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微生物资料总结剖析
第一部分
1有益微生物的应用形式----可利用微生物的范围的扩大
挖掘已知微生物的潜力,对现有微生物的认知能力的提高:
eg:
肉毒梭状芽胞杆菌——肉毒素
冰核菌-----含有能产生冰核活性很强的特异性冰蛋白的一类微生物。
特异性冰蛋白可作为水分子冷冻的模板,在较高的亚零下温度下诱发和加速水的冷冻过程。
发现微生物新资源
嗜极端环境微生物
创造微生物新品种-----工程菌
将其它生物来源的目的基因导入到微生物中表达
eg:
将目的基因从不安全的微生物中导入到食用级安全微生物中表达利用
原料不同,同种微生物;菌种不同,原料相同
☆1.1应用形式的举例:
(1)发酵菌体的应用
●食用菌的生产,食用菌主要包括菌盖,菌柄,菌根三个部分,日常食用部位为子实体。
●单细胞蛋白的生产应用
单细胞蛋白(singlecellprotein,SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白。
是指利用工业废气物(废水、废气、废渣)或农副产品发酵生产的用于食品和饲料添加剂的微生物菌体(Microbialbiomass),无论是分离出的细胞蛋白,还是全部细胞物质均称为SCP。
●微生态制剂的应用
微生态制剂(或称微生态调节剂microeclogialmodulator)是在微生态学理论的指导下,调整生态失调(microdysbiosis)保持微生态平衡(microeubiosis),提高宿主(人、动植物)健康水平或增进健康佳态(wellbeing)的生理性活菌制品(微生物)及其代谢产物以及促进这些生理菌群生长繁殖的物质制品。
(2)发酵产品
酱油:
以花生饼、豆饼、麸皮(含多缩戊醛)或麸皮加部分小麦粉为原料,在米曲霉,酵母菌等微生物作用下,发酵生产的一类产品。
食醋:
以谷物、糖蜜、麸皮等为原料,在米曲霉、酵母、醋酸杆菌作用下发酵形成的产品
豆腐乳:
以豆类为原料,在毛霉、根霉、米曲霉等微生物作用下发酵形成的产品。
啤酒,葡萄酒,黄酒,发酵酸奶等
(3)代谢产物的应用
氨基酸:
有机酸,核苷酸,维生素,色素……
(4)微生物酶的应用
●利用胞外酶将原料中大分子蛋白质、淀粉等分解为可被细菌和酵母菌利用的小分子物质,如氨基酸、葡萄糖等;
●利用胞内酶,通过代谢调节和人工控制发酵条件,利用糖类等某些营养物质在发酵过程中积累大量的代谢产物,如酒精、氨基酸、柠檬酸、乳酸、乙酸等发酵产品;
此外,还可利用某些微生物在人工培养过程中产生大量的酶的特性,从发酵液(物)中提取酶来生产酶制剂(淀粉酶、蛋白酶、纤维素分解酶等),广泛用于食品发酵、制药、制糖、制革和饲料工业中。
(5)工厂废弃物处理中的应用
污水处理方法:
物理处理法;化学处理法;生物处理法。
生物处理法:
活性污泥法作用原理:
将废水置于强烈通气(或称曝气)池中,与以无机物(主要是泥土,也可以是絮凝沉淀物)为骨架和具有大量微生物的污泥相接触的过程。
2有害微生物的监控
2.1包括两个方面:
●微生物卫生标准的制定
●检测方法的进步和更新
2.2检测手段
方法的更新(快速、准确、灵敏)及多样化(传统法、免疫血清学方法、分子生物学方法)
设备的更新(方便、快捷)
2.3提高监控微生物的手段----有害微生物的预防及控制
预警-----快速
预防措施-----高效:
疫苗
消毒灭菌措施-----方法多样
第二部分微生物分类进展
1微生物分类依据
(1)形态学特征:
微生物可利用的形态特征少;形态特征在不同类群中进化速度差异大,不准确。
(2)生理生化特征
(3)生态特征
(4)血清学反应
(5)细胞化学成分鉴定:
A:
细胞壁的化学组成
B:
全细胞水解液的糖型:
C:
磷酸类脂的成分分析:
D:
枝菌酸的分析:
E:
醌类的分析:
(6)核酸的碱基组成和分子杂交
A:
DNA碱基比例的测定——主要是(G+C)mol%值:
同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4~5%以下;同属不同种的差别应低于10~15%
B:
核酸分子杂交——DNA-DNA和DNA-RNA杂交
C:
16SrRNA寡核苷酸编目分析
(7)氨基酸序列和蛋白质分析
2微生物的命名(包括常见微生物的中英文名字)
2.1俗名(Commonname)
eg:
结核杆菌:
结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis
红色面包霉:
粗糙脉胞霉Neurosporacrassa
2.2学名(Scientificname)
林奈的“双名法”Binominalnomenclature
2.2.1双名法的规则
学名=属名+种名加词+(首次定名人)+现名定名人+首次命名年份
2.2.2三名法
亚种或变种的命名
BacillussubtilisAS1.398表示枯草芽孢杆菌的蛋白酶生产菌株
BifidobacteriumbifidumATCC29521表示两歧双歧杆菌一个模式菌株
☆3微生物分类依据
3.1原核微生物的分类系统纲要——伯杰氏手册
3.1.1《伯杰氏细菌鉴定手册》
《伯杰氏细菌鉴定手册》是细菌分类系统的综合和标准,由美国细菌学家协会(现称美国微生物学会)发起编写的,最初指定DavidH.Bergey作为编委会主席,在1923年出版了手册的第一版,相继在1925、1930、1934、1939、1948、1957、1994年出版了第二至第九版,成为国际上细菌学家普遍接受和采用。
第九版伯杰氏细菌鉴定手册设立35个群,将古细菌部改编为5个群,全书描写了约500个属。
划分为四大类:
第一类具细胞壁的革兰氏阴性真细菌
第二类具细胞壁的革兰氏阳性真细菌
第三类无细胞壁的真细菌
第四类古细菌
3.1.2《伯杰氏系统细菌学手册》
1984-1989年陆续出版的四卷册《伯杰氏系统细菌学手册》第一版,在着重于表观特征描述的基础上,结合化学分类、数值分类特别是DNA相关性分析,及16SrRNA寡核苷酸编目在生物种群间的亲缘关系研究中的应用作了详细的阐述,体现了细菌分类的研究从表观向系统发育体系的发展。
除此,还附有每个菌群的生态、分离、保藏及鉴定的方法。
第二版由GeorgeGarrity主编分为5卷,将从2000年起陆续出版。
这一版纳入了研究核糖体RNA测序所产生的许发育)分类系统。
分古细菌和真细菌2个界,下设18门、27纲、73目、186科,包括870余属和4900多个种。
3.2真菌分类
——Ainsworth分类系统(1971,1983年)
真菌界KingdomFungi
粘菌门Myxomycota480多种
真菌门Eumycota近10万种
鞭毛菌亚门(壶菌纲、丝壶菌纲、卵菌纲)
接合菌亚门(接合菌纲、毛菌纲)
子囊菌亚门(26000多种)
担子菌亚门(层菌纲、腹菌纲、锈菌纲、
黑粉菌纲24000多种)
半知菌亚门(腔孢纲、丝孢菌纲26000多种)
3.2.1《真菌字典》第8版
1995年,根据16sRNA序列的研究、生物化学和细胞壁组分以及DNA序列分析的结果,国际真菌学研究的权威机构—英国国际真菌研究所(InternationalMycologicalInstitute)出版的第8版《真菌字典》中,将原来的真菌界划分为原生动物界、藻界和真菌界。
真菌界仅包括了4个门,即壶菌门、接合菌门、子囊菌门和担子菌门。
4常见保藏菌种的机构
ACCC中国农业微生物菌种保藏管理中心
中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM);
ISF中国农业科学院土壤肥料研究所
“ATCC”为AmericanTypeClutreCollection(美国典型菌种保藏中心)的缩写。
NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)日本技术评价研究所生物资源中心
CBS(CentraalbureauoorSchimmelcultures)荷兰微生物菌种保藏中心
英国国家典型菌种保藏中心(NCTC)
NCIMB(NationalCollectionsofIndustrial,FoodandMarineBacterial)英国食品工业与海洋细菌菌种保藏中心
DSMZ(DeutscheSammlungonMikroorganismenundZellkulturen)德国微生物菌种保藏中心
5六界系统三大领域
5.1五界系统(1969年Whittaker)
5.2六界系统:
5.3三大领域:
1.Woese16SrRNA序列分析比较,提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来改称三个域):
古细菌、真细菌(Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。
2.1990年,他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类,他又把三界(域)改称:
Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。
☆☆6古细菌的相关知识(定义、来源、分出来的依据、特点:
细胞结构,化学组成,环境特点)
古菌是一群具有独特基因结构或系统发育生物大分子序列的单细胞生物,大多生活在地球上如超高温、高酸碱度、高盐浓度、严格无氧状态等极端环境或生命出现初期的自然环境。
6.1古菌的特点
☐形态
☐细胞结构:
☐细胞壁
☐细胞膜
☐代谢方式:
多样化
☐呼吸类型:
多为严格厌氧
☐繁殖方式:
裂殖,慢
☐分布:
多为极端环境
☐遗传物质特性:
16srRNA序列特征既不同于真细菌,也不同于真核生物
☐对抗生素的敏感性:
与真核生物相同,而与真细菌不同
6.2古菌的分类
(1)产甲烷古细菌:
●是一类在形态和生理方面有着极大差异能产甲烷的严格厌氧微生物。
●其共同点在于利用氢气、二碳化合物(甲酸或乙酸等)在厌氧条件下还原CO2产生甲烷和合成细胞物质。
●细胞中常含有辅酶M(-巯基乙基磺酸)和能在低电位条件下传递电子的因子F420。
有些类群能同化CO2营自养生活,但同化CO2不经卡尔文循环,而是将它直接固定为乙酸盐加以利用。
●主要分布在有机质厌氧分解的环境中,如沼泽、湖泥、污水和垃圾处理场、动物的胃及消化道和沼气发酵池中,包括G+和G-,自养和异养。
产甲烷古菌分类
产甲烷菌属
Gram反应
细胞壁主要成分
甲烷杆菌属(Methanobacterium)
G+
假胞壁质
甲烷短杆菌(Mthanobrevibacter)
G+
假胞壁质
甲烷球菌属(Methanococcus)
G-
蛋白质单位,少量葡萄糖胺
甲烷微菌属(Methanomicrobium)
G-
蛋白质亚单位
产甲烷菌属(Methanogenium)
G-
蛋白质亚单位
甲烷螺菌属(Methanospirillum)
G-
蛋白质亚单位,蛋白质鞘
甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)
G+
异多糖
(2)极端嗜盐古细菌(Hyperthermophilicarchaea)
能在含盐20%-30%甚至饱和盐水中生活
生长需要的盐浓度为1.5molL-1NaCI,大多数在3.5-4.0molL-1NaCI时生长最好
严格好气,化能有机营养,常以蛋白质、氨基酸等为碳源和能源,细胞内累积高浓度来进行渗透压调节
分布在盐湖和晒盐池中,常引起腌制食品等的腐败和脱色
主要有嗜盐杆菌属(Halobacterium)和嗜盐球菌属(Halococcus)
(3)极端嗜热嗜酸古细菌
●是一类依赖于硫,能耐高温(80℃-100℃)和高酸度(pH1-3)的特殊类群。
●极端嗜热嗜酸细菌在形态和生理上也有较大的变异。
●主要生活在含硫的温泉、火山口及燃烧后的煤矿等自然环境中。
●包括有化能自养、化能异养及兼性3种营养类型。
●瓣硫菌属(Sulfolobus)和高温枝原体属(Thermoplasma)等是它们的代表。
(4)还原硫酸盐古细菌
最适生长温度80~83℃
(5)无细胞壁古菌群
专性嗜热,十分嗜酸,兼性厌氧
☆第三部分微生物育种
1微生物育种方式
菌种选育的目的:
科研,生产
2工业生产自然选育微生物菌种
2.1从自然界分离所需要的菌株
(1)向菌种保藏机构索取有关菌株,从中筛选所需菌株。
(2)由自然界采集样品。
(3)从一些发酵制品中分离。
2.2把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
2.3具体操作步骤:
(一)采样
(1)、从土壤中采样
细菌(108)>放线菌(107)>霉菌(106)>酵母菌(105)>藻类(104)>原生动物(103)
根据土壤有机质含量,通气状况,酸碱度,植被状况,地理条件(南方较好),季节条件(秋季最佳)
(2)、根据微生物生理特点采样
微生物营养需求、代谢类型、生理特性。
(3)特殊环境下采样
局部环境条件;极端环境条件
☆
(二)、富集培养
目的:
是在目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,创造有利的生长条件,使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖,数量增加,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中地优势种,以利分离到所需要地菌株。
注意:
如果按通常分离方法在培养基平板上能出现足够多数量的目的微生物,则不必进行富集培养。
方法:
主要根据微生物的碳、氮源、pH值、温度、需氧等生理因素加以控制。
(1)控制培养基的营养成分
(2)控制培养条件
如:
细菌、放线菌生长繁殖pH7.0-7.5
霉菌、酵母菌生长繁殖pH4.5-6
(3)抑制不需要的菌类
通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量,使目的微生物的比例增加。
eg:
分离芽孢杆菌:
土样加热至80℃或在50%乙醇溶液中浸泡1小时,杀死不产芽孢的菌种后再行分离。
+适量胆盐+十二烷基磺酸钠抑制G+
+少量硫乙醇酸钠分离厌氧菌
☆(三)分离
分离方法:
(1)稀释平板法(pourplatemethod)
将含微生物的样品用无菌生理盐水进行梯度稀释,取少量与冷却至50℃的固体培养基混合,摇匀,倒混菌平板或涂平板,倒置培养24小时,出现菌落。
适用于:
数量占优的微生物。
好氧,在平板上形成菌落的微生物。
(2)涂布平板法(spreadplatemethod)
稀释平板法因为细菌与50的培养基混合导致某些热敏感菌死亡及好氧菌埋在培养基中缺乏氧气影响生长,所以更常用涂布平板法
(3)平皿划线分离法(streakplatemethod):
接种环沾取少许微生物,在无菌平板扇形、平行等划线,随划线次数增加而分散开,得到单菌落。
(4)利用平皿的生化反应进行分离
○透明圈法:
在平板培养基中加入溶解性较差的底物,使培养基浑浊。
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈,圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。
分解水解酶产生菌时多采用,如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌。
●分离淀粉酶产生菌:
以淀粉为唯一碳源,样品涂布培养形成单菌落后,再用碘液浸涂,根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。
●分离核酸水解酶产生菌:
普通平板,样品涂布培养长出菌落后覆盖一层营养琼脂,内含3%酵母RNA,0.7%琼脂及0.1mol/LEDTA,pH7.0,于42℃左右培养2-4小时,挑四周产生透明圈的菌落
●分离某种产生有机酸的菌株:
选择培养基+CaCO3
○变色圈法:
在底物平板中+指示剂或显色剂
●筛选果胶酶产生菌
0.2%果胶为唯一碳源培养基平板涂布培养长出菌落后,加入0.2%刚果红溶液染色4小时,具有分解果胶能力的菌落周围会出现绛红色水解圈。
●分离谷氨酸产生菌
培养基+溴百里酚蓝(变色范围在pH6.2-7.6,pH<6.2,黄色;pH>7.6,蓝色。
)
○生长圈法
常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。
(缺少某种营养物的)培养基+营养缺陷型菌株+被检菌
○抑菌圈法
常用于抗生素产生菌的分离筛选。
培养基+抗生素的敏感菌(作为检验菌)+被检菌
采用冷敏感菌筛选抗生素突变株,GiuseppeSatta等从人的病源菌中诱变分离低温敏感菌突变株(冷敏菌),在20℃以下不生长。
将冷敏菌+放线菌孢子混合于平板上20℃培养3-4天,放线菌生长产抗生素,再移至37℃培养18-20小时,冷敏菌迅速生长,观察抑菌圈。
(5)组织分离法
●由一些有病组织或特殊组织中分离菌株的方法。
●含菌组织一小块洗去表面污物后用10%漂白粉或0.1%升汞浸泡2-5分钟,进行表面消毒,无菌水冲洗。
移至平皿培养基上,适温(25℃-26℃)培养,再分离纯化。
(6)单细胞或单孢子分离法
滤纸片法:
取与皿内径大小一致的滤纸3-4层,浸在培养液中,取出放在空皿内,在滤纸上滴几滴甘油以防干燥,盖好皿盖,灭菌。
将稀释为1500ml-1的孢子悬液用滴管滴在滤纸上,每皿约点20滴左右,经恒温培养,每滴约出现10个菌落,将单菌落移接于斜面上。
(7)通过控制营养和培养条件进行分离
●控制培养基的营养成分
如特殊菌类---环保降解菌(降解烃类、有机染料、表面活性剂、农药等)的分离:
以该物质为唯一碳源或氮源进行长时间(几个月的连续培养)富集培养。
●控制培养基的pH
●排除不需要的菌类
●控制培养温度
(8)厌氧微生物的分离
●加还原剂于培养基中如半胱氨酸等。
●去氧:
焦性没食子酸+NaOH
(四)筛选和目的产物的鉴别
1.平板筛选
2.摇瓶发酵筛选
摇瓶振荡培养得发酵液待测平板打孔(厚3mm内径5mm钢圈打孔)+过滤后的发酵液10ul或灭菌圆滤纸片上滴入1-2ul发酵液代替打孔. 孔或滤纸片的周围出现活性圈(溶菌圈或水解圈),根据其大小判定活力大小.
(五)毒性试验
3诱变育种(现有微生物改造)
3.1定义
以诱发突变为基础的育种,是迄今为止国内外提高菌种产量、性能的主要手段。
3.2步骤与方法
(一)出发菌株的选择
1.自然选育的具有一定生产能力的野生或至少能少量产生目的产物的菌株。
2.具有有利性状的菌株,如生长速度快,营养要求低以及产孢子早而多的菌株。
3.选择已发生其它变异的菌株。
4.采用“增变菌株”(对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高)的变异菌株。
*诱变育种工作中,一般采用3-4个出发菌株,在逐代处理后,将产量高、特性好的菌株留作继续诱变的出发菌株。
(二)单细胞或单孢子悬液的制备
●采用对数期细胞或成熟而新鲜的孢子:
用发芽孢子(芽长为孢子Ø0.5-1倍)或直接用斜面孢子。
●不产生孢子的真菌采用年幼的菌丝体。
●均匀的悬液。
(三)诱变剂及诱变剂量的选择
1.诱变剂的种类
(1)物理诱变剂
❑非电离辐射(只使物质分子或原子中的电子级能提高)----紫外线
紫外线最有效的波长是2537埃。
采用15w紫外线灯管,30cm距离。
❑电离辐射:
杀菌率90%-99.9%
❑其它物理诱变剂:
微波、红外线、激光、高能电子流等。
(2).化学诱变剂
2.诱变剂的选择
▪碱基类似物和羟胺具有很高的特异性,但很少使用,回复突变率高,效果不大。
▪亚硝酸和烷化剂应用的范围较广,造成的遗传损伤较多。
其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”,甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。
▪吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。
▪紫外线仍十分有效。
电离辐射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂,它能造成不可回复的缺失突变。
但它可能影响邻近基因的性能。
3.诱变剂量的选择
(1)处理剂量大,杀菌率高(90%-99%),在单位存活细胞中负变菌株多,正变菌株少。
(2)用小剂量进行诱变处理时,杀菌率约50%-80%,在单位存活细胞中正变株多,然而大幅度提高产量的菌株可能较少。
(3)化学诱变剂主要是调节浓度、处理时间、处理条件(温度、pH值等)。
物理诱变剂主要是控制照射距离、时间和照射过程中的条件(O2、水等)。
4.诱变剂处理方式
(1)单因子处理
•处理1次
•连续重复使用
(2)复合因子处理
•两个以上因子同时处理
•不同诱变剂交替处理
(四)中间培养
☆原因:
由于在发生了突变尚未表现出来之前,有一个表现延迟的过程,即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟),需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。
这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。
☆方法:
让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时,以让细胞的遗传物质复制,让细胞繁殖几代,以得到纯的变异细胞。
这样,隐性的变异就会显现出来,若不经液体培养基的中间培养,直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能,形成混杂菌落,以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
(五)突变株的分离与筛选
筛选分初筛和复筛。
初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的,以量为主。
复筛则是精选,以质为主,也就是以精确度为主。
因此在具体方法上就有差异.
1.筛选程序
2.初筛方法
(1)随机筛选(摇瓶筛选)
缺点:
如果菌落挑取少了,很难筛选到理想的突变株(因为突变概率小)
(2)平板菌落筛选(摇瓶初筛前的一种预筛)
可根据菌落形态或利用菌落产生的代谢产物与培养基中检定菌、底物或指示剂作用后,在其周围形成抑菌圈、呈色圈或其他特异性反应圈,测定反应圈直径。
●根据菌落形态
由突变引起形态剧烈变化的菌落(负突变多)
突变的高产菌株其菌落形态往往在常态的正常范围内,因为它们的遗传物质仅受到微小损伤,还保留了正常代谢的基本功能。
一个菌株的高产性能是经过多代微小突变累积的,一代诱变后的菌落形态与直接亲本之间形态变化一般不明显,但经长期多代诱变后,高产菌株与其最原始的亲代在形态特征上还是有明显差异。
●根据平板菌落生化反应筛选
(3)浓度梯度法
(4)琼脂块法
日本人八木建立,此法广泛用于抗生素和酶类等突变株的筛选。
优点:
准确性比直接平板上特异性反应圈更可靠;方法较为简便;筛选量很大,一次可筛选琼脂块上的菌落达1000-3000个或更高。
(比常规筛选量提高15-20倍)
(5)其它
复印技术
3复筛方法——摇瓶液体培养
其培养条件接近于发酵罐,可作为发酵工艺模拟试验,选出的菌种易推广到大生产中去。
初筛:
1瓶/株,逐个进行活性测定,凡生产能力比出发菌株高10%以上的进行保种和复筛。
复筛:
3-5瓶/株,观测重复性。
*注意:
培养条件要尽量与大生产发酵条件相近。
培养条件的相似性:
摇瓶型号、装量、瓶塞厚度、摇瓶转速、温度、摇瓶位置、室内相对湿度等。
(六)产物活性测定
一般突变规律:
一个出发菌株通过一次诱变,生产能力提高5%的突变株约为1/50,而生产能力提高10%以上的突变株约为1/300。
通常诱变一代至少要挑选1000株以上,经平皿预筛后,约保留200株进行摇瓶初筛。
Ø经典法:
蛋白酶测定采用分光光度法;脂肪酶测定采用NaOH滴定法;……。
缺点是操作繁琐、样品不能同时测定,带来误差。
Ø快速检验法:
琼脂平板活性圈法:
平板打孔加入发酵液或滤纸片浸透发酵液覆盖于琼脂平板上(加有检验菌或底物)。
Ø其他法
(七)培养基和培养条件的调整
☆表型迟延
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