分子生态学实验步骤与原理总结.docx
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分子生态学实验步骤与原理总结
(一)基因组DNA提取
上海博彩生物科技有限公司:
3SDNAIsolationKitforEnvironmentalSamplesV2.23S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2
DNA抽提方法
使用仪器:
灭菌锅,无菌操作台,移液枪,漩涡振荡器,台式离心机,水浴锅,分光光度计或者琼脂糖电泳槽
灭菌物品:
枪头,1.5ml,2ml离心管
一、污泥样品前处理
样品在处理前首先要混匀,使其中的悬浮物质分布均匀。
取约l0mL污水样品,加入灭菌离心管,400Orpm、离心20min,收集沉淀,加约4倍体积的TENPbuffer(50mMTirs,20mMEDTA,100mMNaCl,0.01g/mLPVP,pHl0),加玻璃珠(d:
lmm)充分匀化(解絮凝)。
4000rpm,离心20min,弃上清(重复两次,直至上清液较澄清)。
加约4倍体积的PBSbuffer(8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于lL水、pH7.4),旋涡混匀,4000rpm,离心20min,收集沉淀(重复两次)
二、基因组DNA提取
1.样品准备:
100mg样品用200ulSolutionSUS将样品浸泡、悬浮,使样品软化分散开。
2.加入400ulSolutionLYS,300mg石英砂,盖上离心管盖,在漩涡振荡器上高速剧烈振荡,10-30min或更长时间。
3.用台式离心机,12000rpm,室温离心5min。
4.将上清液完全转移到无菌1.5ml离心管中,加入120ulSolutionBID,盖上离心管盖,上下颠倒混匀。
将溶液用1mlTIP全部转移到3S柱内,柱子放入2ml离心管中,不盖离心管盖,室温放置2min以上。
5.盖上离心管盖,12000rpm,室温离心1min。
6.取下3S柱,弃去离心管中的废液。
将柱子放回同一根离心管中,加入600ulWashSolution,10000rpm,室温离心1min。
7.重复6一次。
8.取下3S柱,弃去离心管中的全部废液。
将柱子放回同一根离心管中,10000rpm,室温离心2min,以除去残留的WashSolution。
9.洗脱:
在柱子中央加入100ulTE,将柱子放入新的干净1.5ml离心管中,室温放置2min。
12000rpm,室温离心1min。
收集管中的液体即为基因组DNA。
根据用途,样品可以4℃或-20℃保存。
为提高洗脱效率,可以将TE预热到37-55℃。
如果样品中基因组DNA含量很低,用30ulTE洗脱可以提高洗脱液的样品浓度,但产率有所下降。
重复该洗脱步骤一次,可以提高产率20%左右。
三、提取DNA的质量检测
(1)DNA纯度和浓度检测
用紫外分光光度计测定DNA样品在波长230,260,280nm处的吸光光度值。
DNA纯度的定性检测:
通过A260/A280及A260/A230的比值可以检测所提DNA是否纯。
通常纯DNA
样品A26O/A280≈1.8,A260/A230>2。
若A260/A280>l.9,可能有RNA污染;若
A260/A280 杂质。 DNA浓度的计算: 浓度(µg/mL)=A260*50*稀释倍数; 注: 1OD值相当于50µg/mL双螺旋DNA。 (2)DNA琼脂糖凝胶电泳检测 将所得DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳,电压100V,电泳lh,EB染色后,用紫外凝胶成像系统拍照。 (二)PCR扩增 一、PCR扩增引物 采用两组对大多数细菌和古细菌的16SrRNA基因V3区具有特异性的引物对: 组合(F34,GC和RS: 8)。 引物组合的正向引物5’端中有一个富含GC的40bp的GC发卡 结构。 它们各自序列分别为: F341: (5’一eCTACGooAooeAGeAo一3’),Rsls: (5’一ATTACCGCGGCTGCTGG一3,),GC发卡结构 (5’一CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG一3’)。 引物 组合扩增产物片段长度约为220bp。 二、PCR扩增反应体系 PCR扩增反应体系,与表3一3相同。 加样后立即进行PCR扩增。 三、PCR扩增程序 PCR扩增程序,与表3一4相同。 四、PCR产物电泳检测 取5闪PCR产物进行电泳,胶浓度为2.0%,在电压100v条件下电泳lh后检测, 经EB染色后用凝胶成像系统观察,保存凝胶图谱。 电泳所用Marker为天根生化 科技(北京)有限公司生产的nNAM叭e: nLZo00。 (三)变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析 预电泳的作用 1.使体系达到反应的条件 2.清除过多的变性剂和APS等,保持胶的稳定状态。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析。 其装载的样品量大,回收DNA纯度高。 长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸分子即能分离。 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N'一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N'一亚甲双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。 一、试剂配制 (l)50*TAE缓冲液: 242gTris碱,57.1mL冰醋酸,100mL0.5MEDTA(pH8.0),加水至1L。 混合均匀后高压灭菌20-30min,室温保存。 (2)40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺(37.5: 1): 38.93g丙烯酰胺,1.07g双丙烯酰胺,加水至100mL。 (3)O%变性溶液: 20mL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺,2mL50*TAE缓冲液,加水至100mL,再分别加入80µLAPS和5µLTEMED。 4℃条件下保存在棕色瓶中。 (4)100%变性溶液: 2OmL40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺,2mL50*TAE缓冲液,40mL甲酰胺,42g尿素,加水至100mL,再分别加入80µLAPS和5µLTEMED。 4℃条件下保存在棕色瓶中,100%变性溶液在使用之前需要预先溶解,把瓶子放进水浴锅中加温并快速搅拌。 (5)10%过硫酞胺(APS): lg过硫酰胺加水至10mL。 现用现配。 (6)对于变性浓度低于100%的溶液,用0%和100%的变性溶液混合配制而成,尿素和甲酰胺含量如下所示: 不同浓度的变性溶液尿素、甲酰胺含量 成分 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 尿素(g) 4.2 8.4 12.6 16.8 21 25.2 29.4 33.6 37.8 甲酰胺(ml) 4 8 12 16 20 24 28 32 36 二、DGGE胶的制备 (l)用无水乙醇清洁制胶用的两块玻璃板,将spacer放在2个玻璃板之间,插入clamp中,将aligment板放入,用螺丝夹子固定,将aligment取出,用手摸底部是否平整,要绝对的平,否则会漏。 (2)将软垫放在底座上,玻璃板放在软垫上固定,用水平器调节。 (3)配制13.5mL高浓度变性梯度液,加入梯度仪高浓度右槽,打开左槽螺旋,溶液流入左槽,关上螺旋,用吸管将它们吸回右槽内(确保两槽无气泡阻隔)。 (4)配制13.5mL低浓度变性梯度液,加入梯度仪低浓度左槽。 (5)轻轻打开两槽间的活塞和梯度仪出口开关,并搅拌。 将长针头插入玻璃板之间,流速保持在2mL/min左右。 (6)胶板灌满后,顶部插入梳子,凝固2小时。 三、DGGE凝胶电泳步骤及染色 (l)在DGGE槽中加7L左右1*TAE(DGGE专用),使槽中的水至Full和Run的中间位置;加盖,注意长杆进入底部的窟窿中,打开电源,将温度设置到60℃,打开heat键。 (2)当梳子位置的胶凝固好后,将玻璃板固定在黄色的凝胶板架上,如果只有1板胶,注意另一侧也要固定玻璃板(不加spacer),否则漏水。 安装好玻璃板后,将凝胶板架(红点在右边)放入水槽中,之后将温度控制器盖在电泳槽上,注意长杆进入底部的窟窿中。 打开电源,打开heat键和bump键,开bump键后,水位会下降,降至run与maxmum的中间,水若不够的话,关闭电源,打开温度控制器上方的探望口,加1*TAE补足。 (3)温度达到60℃,立即进样,先关掉所有电源,取下温度控制器,小心地拔掉梳子,用移液枪冲洗侮一个进样孔;进样要缓慢,使样品顺着玻璃板均匀地落入到进样孔中。 每一个进样孔加入25µL样品。 (4)将温度控制器盖在电泳槽上,打开电源,将温度调到60℃,打开heat键和bump键,运行5min后,在主机上插入红黑电源线,注意红黑线不要颠倒。 打开主机电源,将电压调到120V,时间调为5h。 (5)电泳结束后,关掉电源,打开盖子,将凝胶板架拿出,控水,卸下玻璃板。 将clamp卸下,手抓住spacer,向内侧拧,揭下短玻璃板,胶粘在长玻璃板上。 (6)将托盘上平铺张保鲜膜后,将长板和胶放入托盘中银染。 银染步骤 步骤: 时间 溶液 固定 30min 10%冰醋酸、30%乙醇,100ml 敏化 2*10min 30%乙醇,100ml 洗涤 冲洗30s,漂洗5*5min 双蒸水 银染 30min 新鲜配制的0.1%AgNO3,100ml,使用前加入370μl的福尔马林溶液 洗涤 冲洗30s,漂洗1min,再冲洗30s 双蒸水 显影 直至显示条带为止,密切观察 溶液1: 0.2g硫代硫酸钠于10ml水中 溶液2: 2.5g碳酸钠于100ml水中 将100μl溶液1加入溶液2中,再加350μl的福尔马林溶液 终止 30min 5.84gEDTA2Na·2H2O以及8gGlycine于双蒸水中,定容至400ml(也可用10%的冰醋酸) 保存 长达数日 10%甘油 长时间保存 干胶 自然干燥即可 (1)AgNO3母液(20%): 将2gAgNO3溶解于双蒸水中,定容至10ml,放置于棕色瓶中密闭保存。 每次使用时取2ml母液,稀释至400ml,再加入福尔马林。 (2)10*TrisEDTA(TE): pH=8.0 A.100mmol/LTris-CI(pH=8.0) B.10mmol/LEDTA(pH=8.0) C.Tris-Cl(1mol/L): 用800ml蒸馏水溶解121.1gTris碱,加浓盐酸调pH值至所需值。 银染原理: 银染是一种常用的蛋白质染色方法,具有较高的灵敏度,可以染出SDS-PAGE胶中含量低至0.2ng的蛋白。 虽然这是protocol上的说法,但如果操作得当,检测到5ng左右的蛋白应该不成问题。 如果搜索银染的protocol,可能会得到许多种说法。 为什么这样一种重要的实验手段却得不到统一的应用呢? 这可能要从银染本身那复杂而又灵活的原理说起。 简单的讲,银染的原理就是将银离子还原,附着在蛋白表面,形成染色。 银染所用的银,基本上是基于两种试剂,一种是硝酸银,另一种是Silverdiammine。 基于硝酸银的应用要多于后者(据说Silverdiammine比较费“银子”),现在主要说说基于硝酸银的银染的原理。 银离子容易被还原,在PAGE胶上,哪里的银离子先开始被还原,哪里就先开始出现条带。 通常由于蛋白质结构上的复杂性,一部分银离子结合在蛋白质之上后会影响更多银离子的结合,所以有蛋白的地方银离子较少,如果不做任何处理,有蛋白的部位将会染色更浅,所以最初的银染是负染。 那最初的负染是如何演变成正染色的呢? 一方面是选用还原速度较慢的还原剂,如甲醛,另一方面,利用慢还原争取到的时间将胶上多余的银离子洗去,由于银离子对蛋白质有一定的结合力,故更多地保留在有蛋白的位置,于是形成了正染。 但是这种染色的方法灵敏度还不是很高,所以人们又在染色之前加入了敏化的步骤,能够使银染敏化的试剂很多,一类是增加蛋白质与银离子的结合位点,如SDS等;还有一类能使银离子和蛋白形成silversulfide等结合,硫代硫酸盐起到的就是这个作用;还有的试剂兼顾上述两种功能,如戊二醛。 通过敏化过程,银染的灵敏度大大增加,同时也降低了背景。 综上,银染的原理概括如下: 让银离子尽可能多的于蛋白结合,尽可能的洗掉胶上的银离子,然后还原显色。 各种各样的protocol基本上都是基于这个原理。 最为经典的一个版本是这样的: 谈谈其中一些具体步骤: 1.固定,固定的作用主要是使蛋白变性,防止蛋白在扩散 2.敏化,戊二醛和硫代硫酸钠都是增加蛋白和银离子的结合,但是做质谱兼容银染的时候一般都把戊二醛去掉,原因是对蛋白造成修饰(在我的实验中,有戊二醛存在的时候一般也能鉴定到蛋白,不知道是不是去掉更好)。 乙酸钠的作用应该是缓冲pH。 3.染色,有的protocol中这一步不加甲醛,不加甲醛使后面的显色速度将大大降低。 4.显色,碳酸钠的作用是提供碱性环境,在碱性环境下甲醛才能发挥它的慢还原特性。 这一步中的硫代硫酸钠有增加银化合物溶解的能力,防止氯化银在胶表面形成薄膜,但是在质谱兼容银染中,硫代硫酸钠也是省去的。 5.终止,顾名思义,显色成功后终止反应。 评价好的银染方法主要基于以下几个方面: 灵敏度,重复性,速度。 个人认为平衡好灵敏度和重复性是实验的关键,速度可以放在后面考虑。 如果不知道哪个版本的银染更为合适,那么上面的那个经典版本是个不错的选择,之后可以根据具体的结果,并参考银染的原理做些优化。 通常银染方法简单,只需几步。 电泳后,在醋酸中固定胶除去电泳液和凝胶中的尿素,并防制小的延伸产物的扩散。 换几次蒸馏水除去固定剂。 胶在硝酸银和甲醛中染色。 在染色后,将凝胶用水清洗,在含甲醛和硫代硫酸钠的碱性碳酸钠溶液中显色。 甲醛将银离子还原为金属银。 硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银,否则会增加背景。 在显色一定的时间后,用水清洗一下,在空气中干燥。 (7)用Bio-RadGelDocTMXR凝胶成像系统观察并拍照。 (四)DGGE图谱目的条带的克隆测序 1.DGGE图谱目的条带DNA的提取与PCR扩增 将切取下来的目的条带浸泡在TE溶液中,4℃过夜,得到的溶液即可作为PCR反应的模板。 PCR反应体系与程序与之前相同,采用引物对BSF338(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和BSR534(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)。 PCR反应体系(25µl): 10×ExTaqbuffer(Mg2+)2.5µl,2.5mmol/LdNTP2µl,20pmol/L正反引物各0.75µl,模板DNA10~100ng,ExTaq0.25µl,加双蒸水补足至25µl。 PCR反应程序: 94℃预变性5min,94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸30s,35个循环,72℃最终延伸10min。 扩增产物采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 2.PCR产物的胶回收 采用E.Z.N.AGelExtractionKit,操作步骤如下: (1)电泳足够时间后,在紫外灯下小心地把所需的DNA片段切下来,并尽量去除多余的凝胶。 (2)称取空离心管的重量,切下带目的片段的凝胶装在1.5ml离心管中并称其重量,求出凝胶块的重量,近似地确定其体积。 一般情况下,凝胶的密度为1g/ml,于是凝胶的体积与重量的关系可按下面换算: 凝胶薄片的重量为0.2g则其体积为0.2ml;加入等倍凝胶体积的BindingBuffer,把混合物置于55℃~65℃水浴中温浴7min至凝胶完全融化,其间每隔2-3min混匀一次; (3)转移700μl的DNA-琼脂糖溶液到一个HiBindTMDNA柱子,并把柱子装在一个干净的2ml收集管内,室温下,10000×g离心1min,弃去液体; (4)将柱子重新套回收集管中,加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10000×g离心1分钟,去弃滤出液; (5)将柱子重新套回收集管中,加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10000×g离心1min,去弃滤出液; (6)将柱子重新套回收集管中,重复加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中,室温下,10000×g离心1min,弃去滤出液;将空柱子重新套回收集管中,10000×g离心1min以甩干柱基质残余的液体; (7)把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水上柱子膜上,10000×g离心1min,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20℃。 3.目的DNA与pMD19-T载体的链接转化 反应体系(10μl)如下: pMD19-T1μl,模板DNA4μl,SolutionⅠ5μl,16℃连接过夜。 连接产物的转化: (1)把感受态细胞置于冰中融化; (2)把100μl的感受态细胞移至灭菌处理的离心管内; (3)加入用于转化的DNA; (4)冰中放置30min; (5)42℃放置45~60s; (6)冰中放置2~3min; (7)加入37℃预温好的SOC培养基,使终体积为1ml; (8)37℃振荡培养1h(160~225rpm); (9)取适量涂布琼脂平板培养基; (10)平板于37℃正向放置至液体被吸收,然后倒置培养过夜。 4.阳性转化子鉴定及测序: 分别挑取10个白色单菌落,利用载体通用引物M13-47和RV-M鉴定转化子。 PCR反应体系(25µl): 10×ExTaqbuffer(Mg2+)2.5µl,2.5mmol/LdNTP2µl,20pmol/L正反引物各0.75µl,ExTaq0.25µl,加双蒸水补足至25µl。 PCR反应程序: 94℃预变性5min,94℃变性40s,55℃退火40s,72℃延伸30s,35个循环,72℃最终延伸10min。 延伸40s,25~30个循环,72℃最终延伸7min,-20℃保存。 扩增产物在1%的琼脂糖凝胶电泳,经凝胶成像系统检测,鉴定和筛选含有目的基因的阳性转化子。 选择阳性克隆,送交invitrogen公司完成测序。 5.序列分析与系统进化树绘制 将测序结果去除载体后,至GenBank数据库通过blastn功能进行比对分析。 聚类分析采用UPGMA算法进行分析。 16SrRNA基因进化树利用CLUSTAL_X、Phylip3.65,Mega等软件,以Neighbor-Joining法绘制系统进化树,自展评估1000次。 最终获得所需的进化树
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