生物化学综合实验报告毛豆总蛋白质的提取及亲缘关系的研究.docx
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生物化学综合实验报告毛豆总蛋白质的提取及亲缘关系的研究
生物化学综合实验
毛豆总蛋白质的提取及亲缘关系的研究
姓名:
学号:
201064
学院:
生物与食品工程学院
班级:
食品科学与工程10-2班
目录
摘要2
关键词2
引言2
目的3
原理3
试剂与器材5
实验操作流程6
实验结果及处理8
讨论11
参考文献12
毛豆不同组织可溶性蛋白提取和多肽组分差异研究
摘要:
本实验对毛豆的子叶与豆荚中可溶性蛋白进行提取,用考马斯亮蓝法对其定量分析,并采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳分离且比较其中的多肽组分,掌握蛋白质的一般研究方法和操作,而且对毛豆的不同组织的可溶性蛋白的性质有所了解。
关键词:
毛豆可溶性蛋白考马斯亮蓝SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Abstract:
Theexperimentsofsoybeancotyledonandit'srindofsolubleproteinextraction,withCoomassieBrilliantBluetotestitsquantitativeanalysis,andevenaSDSpolyacerylamidegelelectrophoresisseparationandisoneoftheproteincomponents,polypeptideofthegeneralmethod,andoperationofsweetpotatoes,andtheorganizationoftheproteininnaturehavebeenresolved.
Keywords:
soybeansolutionproteinCoomassieBrilliantBlueSDS-PAGE
引言
蛋白质的性质、结构和功能的研究,以及生物体内蛋白质构象的变化都是建立在蛋白质分离纯化基础上的。
在蛋白质的分离过程中,必须通过分子量大小测定来获得所提蛋白质的大小,并通过SDS-PAGE电泳比较分析有差异的条带。
毛豆,就是新鲜连荚的黄豆,晒干之后又称大豆。
毛豆中富含不饱和脂肪酸、卵磷脂、食物纤维、金属离子钾和铁,另外还有降血脂和降低血液中胆固醇的作用和养颜润肤、有效改善食欲不振与全身倦怠的功效。
本实验通过对毛豆不同组织可溶性蛋白的提取,含量测定,差异条带研究,从而掌握蛋白质的系列研究方法和操作。
目的
1.掌握冷冻离心机的操作使用方法;
2.掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理;
3.掌握分光光度计的使用方法和原理;
4.掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理;
5.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。
原理
植物材料中通常含有两类蛋白,一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白,另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。
将植物材料在一定的提取缓冲液和低温下充分研磨,可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里,通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除,得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。
考马斯亮蓝G-250(Coomassiebrilliantblue,G-250)法是利用蛋白质-染料结合的原理,定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式,红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德瓦尔键结合,在一定蛋白质浓度范围内,蛋白质和染料结合符合比尔定律。
此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式,最大光吸收由465nm变成595nm,通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程,约2min即可反应完全,呈现最大光吸收,并可稳定1h,之后,蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。
此法灵敏度高(比Lowry法灵敏4倍),易于操作,干扰物质少,是一种比较好的定量法。
其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低,且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N—methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N—四甲基乙二胺(N,N,N,N—tetramethylethylenediamine,简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8,简称AP)或核黄素(ribofavin即vitaminB2,C17H20O6N4)的作用下聚合交联成的高分子物质,具有三维网状结构和分子筛性质。
以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,简称PAGE)。
使用不连续凝胶电泳因具有浓缩效应而能得到较好的电泳条带。
(分子筛效应:
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率,这就是分子筛效应。
分子量小,阻力小,移动快;分子量大,阻力大,移动慢。
浓缩效应:
样品在电泳的过程中被浓缩成高浓度的薄层。
)
由于蛋白质所带的静电荷、分子量大小和形状不同,在电泳中会产生不同的电荷效应和分子筛效应,不连续电泳还有浓缩效应,因而有不同的牵引率。
聚丙烯酰胺凝胶由于富含酰胺基,故它是稳定的亲水凝胶。
结构中不带电荷,因而在电场中电泳电渗现象极为微小。
网状结构能限制蛋白质大分子的扩散运动,具有良好的抗对流作用。
在设和浓度范围内还具有良好的透明度,一定的机械强度,以及化学上惰性、吸附作用很小等许多优点。
十二烷基硫酸钠(简称SDS)是阴离子表面活性剂,它在水溶液中,以单体和分子团的混合形式存在。
单体SDS能与蛋白质结合生成蛋白质-SDS复合物。
由于SDS带有大量负电荷,所以生成的蛋白质-SDS复合物所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的电荷。
在蛋白质溶液中,加入SDS和巯基乙醇,巯基乙醇可使蛋白质分子中的二硫键还原,使多肽组分分成单个亚单位,SDS可使蛋白质亚单位中的氢键、疏水键打开,因此SDS与蛋白质结合后,还引起蛋白质构象的改变,蛋白质-SDS复合物形状近似雪茄型的长椭圆棒,不同复合物的短轴相同,约1.8nm,而长轴改变则与蛋白质的分子量成正比。
基于上述两种情况,蛋白质-SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受原有电荷和形状的影响,而只是与椭圆棒的长度有关,也就是只与蛋白质的分子量有关。
电泳体系中加入十二烷基硫酸钠,则电泳迁移率主要依赖于蛋白质分子量,而与所带的静电荷和形状无关,这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
蛋白质分子量在10,000—200,000之间时,电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系,可用下列公式表示:
lgMr=K-bm
上式中,Mr为蛋白质分子量;K为常数;b为斜率;m为相对迁移率(即蛋白质的电泳迁移距离除以示踪染料迁移距离)。
根据上述方程将已知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图,可制作出一条标准曲线。
在相同的条件下测得未知分子量的蛋白质的电泳迁移率,即可从标准曲线求得其近似分子量。
不同的凝胶浓度适用于不的分子范围(见表1),可根据所测分子量的范围选择最适凝胶浓度,并尽可能选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白。
凝胶浓度
交联度
分子量范围
5%
2.60%
25,000-200,000
10%
2.60%
10,000-70,000
15%
2.60%
20,000-50,000
表1分子量范围与凝胶浓度关系
试剂与器材
一、样品与试剂
1.新鲜的带荚毛豆;
2.考马斯亮蓝G250:
称取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml90%乙醇中,加入85%(W/V)磷酸100ml,最后用蒸馏水定容至1000ml贮于棕色瓶中。
3.电极缓冲液:
称SDS1克,Tris3g,甘氨酸14.4g,再用蒸馏水定容至1L,4度冰箱保存;
4.0.5mol/LpH6.8的Tris-HCl缓冲液:
称取12.5gTris于烧杯,用适量蒸馏水溶解,用盐酸调pH至7.0,然后定容至1000ml;
5.标准蛋白溶液(牛血清100μg/mL):
称取牛血清蛋白25mg,加水溶解并定容至100mL,吸取上述溶液40mL,用蒸馏水稀释至100mL即可;
6.30%丙烯酰胺(Acr),1%甲叉双丙烯酰胺(Bis);、
7.10%的过硫酸铵(AP冰箱贮藏,不得超过5天);
8.N,N,N,,N'-甲基乙二胺(TEMED);
9.10%十二烷基磺酸钠SDS:
称取1gSDS,定容至10ml;
10.分离胶缓冲贮备液(0.375mol/LTris-HClpH8.8):
称取14.4gTris,HCl调pH至8.8,定容至100ml;
11.浓缩胶缓冲贮备液(0.125mol/LTris-HClpH6.8):
称取6gTris,HCl调pH=6.8,定容至60ml;
12.电极缓冲液(0.25mol/LTris,1.92mol/L甘氨酸,1%SDS,pH8.3):
称取gTris,144.134g甘氨酸,10gSDS,重蒸馏水定容至1000ml,用时稀释10倍;
13.样品溶解液(上样液):
0.5mol/LpH6.8的Tris-HCl缓冲液2.5ml,SDS500mg,β-巯基乙醇0.5ml,甘油5ml,溴酚蓝10mg,定容至50ml;
14.固定液:
50%甲醇454ml,冰醋酸46ml混匀;
15.染色液:
R2500.125g,加入上述固定液250ml,过滤后使用;
16.脱色液:
冰乙酸750ml,甲醇50ml,加水定容至1000ml。
二、器材
研钵,量瓶,移液管,试管,电泳仪一套(稳压电源,垂直电泳槽和相配套的凹槽玻璃),台式高速离心机(10000rpm),烧杯(50ml×1、25ml×1),微量进样器:
50μl×2,注射器(5ml×1),穿刺针头,胶头滴管,刻度吸(10ml×3、5ml×2、0.1ml×1),培养皿:
20ml×2(或用白瓷盘代替,染色用)等。
试验操作流程
一、毛豆的果皮和子叶样品可溶性蛋白的提取
1.将买来的新鲜毛豆清洗干净,分离出毛豆的果皮和子叶。
分别准确称取13.00g毛豆果皮、14.04g毛豆子叶于不同的研钵中,加入液氮研磨3-4次,转移置烧杯,并按样品(g):
Tris-HCl缓冲液(ml)=1:
5的比例加入预冷的提取缓冲液(Tris-HCl缓冲液,Ph7.4),静置30min。
2.将研磨匀浆的上清液转移到4支塑料离心管并编号(果皮1、果皮2、子叶1、子叶2),每支离心管提取液体积为离心管总体积的三分之二左右。
先在离心机4500r/min下离心20min,用滴管插入上清液(最上层为脂肪层)吸取上清液,并用量筒测定吸取出来的上清液的体积,将测定体积后的上清液分别转移到新的4支塑料离心管并编号,然后在离心机10000r/min条件下离心10min。
此即为毛豆的果皮和子叶样品中可溶性蛋白的提取液。
二、可溶性蛋白含量的测定
1.标准曲线的绘制
取6支试管并标号,按表2加入试剂,摇匀,向各管中加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,并放置5min左右,以0号试管为空白对照,利用分光光度计在595nm下比色测定吸光度A,并记录对应的吸光度A。
以蛋白质含量为横坐标,以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
试管编号
0
1
2
3
4
5
100μg/mL标准蛋白溶液/ml
蒸馏水
考马斯亮蓝
—
1.0
5.0
0.2
0.8
5.0
0.4
0.6
5.0
0.6
0.4
5.0
0.8
0.2
5.0
1.0
0
5.0
标准蛋白溶液浓度(μg/ml)
0
20
40
60
80
100
表2不同浓度标准蛋白溶液各试剂用量
2.样品测定
分别从两种蛋白提取液中测定其中所含蛋白的含量,因此,分别吸取先前提取的可溶性蛋白提取液1ml,加入5mL考马斯亮蓝试剂,摇匀,放置2min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线查得每种提取液中的蛋白质含量。
三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白
1.蛋白质样品的处理
分别取0.5ml植物可溶性蛋白提取液于试管中,并加入样品溶解液,1:
1混合在一起,每种样品都编上号。
2.凝胶及电泳仪的准备
安装好电泳槽后,按表3配制浓度为7.5%的分离胶,将配制好的分离胶迅速加入电泳槽的两块玻璃板的缝隙中,并加少量水进行水封,25min后凝胶聚合完成,用滤纸片吸出分离胶上层多余的水分,再按上表表格配制浓度为5%浓缩胶,将配制好的浓缩胶迅速加入电泳槽的两块玻璃板的缝隙中并插入梳子,等待凝胶聚合20min。
类别
分离胶
浓缩胶
T%
7.5
10
12
15
20
5
蒸馏水(ml)
9.7
8.1
6.7
4.7
1.5
2.92
Tri-Hcl(ml)
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
1.25
10%SDS(ml)
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.05
Acr/Bis(ml)
5.0
6.6
8.0
10.0
13.2
0.8
10%AP(μL)
100
100
100
100
100
25
TEMED(μL)
10
10
10
10
10
5
表3不同浓度分离胶各试剂用量
将制好的凝胶板夹在电泳槽上,向上下槽注入电极缓冲液,取下样品梳。
3.加样
将微量进样器分别吸取之前制好的样品溶解液,按次序插入样槽下部慢慢进样。
每槽点样10μg。
4.电泳(不连续电泳)
上槽接负极,下槽接正级,接通电源,当样品在浓缩胶时电流为40mA,进入分离胶后电流调为50mA,电泳至溴酚蓝标志到达凝胶前沿为止,停止电泳。
5、凝胶板剥离
电泳结束后,取下玻板,揭掉胶布,抽出夹条,将两块玻板置自来水龙头下,借助水流,用解剖刀柄轻轻从板侧缝间撬开玻板(注意切忌从凹槽处撬),将胶放入固定液。
6、凝胶的固定、染色和脱色
将凝胶放入染色液中染色40分钟,然后用蒸馏水冲洗附着于胶面的染料,再将凝胶浸入脱色液中脱色,更换几次脱色液进行洗脱,直到背景清晰为止。
将脱过色的凝胶照像作为实验报告的凭证。
绘制电泳分离示意图,比较分析找到有差异的蛋白条带,并可绘制标准曲线,大致确定条带蛋白质的分子量大小。
实验结果及处理
一、蛋白质含量测定
1.不同浓度蛋白质溶液吸光度测定(见表4):
试管编号
0
1
2
3
4
5
标准蛋白浓度(μg/ml)
0
20
40
60
80
100
A595nm
0
0.151
0.300
0.451
0.603
0.757
表4不同浓度标准蛋白质溶液吸光度
2.蛋白质标准曲线绘制(如图1):
图1蛋白质标准曲线
标准曲线呈线性,其中y=0.0076x-0.001;R²=0.99。
3.设定参比溶液后,毛豆的豆荚和子叶可溶性蛋白质溶液经稀释后测得其各自的吸光度,吸光度及其他实验数据如表5所示:
毛豆组织样品
子叶
豆荚
样品总质量/g
14.04
13.00
提取液总体积/ml
70.00
65.00
离心管编号
子叶1
子叶2
豆荚1
豆荚2
离心管管溶液体积/ml
5.8
5.8
7.6
7.6
稀释倍数
1:
100
1:
10
A595nm
0.489
0.482
0.196
0.187
表5毛豆的豆荚和子叶可溶性蛋白质溶液吸光度及其他实验数据
由蛋白质标准曲线绘制(如图1),查得毛豆豆荚和子叶可溶性蛋白质溶液浓度,进而计算得毛豆不同组织样品,即子叶和豆荚中可溶性蛋白质含量:
样品蛋白质含量(mg/g鲜重)=
式中c-查标准曲线所得每管蛋白质含量/mg;
V-提取液总体积/ml;a-离心管管溶液体积/ml
A595nm(子叶1)=0.489,由图1得c(子叶1)=64.34×100=6434μg/ml=6.43mg/ml;
A595nm(子叶2)=0.482,由图1得c(子叶2)=63.42×100=6342μg/ml=6.34mg/ml;
A595nm(豆荚1)=0.196,由图1得c(豆荚1)=25.80×10=258.0μg/ml=0.26mg/ml;
A595nm(豆荚2)=0.187,由图1得c(豆荚2)=24.61×10=246.1μg/ml=0.25mg/ml。
讲浓度带入公式计算可得样品蛋白质含量:
ω(子叶)=(6.43×5.8+6.34×5.8)×70.0/(5.8+5.8)/(14.04×1000)=0.0318;
ω(豆荚)=(0.26×7.6+0.25×7.6)×65.0/(7.6+7.6)/(13.00×1000)=0.00127。
故毛豆子叶及豆荚可溶性蛋白质含量如下:
毛豆组织样品
毛豆子叶
毛豆豆荚
组织中可溶性蛋白质含量
3.18%
0.13%
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白条带
由于各植株各组分所含可溶性蛋白分子量大小不详,故在老师安排下分为5组,在不同浓度梯度的凝胶中均进行各植株各组分的蛋白质多肽的分离,实验结果如下:
示意图:
<-----不同浓度的凝胶
其中1、2为本小组点样槽,即点样槽1为毛豆子叶蛋白提取液上样液,点样槽2为毛豆豆荚蛋白提取液上样液。
3-10为其他小组点样槽。
各小组照片如下:
分离胶浓度7.5%分离胶浓度10%
分离胶浓度12%分离胶浓度15%
分离胶浓度20%
实验结果讨论
1.从毛豆的可溶性蛋白含量的测量结果上看,可知毛豆的子叶组织内的可溶性蛋白含量比较多,这是由于毛豆的子叶要为以后毛豆植株生长提供营养所以富含了包括可溶性蛋白的大量营养成分,而毛豆的豆荚即果皮的可溶性蛋白相对偏少。
2.在第二天的SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳过程中,我们所得的条带中只看到电泳的长长的电泳泳道,可溶性蛋白中的多肽组分并没有很好的分离开来,以至于难以比较并找出其中的多肽组分。
分析原因如下:
1、分离胶并没有配好,凝胶的好坏直接取决于电泳的好坏,凝胶的配制浓度为7.5%,可能相对来说太低了,以至于蛋白质在凝胶电泳时跑的很快,没有明显的分离。
2、电泳时间较短。
一般电泳需要至少两个小时才会得到好的条带,而这次实验只电泳了一个小时。
3、条带不好可能与样品溶解液第一天配置好后未能及时放入4℃环境下保存而变质有关。
3.在第三天的SDS-聚丙烯酰胺凝胶不连续电泳过程中,我们做了5组分离胶浓度分别为7.5%、10%、12%、15%、20%的不同梯度用了排除分离胶浓度对可溶蛋白的分离效果产生影响,并新配置了样品溶解液,在电泳过程中严格控制电泳电压以防电泳速度过快。
5组梯度实验均在一个半小时电泳完毕最终都得到了比较清晰的电泳条带,在这5组中分离胶浓度为7.5%的凝胶中所得到的条带最为清晰,并且分离的最为明显,从而可以排除第二天所得到的分离胶浓度和电泳时间的影响因素,造成第一天电泳条带不清晰可能就为样品溶解液变质所致。
4.通过这次对毛豆的两种不同组织中可溶性蛋白的研究,我们学习到了很多实验知识以及掌握了一般研究植物蛋白的方法。
此次试验,第一,设计方案是基本,方案选取毛豆的的子叶、果皮是比较合适的,既有对比性,又具有可接受性;第二,配制试剂是关键,整个实验过程中各种溶液的以及凝胶的配制对实验的影响都是很大的,因此,需要把好每一关;第三,实验操作是决定因素,万事俱备只欠东风,因此,在操作时认真仔细有耐心,是很重要的。
参考文献:
《物化学实验原理和方法》第二版,北京大学出版社
《生物化学实验原理与技术》,化学工业出版社
《生物化学》第三版,王镜岩高等教育出版社
《分子生物学实验参考手册》,化学工业出版社
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- 关 键 词:
- 生物化学 综合 实验 报告 毛豆 蛋白质 提取 亲缘 关系 研究