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不同营养水平湖泊中小真核生物的遗传多样性1
不同营养水平湖泊中小真核生物的遗传多样性
细胞直径小于5um的小真核生物是湖泊浮游生物系统的基本组成成分。
在这篇论文中,小真核生物的多样性是由18sRNA的基因序列克隆决定的;这些小真核生物来自FranceMassifCentral不同营养水平湖泊的文库,分别是寡营养湖Godivelle,中等营养湖Pavin,以及富营养湖Aydat.分析显示多样性最小的文库是富营养化湖(12OTUs),多样性最大的是中等营养湖(26OTUs).样品数据中,某些种群至少呈现两个生态系统,而其他的则精确到一个湖泊。
隐藻门、金藻纲、严格营养真核生物、纤毛亚纲和真菌在这三个文库中都有发现。
只在两个湖泊发现的小真核生物中,领鞭虫目和自然序列(LKM11)在富营养化系统中没有发现,然而丝足虫类却局限于中度营养和富营养化的湖泊中。
与Perkinsozoa联系的3OTUs只在Aydat文库中被发现,它们克隆了文库的60%。
绿藻类和定鞭藻类呈现单拷贝形式并且分别存在于Godivelle和Pavin。
从这120个克隆体研究得出:
不管文库的起源如何,传统的有色有机体(自养生物和兼养微生物)只占有比较低的比率。
这篇论文表明小真核生物群落的构成也许会因营养水平的功能而不同;某些世系也许只能在单一生态系统中发现。
在地球上,微微型真核藻类的数量也许是最大的。
它们在所有的湖泊和海洋中都存在,密度从102到104cell/ml(8,32)。
它们是微生物食物网的基本组成成分,并且在地质化学循环(5,8,50)中扮演重要角色。
用光学显微镜简单的观察很难描绘这些有机体的特征,并且,不是所有有机体能通过培养的方法生长。
除了培养,自然生长的生物可以用来研究,通过层析法,高密度液体层析和气体层析(4,44)。
色素和/或脂肪酸分析可提供一些关于光养的和/或异养性质的浮游个体的结构和动态信息,但是通过这些方法提供系统的信息是有局限的。
在过去的十几年中,在研究微生物生态中采用分子技术使我们识别最小的水生生物尤其是原核生物的知识大大增加。
包括至少13种新的分类被编目,和某些种群,比如SAR11,被呈现是海洋浮游细菌的重要成分(21,25)。
新的不能培养的古细菌世系也被认识了(13,20)。
尽管分子技术功能强大,但是这些技术在微小真核生物上的应用还远不如原核生物广泛。
通过基因克隆和rRNA基因序列分析,最近的一些研究分析了取自不同海洋生态系统的小真核生物(<3or5)的多样性并且显示出系统发育的高度多样性(15,34,39)。
Moon-vanderStaayetal.认为各种各样的世系也许是附属于光和作用一族的(39)。
他们检索到的序列不能清楚地确定是任何已知的有机物。
Lopez-Garciaetal.完成了深入的关于南极水的研究(34),在那种被认为是不适合居住的条件下,存在许多新的世系隶属于非光和作用种群包括两种新的截然不同的蜂窝状的种群,这些代表了65%~76%被分析过的克隆体。
根据Moon-vanderStaayetal.(39)的研究,对于地中海、北大西洋和南极地带水体表面微微真核生物多样性的分析证明了光和的和异养的世系的存在。
大部分的克隆属于新的世系,包括新的原生藻菌和新的蜂窝状生物。
在此应该强调这些关于微小水生真核生物多样性的研究是在海洋生态系统中执行的。
因此,关于湖泊系统中浮游生物群落的多样性被了解的很少,尽管大量的有色有机体参与了初级产物的组成(1,51)和无色细胞通常被认为是原核和真核吃草动物的细胞。
这些有机体能够用可溶解有机物直接通过吞噬的过程。
在这篇文章中,小真核生物(0.2—5um)多样性的考察是通过克隆和序列分析三个不同营养水平(寡营养化、中等营养化和富营养化)湖泊中真核生物的rRNA。
这篇文章的主旨是决定(ⅰ)湖泊系统小真核生物的结构和(ⅱ)小真核生物群落的组成是否取决于系统的生产力。
正如我们所知,这是第一篇有关通过分子技术描述湖泊小真核生物多样性的文章。
表一不同湖泊样品的主要特征
湖泊
营养水平
坐标
最大深度m
取样日期(日、月、年)
温度℃
氧密度(mg/l)
Chla密度(ug/l)
Godivelle
寡营养
45°23′N,2°55′W
55
17/07/02
14.9
18
0.02
Pavin
中度营养
45°30′N,2°53′W
95
02/07/02
15
9.9
1.9
Aydat
富营养
45°39′N,2°59′W
15
06/08/02
25.5
7.4
12.2
原料和方法
研究位点和取材:
研究是基于三个湖泊(MassifCentral,France):
寡营养湖Godivelle(lacd’enhaut),中等营养湖Pavin,以及富营养湖Aydat(表一)。
圆形的Godivelle湖是由火山喷火口形成,海拔1239m,最大深度为44m。
Pavin湖是一座典型的火山湖,海拔1197m,最大深度为92m。
当熔岩流填塞了小河Veyre时,形成了Aydat湖,它是一个双融温湖,最大深度为15m,海拔825m(46)。
Godivelle,Pavin,Aydat三个湖中叶绿素的平均含量分别为:
<1,2,和12ug/L。
Godivelle,Pavin,Aydat三个湖中磷的平均含量分别为4,10和35P/L。
温度、溶解氧和叶绿素含量的检测日期如表一所示。
每个湖中的样品是以VanDornd瓶的富营养化标准在三个湖的最深点收集的。
湖水样品(依据湖泊从70到120ml)在非常低的真空条件下,通过孔隙为5um的聚碳酸酯预滤器预过滤,以防细胞被破坏(压强<2kp),然后在运输过程中保存在150ml的塑料瓶内至少2萧小时,直到在实验室内进行微生物收集。
单位体积内微生物的收集是在孔径为0.2um的聚碳酸酯过滤器上收集(压强<10kp),然后保存在-80℃条件下直到核酸被提取。
提取核酸:
过滤器内有TEbuffer(1*Tris和EDTA)和溶解酵素溶剂(最终浓度为250ug/ml),并且在37℃下反应30分钟。
然后加入十二烷基硫酸钠(10%)和蛋白酶K(最终浓度为100ug/ml),过滤器在37℃下至少反应60分钟。
加入CATB溶剂(最终浓度为:
在0.7MNaCl溶液中含有1%),样本在65℃下反应10分钟。
用异戊基氯仿酒精(24:
1)提取核酸;包含核酸的溶液加入苯酚-异戊基氯仿-酒精(25:
24:
1)保存和纯化。
在加入异丙醇(0.6V)后,将核酸在-20℃下沉淀12小时。
离心后,用乙醇漂洗DNA团粒并再次悬起在50ul的TEbuffer中。
DNA产量通过荧光鉴定(DNA定量设定,Sigma)技术确定,并且提取的核酸保存在-20℃下,直到用来分析。
真核生物rRNA基因文库:
真核生物18srRNA基因用特定的真核生物引物Ek-1F(CTGGTTGATCCTTGCCAG)和Ek-1520r(CYGCAGGTTCACCTAC)(33)来放大PCR合剂包括10ng模板DNA,200uM脱氧核苷三磷酸,2mMMgCl2,10pmol引物,1.5UTaqDNA聚合酶(Eurobio),含有酶的PCRbuffer。
整个体系在自动化的温度循环器(MJResearchPTC200-cycler)中进行,包括以下循环:
95下预变性5分钟;95下变性1分钟,30个循环;57下退火1分钟;72下延伸1分钟,30s;最后72下延伸10分钟。
部分PCR产物被倒掉(至少)用乙醇钠醋酸盐沉淀,再用50ul无菌水处理。
根据制造商的建议,应用TOPOTA克隆试剂盒可以把这些PCR产物用来组成每个湖泊的克隆文库。
指纹分析及rRNA测序。
来自不同文库的大约50个克隆是从不同平板中随机选取的。
用侧面载体引物(M13f和M13r)通过PCR扩增来检测18SrRNA基因位点的插入。
用限制酶HaeⅢ消化得到期待大小的扩增子,随后,将RFLP产物在2.5%琼脂糖凝胶中、60mV电压下反应3h,将产物分开。
来自相同文库的克隆形成相同的RFLP型,组合到一起,则被认为是相同的OUT。
此后,来自三个文库的OTUs通过T-RFLP分析来检测。
除了前部引物1f-FAM(6-羧基荧光素)贴了荧光示踪标签的以外,来自18sRNA的基因克隆都能通过上诉方法来放大(在序列的5’端贴上荧光染色)。
用QIAGEN来纯化PCR产物在1%琼脂糖凝胶中确定数量(DNA量化试剂盒,Sigma)。
将100ngPCR产物与20UMspI和RspI混合,在37℃下进行酶促反应整个晚上。
用圆柱形离心超滤管除去样品的盐分。
最终的限制片段在自动化程序装置中分离,并且通过基因扫描分析软件决定T-RFs的大小。
每个至少有一个克隆被选出来进行序列分析。
来自选出来的克隆的双链质粒DNA通过QIAGEN来提取。
Euk-1F和最初引物(Ek-555f[AGTCTGGTGCCAGCAGCCGC])或Ek-NSF573[CGCGGTAATTCCAGCTCCA]用来进行部分序列分析,载体引物和最初引物用来形成序列分析。
19个OUT完全被测序。
序列反应通过MWG来形成。
系统发生分析:
为了确定初级系统发生关系,每个序列都与来自国家生物信息技术中心和核糖体数据库工程的BLAST数据库序列进行比较(2,37)。
这些序列通过对准,利用ARB数据库自动排队工具形成完整的序列(36)。
所产生的直线结果通过手工方式检查和更正,考虑到rRNA分子的二级结构。
根据现有的最精确的地质树软件(ARB软件)将序列插入。
结果是树被修剪,保留关系最近的,真核生物进化的代表序列和我们的克隆体。
通过来自核糖体数据库工程Ⅱ的嵌合体和在序列DNA片段的5’和3’端执行极少的植树来检查课程嵌合的结构。
通过分析,明显的嵌合序列被丢弃。
通过纯化软件进行纯化分析,依据被Raup(43)和Tipper(55)提出的分析溶剂。
核苷酸序列达到的数目:
这篇文章决定的核苷酸序列在GenBenk中的位置是:
AY642693到AY642748。
结果和讨论
这篇文章的目标是:
通过分子技术来研究不同营养梯度湖泊中的小真核生物的分类问题。
我们分析了来自营养梯度为寡营养、中度营养、富营养的三个湖中的克隆文库。
方法方面的问题。
水5微米孔径过滤器预过滤,通过小真核细胞的标准落射荧光显微镜观察,但其分类特征往往是不可能的,这代表了湖中大部分的微生物(9,52,53)。
此外,这部分使用(0.2至5um),可以更容易地比较此与其他生态系统获得的研究结果(例如,参考15和34),也使用了同样的预过滤技术。
针对这样的分子技术符合小真核生物与在5um之内,而不是定义的微型浮游地区在严格意义上的最大大小。
众所周知,无论是水生生态系统,预过滤允许一些细胞,其名义大于孔径穿过,可导致更小的细胞保留,如果过滤器堵塞(10,15)。
像德?
ez所强调的等。
(15),该方法用于收集小真核生物是非常重要的。
染色后,使用樱草灵落射荧光显微镜(参见参考52协议),我们在未过滤和过滤的几个样本中观察到大量的小真核生物(直径,“下午5时)。
我们发现在总丰度略有下降(10至15%),但没有形态的多样性改性检查推断。
但是,这两个水过滤和DNA扩增重刑(58)可以偏差小浮游生物定性
在使用单一的限制性内切酶(16,47)生成的RFLP图谱低估了克隆库的多样性。
因此,不同的限制性片段长度多态性模式可以对应到相同的序列,或相同的限制性片段长度多态性模式可以应用到不同的OTUs。
为了限制这种偏见,我们也使用T多态性分析,这是一种高复制的强大的技术,能够产生由准确大小的片段组成的指纹序列(16,47)。
因此,在某些罕见的情况下(3),一些克隆(A54和P1.31,P1.25和PG5.34和P34.10和PG5.31),具有相同的RFLP图谱却显示不同的T-RFLP技术概况。
此外,由于没有类似的序列,这些被认为是不同的。
每个库的分析突出12(富营养化湖泊),18(贫营养湖泊)和26(oligomesotrophic湖)不同的分类单元。
没有分类单元发生在所有三个湖(见表2)。
从Aydat湖克隆获得的稀疏的多样性曲线与Pavin湖相比是一个较低水平,而从Godivelle湖获得曲线却达到了一个高峰。
更具体的说,从艾达湖获得的克隆库的曲线清楚地表明它的饱和的多样性,在这种情况下,我们能够推断出,在研究期间该库肯定地代表了小真核浮游生物的组成。
然而pavin湖仅仅代表的是最丰富的克隆度,因此在oligomesotrophic湖(pavin湖)观察到了最高的多样性。
更确切地说,某些群体已出现在至少两个生态系统,而其他一些具体的抽样日期一湖(表2,图。
2)。
至少在目前的两个湖泊宗族,隐藻由三个克隆库的分类单元呈现,主要是从贫澡(三分类单元起源分类单元)和oligome-sotrophic(7个分类单元)生态系统。
这些分类单元组成了三个明显不同分支(G5.11,P1.27,P1.30和P34.3,A54,P1.31,P1.25,并PG5.34;P34.10和PG5.31)(图。
2)。
这个世系中最小的一小部分存在浮游生物符合先前的研究结果,这些结果一是从lacustrine生态系统中获得,二是从对地理区域的湖泊研究中获得的,其中隐藻是主要的色素生物。
金藻纲,其中包括自养,混合营养和异养生物分类(3,23),主要由三个库10个分类单元(答34,A43号,格A1,P1.35,PG5.22,A42,P34.48,P34.45,P34.28,并PG5.3)呈现。
更具体地说:
一方面,序列格A1,P1.35,以及A42;另一方面,序列P34.28和PG5.3多于严格的异养鞭毛虫相关:
Paraphysomonas和Oikomonas。
A43号和A34属于一个混合营养鞭毛虫Poterioochromonas属。
这3个属属于一个由消费型生物或者至少具有吞噬作用生物组成的类群。
一方面克隆P34.45和PG5.22与克隆G5.2有不同,另一方面在Stramenopiles具有的特殊地位(图2)。
他们有强烈的异品种相似,但没有明确在与已知生物有关的分支。
最初的Stramenopiles包括有其演变过程中获得(31)叶绿体异养生物。
在我们的分析,克隆G5.2在获得叶绿体之前是明确定位在进化树。
因此,在Stramenopiles,我们确定了两个序列的纯粹宗族相关:
克隆G5.2,有关Hyphochytrio菌纲,与克隆P34.6,在Bicosoecida家族列入低相似Cafeteriaroenbergensis(88%)。
在严格的异养小真核生物,虫和真菌都确定了三个克隆库。
六分之三的在6个分类单元虫与宗族有尖毛虫属最高的相似性,现已在由德?
ez等picoplanktonic确定海洋环境的一小部分。
(15)。
除了一种分类单元(A44)的鉴定,真菌被鉴定为的贫营养和营养型湖泊两种类型(PG5.12,P34.43,P34.27,P1.36,G5.10,和G5.16)。
这些分类单元是隶属于作为著名产壶菌寄生,血缘,例如,绿藻(35)和硅藻(6湖泊生态系统)。
这些生态系统的真菌可以参加由寄生在调节浮游生物种群。
其中小真核生物只存在于两个湖泊,领鞭毛目和环境序列(LKM11)没有在富营养化系统发现,而Cercozoa仍局限于oligomesotrophic和富营养化湖泊。
其中宗族,Cercozoa具有最高的多样性(6个分类单元),并在一个序列外,这些分类单元并不密切相关,在数据库中(88%)(表2)任何。
该Cercozoa是一个复杂的真核生物组,包括不同的生物种类繁多,包括众所周知的最丰富的非光合阿米巴一些,鞭毛虫和纤溶酶modiophorid植物病原体。
Cercozoa的形态,生态逻辑和遗传多样性的是巨大的(27),他们在许多不同的环境中存在(47)。
在我们的克隆库,六分之五分类单元隶属于Cercomonas属,它们的相似度平均低87%。
这些细胞,在土壤的所有种属中非常常见。
(4至10um),各种常见的是高代谢具有较强变形虫属性各种常见的是高代谢具有较强变形虫属性。
第二cercozoan属隶属于Heteromita藻(pavin湖克隆库的一个分类单元),其球状细胞大约4至6um长(18)。
其中分支LKM11,分组序列G5.3,P34.42,PG5.28和P34.11,在进化树显然是有区别。
而同时它与真菌有关这些序列,首先定义由VanHannen等人的研究。
(56),附属于一个湖泊生态系统采取noncultivable真核生物。
蓝藻(56),可以参加的碎屑在贫营养和oligomesotrophic系统分解。
宗族特有的湖。
一些类群似乎是专门针对生态系统研究。
因此,三个分类单元,关系到Perkinsozoa,其中包括帕金虫和Parvilucifera(41),仅在艾达湖的克隆库(A31号,甲48,和A20)新发现的海洋寄生虫门。
他们代表约60%的艾达库,并与(86至90%)帕金虫的成员属具有较低相似度。
这一结果在藻类作用研究期间,提高了小真核生物控制作用的可能性!
其中色素生物,Haptophyta,Dinoflagellata,绿藻被发现仅在一个生态系统。
与Haptophyta相关的序列强烈隶属于属Chrysochromulina(见表2),1phagotrophicphytoflagellate(29)。
三分类单元(G5.7,PG5.8和G5.1)从Godivelle库(贫)是与Dinoflagellata,其中包括自养和异养生物分类,其下属的演变,可能与(28)第三共生,更特别是与自养鞭毛虫Gymnodiniales和Prorocentrales。
他们在这浮游分数检测可能是由于过滤问题或其他身份不明的小Dinoflagellata存在。
相似水平低计算(93和94%的已知Dinoflagellata以及这些鞭毛虫已在海洋生态系统的picoplanktonic分数确定由同一事实分子技术)(15,39)可以确认在这方面存在的最小的一小部分潜在的新的属于这个家族基因型。
小真核细胞中的多样性与营养状况。
在克隆系统位置,使是否是有机体,色素沉着或无色作出的假设(见表3)(3,14,15,29)。
所有三个湖库中,我们发现30克隆被认为是色素沉着(自养或混合营养),而94克隆隶属于异谱系(见表3)(2分类单元P34.45和PG5.22属于Stramenopiles宗族属异已列为不确定)。
无论什么样的克隆库,作为异分类克隆超过60%克隆被研究。
这种异养生物占很大比例的结果与落射荧光显微镜计算一致,这表明色素的生物一般只在该地区湖泊小真核细胞占很低的比例(9,52,53)。
从它可以看出,绿藻门只是Godivelle库的一个例子,它含有一个代表序列,而且这个家族被誉为海洋和湖泊生态系统普遍代表(26)。
脂肪酸分析Godivelle和Pavin湖的0.2至5um数据表明,绿藻可能在未公布的数据贫营养湖泊存在。
抽样期间,对这个家族进行DNA提取和扩增的具体研究,可以解释比例低的原因。
珠殴打或冻结使用冻融循环(48)能提高DNA提取。
然而,这些方法上的考虑可能不足以解释这项研究取得的成果,在海洋环境中进行绿藻属许多序列使用类似的提取和扩增检测技术的。
(15,39)。
有些种族存在于所有生态系统。
但是,这项研究表明,不同湖泊之间的小真核生物社群的多样性各异,某些种群目前只存在于特定的湖泊中,而不存在于其他湖泊中。
例如,Perkinsozoa被发现仅在于艾达库,而Cercozoa从未发现在于Godivelle湖。
另一个必须考虑到的因素是克隆的相对重要性。
因此,Godivelle库主要由真菌(31%的克隆)而艾达库由Perkinsozoa(60%)组成。
很难通过简单的光学显微镜观察这些微生物特点,并且这些差异并不总是被察觉。
例如,Poterioochromonas,这是一个loricae鞭毛,往往很难确定,因为loricae是不起眼的百万分之一拷贝的光。
细胞也可以摆脱其loricae,然后会从Ochromonas属区分(14,17)。
Paraphysomonas的特点是在细胞表面有硅质鳞片,但这些结构不是轻易可以被用光学显微镜观察到(7)。
因此,发现一些类群具有一定形态的相似性,然而不能确认。
然而,正如在海洋环境中进行的大多数研究使用克隆测序技术(15,34,38,39,60),从一个点收集的单日单样本获得了这些数据,因此,没有考虑到季节变化(9,52,53)。
此外,根据芬利(19),自由生活真核细胞微生物,如纤毛虫,很可能有足够丰富的世界范围内的分布。
这种观点,例如,预计到真核如子囊菌纲将被证明是几乎在全球范围分布,而这些生物的分布,往往表现出一定的地域差异(22)。
另一方面,最近的报告表明,有限的分散也有可能对某些原核生物(59)。
最后,根据科尔曼(12),芬利的假设是可以接受的,唯一针对海洋原生生物,它不太可能适用于淡水真核微生物。
许多研究也表明,自由生活的真核细胞微生物的数量构成,如藻类和纤毛虫,因有关的营养状况而存在差异(29,45)。
因此,湖泊的小真核生物群落组成的变化可部分解释这一因素,这是有可能的。
分类单元的分置可能与在水环境中的藻类,属于嗜纤维菌-黄杆菌-拟杆菌群(24)的细菌,以及其他生物体分布确定有关。
因此,有可能在试验条件下表明,藻类多样性遵循驼背沿富营养化形成梯度发展,并且这个过程形成于竞争,捕食,营养资源的获取和许多其它生态过程(30,54)之间的妥协。
小真核生物的生长发育可以被贫营养环境中的养分资源和富营养化环境中的捕食和竞争所限制。
由于海洋环境中(57),在最小的浮游分数时,异养生物的多样性(35分类单元)可能比自养生物(19分类单元)要高(表3)。
更具体地说,通过对克隆库进行独立的研究,可以看出,无色素分类单元和色素分类单元之间比例的增加与营养状况有关,并在富营养化生态系统中达到最高水平。
然而,后面的生态系统不同于其他两个,由于它较低的多样性和受Perkinsozoa强烈的控制。
在一定程度上,通过Vaulot等描述(57),这种趋势似乎是同一类型的,他们表明,这个比率在沿海环境高于海洋环境。
一般来说,这个研究表明,在这些生态系统的克隆往往形成特定的分支,即使相关的明确界定的亲缘组;而且,有许多相似之处仍然低于90%。
这个毫无疑问的结果来自这样的事实:
尽管其生态学的重要性,一些研究已经处理水生生态系统中的小真核生物或真核超微型浮游生物,并且因此得到,很少有18SrRNA基因序列可用。
为数不多的研究结果,如确实存在于涉及到上层海洋环境和非常具体的海洋环境如热液沉积物的海洋(33)。
在这项研究的克隆没有关联到新的囊泡虫类(第一和第二组)(40)或Stramenopiles(15)种族。
金藻纲似乎主宰后者分支,它们是一个重要的和无处不在的淡水环境中浮游生物的组成部分。
不过,他们很少在海洋环境占优势。
还应该指出,在这项研究中,于海洋环境研究形成对比,硅藻不存在于这个浮游分数(0.2至5um)。
这些结果与显微镜计数(极少用来检测小硅藻比如研究湖泊中的小环藻属)获得的结果达成一致。
克隆属于真菌的也占相当大的比例,但这些并没有被发现或只占海洋克隆库的比例很低(15,34)。
这项研究表明,与其他浮游社群一样,通过分子技术对湖泊生态系统的描述,小真核生物通常会与海洋系统产生一些分歧,并作为营养级的功能有所不同。
另一方面,系统发育的决定强调了原始分支类群的存在,如富营养化湖泊中的Perkinsozoa或另外两个湖泊中的壶菌类。
潜在的寄生生物的丰度可能在控制水生系统的原生生物种群动态变化中起着重要作用。
然而,它们的数量和功能的重要性还有待确定。
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- 不同 营养 水平 湖泊 中小 生物 遗传 多样性