分子生物学实验技术实验内容讲解.docx

分子生物学实验技术实验内容讲解.docx

《分子生物学实验技术实验内容讲解.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《分子生物学实验技术实验内容讲解.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

分子生物学实验技术实验内容讲解

2006年《分子生物学实验技术》实验内容

一、RT-PCR

（一）总RNA的提取

实验安排：

每两人抽提一管。

为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。

操作步骤：

1、将100μl液体样品加入1.5mlEp管中，再加入900μl冰预冷的LS-BiotragentsTM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。

2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。

3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。

4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。

5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。

6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。

7、用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。

8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-FreeWater）将RNA溶解并于-20℃保存。

注意事项：

1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1%DEPC水浸泡过夜。

3、配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。

然后用高压灭菌除去残留的DEPC。

不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。

（二）反转录

实验安排：

每人做一管。

反应体系（20μl）：

按下列顺序加样

5×Buffer

4μl

dNTPs

6μl

RNA酶抑制剂

1μl

Oligo（dT）

1μl

随机引物

1μl

反转录酶AMV

1μl

提取的RNA

6μl

总体积

20μl

反应条件：

42℃1h

注意事项：

1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。

如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。

2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。

3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。

4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20℃，以防酶失活。

（三）PCR

实验安排：

每人做一管。

反应体系（50μl）：

按下列顺序加样

ddH2O

32.7μl

10×PCRBuffer

5μl

dNTPs

4μl

P1

2μl

P2

2μl

Taq

0.3μl

cDNAtemplate

4μl

Total

50μl

反应程序：

预变性94℃2min

变性94℃30s

退火50℃45s

延伸72℃1min

30cycles

终延伸72℃10min

PCR产物的检测：

琼脂糖凝胶电泳

1、电泳缓冲液TBE（10×）的配制：

称取Tris-base54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。

2、1.5%琼脂糖凝胶的配制：

称取1.5g琼脂糖于三角瓶中，加入10ml10×TBE缓冲液，并加水定容至100ml，加热溶解后加入5μlEB（10mg/ml），摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子即可用于电泳。

3、电泳检测：

取PCR产物5μl与LoadingBuffer1μl混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁加入5μlDL2000DNAMarker作对照，以100V电压，50mA电流进行电泳，约15min后于紫外灯下观察结果。

注意事项：

1、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。

2、禁止将盛有EB的器皿随意乱放，且不要戴有EB污染的手套随意拿其它无EB的试剂或仪器。

（四）PCR产物的纯化

实验安排：

每两人的PCR产物合并后作为一管，用PCR产物回收试剂盒（E.Z.N.A.GelExtractionKit）回收目的DNA。

操作步骤：

1、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好重量的空1.5mlEp管中。

2、将装有胶粒的Ep管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。

3、按1g胶加1ml的量加入BindingBuffer，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep管2－3次，使胶粒完全溶解。

4、将上述溶胶液加入到HiBindspin-column中，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

5、加入300μlBindingBuffer，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

6、加入750μlSPWBuffer，静置2min，10000×g离心1min，弃去收集管中的液体。

7、重复步骤6。

8、空管10000×g离心1min，以弃去DNA回收柱中的残余液体。

9、将DNA回收柱放入新的1.5mlEp管中，并加入30μlDNAElutionBuffer至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。

注意事项：

1、电泳时应换用新配制的TBEbuffer，否则会由于电泳缓冲液pH升高而降低DNA的产量。

2、在切下含目的DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜（如一次性手套），使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。

3、切胶过程要尽可能短，防止DNA在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。

4、DNA的洗脱效率与ElutionBuffer的pH有关，因此用ddH2O洗脱DNA时，应调节ddH2O的pH值至8.0。

二、基因的克隆

（一）DNA片断与载体的连接

本实验做PCR回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。

TA克隆原理：

利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR产物的克隆和测序。

实验安排：

每两人做一管。

反应体系（10μl）：

LigationSolutionI5μl

PCR回收产物4.5μl

pMD-18Tvector0.5μl

总体积10μl

反应条件：

16℃4h以上

（二）感受态细胞的制备

实验安排：

每人做一管。

试剂配制：

1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：

称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。

2、0.1mol/LCaCl2溶液：

称取1.11gCaCl2（无水，分析纯），溶于超纯水中，定容至100ml，高压灭菌或0.22μm滤膜过滤除菌。

3、无菌甘油：

取甘油100ml，高压灭菌即可。

操作步骤（无菌操作）：

1、从生长有大肠杆菌DH5α的平板上挑取一个单菌落，接种于2mlLB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜，作为一级种子。

2、将一级种子按1:

50比例无菌转接到5mlLB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养约2h-3h，至细菌的OD600达到0.5左右。

3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的1.5mlEp管中，冰浴30min。

4、4℃4000r/min离心10min，弃上清。

5、加入1ml冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬沉淀，继续冰浴15min－30min。

6、4℃4000r/min离心10min，弃上清。

7、沉淀中加入200μl用冰预冷的0.1mol/LCaCl2轻轻重悬。

悬浮的感受态细胞可直接用于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15%，分装100μl/管，-70℃保存备用。

注意事项：

1、细胞生长状态：

不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中取适量在LB固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。

2、细胞生长密度：

以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

DH5α菌株的OD600为0.5，细胞密度在5×107个/ml左右（不同菌株情况有所不同）时比较合适。

密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。

3、试剂的质量：

所用的试剂，如CaCl2等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最好于-20℃分装保存。

（三）连接产物的转化

实验安排：

每人做一份。

试剂配制：

1、氨苄青霉素（Ampicillin,Amp）母液：

用灭菌的ddH2O将氨苄青霉素粉配成100mg/ml水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌后，置-20℃保存备用。

2、LB液体培养基（Amp＋）：

在LB液体培养基中加入1μl100mg/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。

3、LB固体培养基（Amp＋）：

在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸气灭菌20min。

待培养基温度降至50℃左右，加入1μl100mg/ml的氨苄青霉素母液后，铺制平板。

待培养基凝固后，于4℃保存备用。

操作步骤：

1、取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5µl，轻轻混匀，冰浴30min。

2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min。

3、加入400µlLB液体培养基，37℃200r/min-220r/min振荡培养45min后，以恢复质粒的抗性。

4、4℃4000r/min离心5min，弃去上清400µl，将剩余的100µl菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。

注意事项：

1、质粒的浓度：

转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。

一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。

2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。

3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。

对照组1：

以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。

对照组2：

以质粒代替DNA溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应出现大量菌落。

（四）质粒的抽提

实验安排：

每人抽提一管，采用质粒快速提取试剂盒进行。

实验原理：

本试剂盒所带Resin质子化以后，具有在高盐、低pH值情况下吸附DNA，在低盐、高pH值情况下释放DNA的性质。

试剂组成：

1、离心柱（50个）：

柱上含Resin（树脂），最大吸附量15µg，4℃保存。

2、溶液A（0.6m1）：

RNaseA10mg/m1，-20℃保存。

3、溶液B（9m1）：

50mMTris/HCl，10mMEDTA，10mg/m1溶菌酶，pH8.0，4℃保存。

4、溶液C（18m1）：

1％SDS，0.2MNaOH（室温低于15℃时会有沉淀析出，加热溶解即可）。

5、溶液D（24m1）：

4M盐酸胍，0.75MKAcpH4.6。

6、溶液E（12ml）：

洗液Ⅱ（用时加入96m1无水乙醇，充分混匀）。

7、溶液F（12ml）：

洗液Ⅲ（用时加入96ml无水乙醇，充分混匀）。

8、溶液G（5ml）：

TE缓冲液（10mMTris/HCl，1mMEDTA，pH8.0），4℃保存。

操作步骤：

1、用灭菌牙签挑取单菌落于5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中12h－16h。

2、用1.5m1离心管收集3ml-5ml菌液，15000r/min离心30s，弃尽上清。

（注：

在1.5ml离心管中加入1.5ml菌液，离心收集菌体，弃上清后再加入1.5ml菌液，收集菌体，如此反复。

）

3、加入150μl溶液B，10μl溶液A，充分振荡悬浮，室温放置5min。

（注：

悬浮细菌，消化RNA，若RNA含量很大，则消化时间可以延长。

）

4、加入300μl溶液C，温和反复颠倒混匀4-6次，室温放置5min。

（注：

混匀时用力不宜过度，看到溶液变粘即可。

）

5、加入450μl溶液D，反复颠倒混匀4-6次。

（注：

此时可见白色絮状物，颠倒力度可以比上步稍剧烈。

）

6、12000r/min离心5min，去沉淀。

7、将上清置于离心柱中，静置2min。

（注：

此时离心柱置于2ml离心管中。

）

8、8000r/min离心30s，弃掉收集管中的液体。

（注：

此时DNA被吸附于离心柱中的Resin上。

）

9、加入500μl溶液E，8000r/min离心30s，弃掉收集管中的液体。

（注：

目的是将Resin上吸附的蛋白质、盐等杂质洗脱。

）

10、加入500μl溶液F，8000r/min离心30s，弃掉收集管中的液体。

11、12000r/min再次离心1min，以甩干剩余液体。

（注：

主要是去掉残余酒精，以利DNA溶解。

）

12、将离心管柱置于新的1.5mlEp管中，室温敞开离心管盖放置5-10min，加入30μl－50μl溶液G（50℃预热）保温5min，12000r/min离心1min，管底即为质粒DNA。

（注：

溶液G可用无菌双蒸水代替，加入体积视质粒拷贝数多少、用户对质粒浓度要求而定。

50℃预热，目的是提高产量，温度不需很准，50℃一65℃均可。

）

13、0.8%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

注意事项：

1、细菌培养不要超过16小时，否则细菌会崩解，引起细菌大量死亡，导致质粒丢失。

2、抗生素浓度要正确，确保大肠杆菌中含有目的质粒，具体浓度可参看各类工具书。

3、电泳若显示有残余RNA，则可延长“3”步消化时间。

4、若发现有染色体DNA（大分子DNA）污染，则可能是菌体太多或“4”步振荡过于剧烈，使染色体DNA被打断。

5、此方法提取DNA质量非常高，适用于分子生物学任何实验要求，OD260/OD280~1.5，一般情况能达到1.7—1.8，若比值偏低，可能是菌体密度太高所致，可适当减少振摇时间。

此质粒若用来测序，可将第9、第10步各重复一遍，质粒的质量会更高。

6、此试剂盒最大收率为15μg，具体产量视菌量、质粒性质而定。

（五）重组质粒的酶切鉴定

实验安排：

每人做一管。

反应体系（20μl）：

重组质粒5μl

10×Buffer2μl

BamHⅠ0.5μl

EcoRⅠ0.5μl

ddH2O12

总体积20μl

反应条件：

37℃3h以上

结果检测：

取酶切产物10μl与2μlLoadingBuffer混合后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，同时设DL15000DNAMarker作对照。

注意事项：

1、酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

2、反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

3、酶通常保存在50%的甘油中，实验中应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶的活性将会受到影响。

4、紫外光对DNA分子有切割作用，因此从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯（300-360nm），以减少紫外光切割DNA。

5、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。

凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

三、外源基因在大肠杆菌中的表达

（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达

实验安排：

每组做一份（6人/组）。

操作步骤：

1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3ml含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。

2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5ml含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3h）。

3、取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3h。

4、分别取菌液1ml于1.5mlEp管中，12000g离心30s，收获菌体。

5、用100μl无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100µl2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5min。

6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。

注意事项：

1、IPTG的最佳诱导浓度的确定：

将IPTG以不同浓度（0.2－2.0mM）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG浓度作为其最佳诱导浓度。

2、最佳诱导时间的选择：

在菌液中加入最佳浓度的IPTG诱导6h，其间每隔1h（在第1h、2h、3h、4h、5h、6h）分别取菌液1ml，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。

（二）SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）

实验安排：

示范性操作。

实验原理：

细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。

强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。

采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。

因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。

试剂配制：

1、30%丙烯酰胺贮存液：

丙烯酰胺29.2g，亚甲双丙烯酰胺0.8g，混匀后加ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于4℃。

2、1.5MTris-HCl（pH8.0）：

Trisbase18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100ml，4℃保存。

3、1MTris-HCl（pH6.8）：

Trisbase12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml，4℃保存。

4、10%SDS：

电泳级SDS10.0g加ddH2O68℃助溶，浓盐酸调至pH7.2，定容至100ml。

5、电泳缓冲液（pH8.3）：

Tris3.02g，甘氨酸18.8g，10%SDS10ml加ddH2O溶解，定容至1000ml。

6、10%过硫酸铵（AP）：

1g过硫酸铵加ddH2O至10ml。

7、2SDS电泳上样缓冲液：

1MTris-HCl（pH6.8）1.0ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS0.4g，甘油2.0ml，0.1%溴酚蓝1.0ml，ddH2O5.0ml。

8、考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝R2500.25g，甲醇45ml，冰醋酸10ml，ddH2O45ml。

9、脱色液：

甲醇45ml，冰醋酸10ml，ddH2O45ml。

操作步骤：

采用垂直式电泳槽装置

1、安装电泳槽

2、配制分离胶（12%）（10ml）：

ddH2O3.3ml

30%丙烯酰胺贮存胶4.0ml

1.5MTris-HCl2.5ml

10%SDS0.1ml

10%AP0.1ml

TEMED4.0μl

混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面水平。

（凝胶完全聚合需30-60min）。

3、配制积层胶（5%）（3ml）：

ddH2O2.1ml

30%丙烯酰胺贮存胶0.5ml

1MTris-HCl0.38ml

10%SDS0.03ml

10%AP0.03ml

TEMED3.0μl

将分离胶上的水倒去，并用滤纸吸干多余水份，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需15-30min。

4、待积层胶完全聚合后，小心拔出梳子，然后将玻璃板固定在电泳槽上。

5、样品处理：

将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白质Marker作平行处理。

6、上样：

取10μl诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20μl低分子量蛋白Marker作对照。

7、电泳：

在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压120V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需2-3h）。

8、染色：

将胶从玻璃板中取出，置于考马斯亮蓝染色液中染色，室温4-6h。

9、脱色：

将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。

10、凝胶摄像和保存：

将脱色好的凝胶摄像，凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。

注意事项：

1、实验组与对照组所加总蛋白含量要相等。

2、为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使用。

室温较低时，TEMED的量可加倍。

3、未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。

（三）WesternBlot

实验安排：

示范性操作。

实验原理：

Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测；对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

试剂准备：

1、SDS-PAGE试剂：

见电泳实验。

2、匀浆缓冲液：

1.0MTris-HCl（pH6.8）1.0ml，10%SDS6.0ml，β-巯基乙醇0.2ml，ddH2O2.8ml。

3、电转缓冲液：

甘氨酸2.9g，Tris5.8g，SDS0.37g，甲醇200ml，加ddH2O定容至1000ml。

4、TBS（pH8.0）：

Trisbase1.211g，NaCl8.766g，加ddH2O溶解后用HCl调节pH至8.0，定容至1000ml。

5、TBST：

在TBS中加入终浓度为0.05%Tween-20即可。

6、包被液（5%脱脂奶粉，现配）：

脱脂奶粉1.0g溶于20ml的TBST中。

7、显色液：

DAB6.0mg，TBS10.0ml，30%H2O230μl。

操作步骤：

1、蛋白质样品获得：

细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞；真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min，然后4℃，13,000g离心15min，取上清液作为样品。

2、电泳：

制备聚丙烯酰胺凝胶，进行SDS-PAGE。

3、转移