饼；结果检查

病菌的生长速度可用两种方法表示：

（1）药剂达到一定大小所需时间；

（2）一定时间药剂直径的大小。

优点：

操作比较简单；重现性好；病菌易于培养。

3.最低抑制浓度法

二、杀菌剂盆栽药效试验

病情指数（%）=∑（各级病叶数×相对级数值）/（调查总叶数×最高分级数）×100

防治效果（%）=（对照病指增长率－处理病指增长率）/对照病指增长率×100

除草剂的生物测定

除草剂生物测定的基本原理:

利用活的生物体或生物体器官，在生长、形态等方面对化学物质（除草剂）的不同反应来确定除草剂的浓度。

通常选用对除草剂较敏感的生物材料作生测试材。

使生物体的敏感反应成为生物测定方法，必须符合下列条件：

1、在一定浓度范围内，生物体内对除草剂的反应随着浓度的增加而有规律的增加；

2、在环境条件相似的条件下，用同一种试材重复试验时，对同种除草剂的反应可以重现。

除草剂生物测定技术程序和原则

（一）生物试材的确定和培育

（二）创造试材所需的环境条件（三）除草剂活力的鉴定方法

通过测定供试植物的生长量来确定各种除草剂对试材的抑制程度以及除草剂的活性。

通常以鲜重为指标。

如对试验要求较精确时，还要测定实验植株或特定部位的干重

发芽率（%）＝药剂处理的发芽数/对照处理的发芽数×100

生长抑制率（%）＝（对照发芽率－药剂发芽率）/对照发芽率×100

生长抑制率（%）＝（对照生长量－处理生长量）/对照生长量×100

（一）除草剂的筛选

筛选程序为：

实验室初筛——盆栽实验——田间试验

一般认为，选择性指数在4以上是比较安全的。

剂量：

一般用单位面积喷洒有效成分的量来表示，如g/亩或g/公顷；也可用制剂的量来表示，但必须指出剂型及有效成分含量。

除草剂造成的作物药害症状的诊断:

形态效应最易发现，这是诊断药害的主要依据。

幼龄植株和植物的分生组织最易受除草剂影响，所以观察其最大分生活性区对于诊断除草剂药害是非常重要的。

大多数除草剂引起植物生长异常或根、茎、叶、花形态发生变化，所以，形态效应是药害症状的主要类型。