肿瘤动物模型构建实验技术.docx

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肿瘤动物模型构建实验技术

肿瘤动物模型的建立可以：

（1）评价抗肿瘤免疫治疗的疗效；

（2）作为抗肿瘤药物筛选模型；

（3）为肿瘤转移研究提供更好的研究平台；

（4）为研发抗肿瘤转移性药物提供良好的实验工具。

实验方法：

诱发性肿瘤动物模型

实验方法原理：

诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。

实验材料：

肿瘤细胞小鼠

试剂、试剂盒、无血清培养基质、3%中性甲醇石腊

仪器、耗材、低温离心机、血球计数器、游标卡尺

实验步骤

一、肝癌

1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌

（1）取体重250g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘；

（2）按性别分笼饲养。

除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用；

（3）共约4个月可诱发成肝癌；

（4）也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。

2．4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌

（1）用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.5～2mg/kg；

（2）4～6月就有大量的肝癌诱发成功。

3．2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌

（1）给成年大鼠含0.03%2AAF标准饲料；

（2）每日每平均2～3mg2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。

4．二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌：

（1）用剂量为每日0.3～14mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予；

（2）6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。

5．亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌

（1）用1%OAAF苯溶液（约0.1ml含1mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。

（2）实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。

（3）或用2.5mgOAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。

6．黄曲霉素诱发大鼠肝癌

（1）每日饲料中含0.001～0.015ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。

二、胃癌　

1．甲基胆蒽诱发小鼠胃癌

（1）取20g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。

（2）含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内，在酒精灯上微微加温，使MC液化渗入线结。

MC浓度为0.05～0.1g20-甲基胆蒽内浸入10～20根线。

（3）手术埋线后4～8个月可诱发成功胃癌。

2．不对称亚硝胺诱发小鼠胃癌

剂量为0.25ml/kg体重，3个月后全部动物发生前胃乳头状癌，7～8个月后有85～100%发生前胃癌。

昆明种最敏感。

A系次之，615系小鼠敏感性最差。

3．甲基亚硝基醋酸尿素诱发小鼠胃癌

给BD大鼠饮水中加甲基亚硝基醋酸尿素，剂量为2mg/kg体重，每周饮用5次，520天后全部大鼠均发生了腺胃癌。

三、食管癌　

1．甲基苄基亚硝胺（MBNA）诱发大鼠食管癌

（1）取体重100g以上的Wistar大鼠；

（2）任其食用含甲基苄基亚硝胺的饮水，并将MBNA掺入饲料中使每日摄入量达0.75～1.5mg/kg体重；

（3）80～100天可诱发成食管癌。

2．二烃黄樟素（Dihydrosafrole）诱发大鼠食管癌

（1）二烃黄樟素是一种制备啤酒的调味品，在大鼠饲料中加入百万分之二千五百至一万（2500～10000ppm）黄樟素，就能引起20～75%的食管癌。

3．甲基苄基亚硝胺诱发大鼠食管癌

（1）用0.2%或0.005%的甲基苄基亚硝胺水溶液，给动物经口灌喂，每天一次，大鼠灌注剂量为1mg/kg体重；

（2）至第27天即发现一例食管乳头状瘤，154天发现第一例食管癌，11个月食管癌的发生率为53%。

四、肺癌　

1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发小鼠肺癌

（1）小白鼠每周皮下注射1%DEN水溶液一次，每次剂量56mg/kg，DEN总剂量达到868mg；

（2）观察时间为100天左右时，发癌率可达40%。

（3）DEN总剂量达到1176mg，观察时间为半年左右时；发癌率可达94%。

2．乌拉坦诱发肺腺癌

（1）小鼠（A系，1～11/2月龄）较大鼠敏感，每次每只腹腔注入10%乌拉坦生理盐水液0.1～0.3ml，间隔3～5日再注，共注2～3个月，每只小鼠用量约为100mg；

（2）注后3个月肺腺癌发生率为100%，而且多数为多发性，这种诱发瘤为良性。

3．苯并芘诱发肺腺癌

（1）猴气管内注入3，4-苯并芘（苯并花为3～15mg与等量之Fe2O3混合液），每周一次，共10次；

（2）6只猴中有2只诱发肺的鳞状上皮癌。

4．硫酸铵气溶胶诱发肺腺癌

（1）用硫酸胺气溶剂给100只大鼠吸入；

（2）13个月后所有大鼠都发生了肺腺癌。

5．甲基胆蒽诱发肺腺癌

（1）用0.2%明胶作悬浮剂将甲基胆蒽混合后给金地鼠气管内注入，每次0.1ml（含甲基胆蒽5mg）每周一次，共6次；

（2）53周后有62.5%动物发生了肺癌。

五、鼻咽癌

1．二甲基胆蒽（MC）诱发大鼠鼻咽癌

（1）取直径2～3mm的硬质塑米管，在酒精灯上小火拉成锥形，每段长约3.5cm，管内填以结晶体MC。

（2）小管一端用火封闭，以防药物外溢，尖端用针刺数孔，使MC能从小妃溢出。

（3）取体重120g左右的大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，由前鼻孔将上述含MC的塑料小管插入鼻腔，利用前鼻孔较小管粗端为小的特点，稍加用力，迫使小管全部进入鼻腔内，其尖部可达鼻咽腔。

不需另加固定，即可使小管长期留于鼻腔内。

（4）待到预定时间（半年以上），或动物自行死亡时，到其鼻咽部，10%福尔马林固定，脱钙后，石蜡包埋，进行连续切片。

发癌率可达60%以上。

2．二乙基亚硝胺滴鼻法诱发鼻咽癌

（1）取120g左右大白鼠，雌雄均可，乙醚麻醉后，用磨平针尖的8号针头，从前鼻孔轻轻插入，针尖可达鼻咽腔；

（2）经注射器灌注用1%吐温-80新配的33.3%DEN混悬液0.02ml（含DEN6.7mg）每周1次，共15～20次，可诱发成鼻咽癌。

六、宫颈癌　

1．二甲基胆蒽（MC）诱发宫颈

取雌性小白鼠，以附有0.1mgMC的棉纱线结在动物不麻醉的状态下，借助于阴道扩张器及磨纯的弯针，将线穿入宫颈。

经右宫角背部穿出，使线结固定于宫颈口。

线的另一端则固定于背部肌肉，缝合皮肤，挂线以后，同日开始连续注射青霉素2～3天。

以防术后感染。

至一定时间（半年左右）处死动物，宫颈组织用10%福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片。

七、结肠癌　

1．二甲基苄肼（Dimethlhydrazine，DMH）诱发鼻咽癌

（1）给四周龄的雄性大白鼠，皮下注射二甲基苄肼（Dimethlhydrazine，DMH）每周一次，连续21周，每次DMH21mg/kg；

（2）最后一次给药后1～4周，处死动物；

（3）降结肠部位用Bouin液固定，脱水，石蜡包埋，切片。

所用之DMH先配成每100ml含400mg的母液，并加EDTA37mg，用氢氧化纳（0.1N）液将pH调至6.5备用。

注意事项

1．要设计不同的实验组和对照组，每组动物数一般为5-10只；

2．一般接种肿瘤6-8周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为15-20mm（即小鼠会濒临死亡）时，可眼球取血，分离血清并保存血清，处死小鼠，取肿瘤组织照相，取部分肿瘤组织作冰冻组织切片（或-80℃保存），作相应的免疫组织化学染色，取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定，石腊包埋，作常规HE染色。

其他

1．芳香胺及偶氮染料类致癌物的特点

（1）通常需要长期、大量给药才能致癌；

（2）肿瘤多发生于远隔作用部位的器官如膀胱、肝等；

（3）有明显的种属差异；

（4）其本身不是直接致癌物，致癌是由于其某种代谢产物的作用；

（5）其致癌作用往往受营养或激素的影响，例如，奶黄仅在以缺少蛋白质和核黄素的饲料喂饲大鼠时才引起肝癌，而且雄性大鼠较敏感，邻位氨基偶氮甲苯则易起雌性大鼠的肝癌。

2．亚硝胺类的致癌特点

（1）致癌性强，小剂量一次给药即可致癌；

（2）对多种动物（包括猴、豚鼠等不易诱发肿瘤的动物）的许多器官（包括食管、脑、鼻窦等不易引起癌的器官）能致癌，甚至可以通过胎盘致癌，如给怀孕大鼠以二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）可比较快地引起仔鼠的神经胶质细胞瘤；

（3）具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性，例如二甲基亚硝胺等对称的衍生物常引起肝癌，不对称的亚硝胺如甲基苄基亚硝胺常诱发食管癌；在大鼠，二丁基亚硝胺能引起膀胱癌，二戊基亚硝胺能诱发肺癌，而N-甲基-N-硝基-N-1-亚硝基胍则能引起胃肠癌。

3．黄曲霉毒素的致癌特点

（1）黄曲霉毒素的毒性很强，很小剂量（1mg/kg体重）即可使狗、幼龄大鼠、火鸡或小鸭致死；

（2）其致癌性也极强，最小致癌剂量比亚硝胺还要小数十倍，是已知化学致癌物中作用最强者；

（3）它能诱发多种动物（从鱼到猴）的肝癌，也可引起肾、胃及结肠的腺癌，滴入气管内可引起肺鳞状细胞癌；

（4）注入皮下可引起局部的肉瘤，还有报告认为，它可引起泪腺、乳腺、卵巢等其它部位的肿瘤。

4．其他

在动物实验中早已确定：

乙硫氨酸可诱发大鼠肝癌；乌拉坦（氨基甲酸乙酯，C２H５O－CONH２）、氨乙胺可引起小鼠的肺癌；一些卤代烃如四氯化碳、氯仿等可引起大鼠或小鼠的肝癌。

构建实验

（学习的目的是增长知识，提高能力，相信一分耕耘一分收获，努力就一定可以获得应有的回报）