关于在油层内培养厌氧性细菌以增进石油回收的基础性研究一.docx

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关于在油层内培养厌氧性细菌以增进石油回收的基础性研究一

关于在油层内培养厌氧性细菌以增进石油回收的基础性研究

（一）

──使用砂体组件的MEOR评价实验──

王立群译

米林英治洪承文木下睦夏本兵治千田佶

摘要：

在本报告内，首次讨论了增进回收实验中厌氧菌增进回收能力的定量评价技术，并提出了以该技术为基础的溢流实验结果。

在上一次报告中，通过研究确认了有效的厌氧菌之一—9A型菌，并在培养基中培养以研究其生长过程中煤油对它的影响。

结果证明，煤油本身对细菌的增殖和代谢没有影响。

溢流实验装置包括由充填在丙稀管中的硅质砂组成的砂体组件、注入泵和压力测量工具。

本报告对评价方法作了如下详细说明：

（1）、制做砂体组件

（2）、水渗透率的测定

（3）、将煤油注入砂体组件

（4）、水驱回收实验

（5）、把菌注入砂体组件

（6）、培养

（7）、注水回收残余油

采用9种菌进行这种方法的溢流实验，在所有的实验中都有油的增进回收，尤其是最大量的油回收由9A型菌获得，增进回收量相当于30%的残余油。

关键词：

MEOR，溢流实验，培养，回收。

1、前言

利用微生物的原油增进回收技术（MEOR），即便实在近年来油价低迷的状况下从经济学

的角度上看也应该给予高度注目且已经得到了注意。

作为有希望的方法，这种研究一直持续进行着。

但是，有关微生物的增殖、代谢机理因细菌的差异而有很多不同之处，并且，关于他们在油层中的作用机理也很难说得到了充分的认识。

为此得到基础性认识的必要性依然存在。

另外，探索和发现油回收能力更高的微生物也是永远的命题。

本研究是以探索、收集对MEOR有用的厌氧性细菌及确定他们的有用性评价方法为目的的。

在大上一次报告中，报导了以在自然界中采集的菌为对象，评价其性能和得到有用菌的鉴别方法研究及由该方法得到6种集成培养菌且从这6种集成培养菌中得到10中分离菌的情况。

此外，在上一次报告中，在探讨把上述细菌放入微小的孔隙环境（不含油的硅质砂充填层）中，以进行培养实验，这种微小的孔隙环境使微生物的增殖受到影响的同时，评价了这些菌的性能。

在本报告中，以有用微生物增油能力的定量评价方法的确定为目的。

首先，用存在油的微小孔隙环境下的增殖实验来探讨共存油的影响并连续地向含微生物的砂体组件中注入油以测定其在孔隙内的展开情况，还设定了溢流（flooding）实验的顺序及初始条件。

其次，以这种实验方法为基础，根据以前的研究结果对数种被认为有用的菌进行了实际情况下可回收多少油的实验性研究，同时根据这些结果对不存在油的情况下用玻璃瓶的简易性能实验的有效性进行了研究。

2、在含油情况下的增殖研究

2．1、概述

到上一次报告所涉及的研究为止，叙述的玻璃瓶培养实验和评价实验都是不存在油的。

所以在本次的溢流实验中，作为供实验的细菌，是在油存在情况下重新培养的。

因此首先进行了关于存在油情况下的微生物增殖实验研究。

油层中使用的是煤油，且在油层内存在首轮状饱和状态、孤岛状饱和状态极其中间的过度状态这三种情况下进行培养实验，并进行了细菌浓度、气压随时间变化测定和气体组成的分析。

此外，本实验所用的菌体，是在以往的研究中认为效果好的9A型菌。

2．2、实验装置及方法

本实验使用了小型的砂体组件。

该组件的基本结构与上一次报告使用的相同。

但是丙稀管的尺寸是内径40mm，外径50mm,长度130mm，充填层部分的长度是100mm。

实验顺序及方法如下：

1）、在丙稀管内计量经过灭菌处理的I培养基，预先将先前培养的菌体悬浊液调制成目标初始菌体浓度，接种后制成均一悬浊液。

2）、充填硅质砂。

在充填时，时刻敲击管子以使其均匀且塞得致密。

然后在充填结束时，由注入管的培养基体积和充填层容积求砂层的孔隙度。

3）、接着，注入2.0pv（孔隙溶剂porevolume）以上的煤油。

此处使用的煤油是一般的市场销售品，没有经过灭菌处理。

然后，注入经过灭菌处理的培养基以回收煤油，调整目标含油饱和度。

由于注入了灭菌处理的培养基而使菌体浓度最大降低了数分之一，但因没有引起位数变化，所以其影响是比较小的。

4）、以30°C的温度培养数天后，将砂体组件内的砂层照原样抽出，在偏靠注入端和产出端两侧各自一厘米以内的部分及靠近中心的部分，使用经火焰灭菌处理的药钳取硅质砂3.0g,用灭菌处理的水稀释成悬浊液，进行菌体浓度的测量。

此处得到的菌体浓度乘以在大上一次报告中求得的修正系数，即作为真值。

此处，I培养基具有如下组成：

糖浆；40.0g

细菌培养基（bouillon）：

8.0g

蒸馏水：

1000ml。

在I培养基中添加以下无机盐类后，称为Ⅱ培养基。

NH4NO32.5g

KH2PO41.0g

K2HPO40.5g

MgSO4·7H2O0.5g

MnCL2·4H2O0.2g

NaCL2.0g

2.3、样品

本实验用于制作模拟油层的砂是川铁矿业有限公司枥木矿业所生产的硅质砂（壳型模塑用7号），其平均粒径是110μm。

在粒度分布及化学组成方面，请参考其他报告。

在一般情况下，对菌体来说低分子量的碳氢化合物的影响较大，所以作为容易显现其影响的油，使用了低分子量的且是脂肪族和芳香族碳氢化合物的混合物的市场销售煤油。

这并不是考虑要适应特定的油层，而是为了便于查看细菌的一般性质，并且，如果使用无色透明的煤油，则对使用显微镜的菌体浓度的测定，就不至于带来障碍。

2．4、结果及考察

表1油饱和度对9A型菌增殖的影响

No.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

充填层容积[ml]

129

134

126

134

133

126

134

134

132

孔隙度[%]

37

37

38

38

38

38

37

37

36

油饱和度[%]

79

84

77

50

55

52

20

26

25

初始菌体浓度logC[cells/ml]

5.5

4.9

空白

NT

NT

空白

4.9

4.9

空白

培养时间（days）

11

4

14

12

8

15

4

7

15

菌体浓度logC[cells/ml]

注入端

7.6

6.9

ND

6.8

7.3

ND

7.9

8.1

ND

中心部

7.4

6.8

ND

6.9

7.6

ND

6.9

7.5

ND

产出端

7.2

7.1

ND

6.8

8.2

ND

8.7

7.6

ND

把砂体组件的初始条件及实验结果用表1表示。

因考虑到再现性，对应相同条件，制作了两个砂体组件。

同时，也各制作和培养了一个空白（blank）样品,在blank样品中，因不能确认菌的增殖，所以判断没有杂质细菌的混入。

从这些结果中，明确了即使煤油存在，细菌也能充分地增殖。

对9A型细菌的增殖，油的存在并不给予影响。

特别地，明确了微生物在油层内的水相近于束缚水饱和度这样的恶劣生存环境中也能充分地增殖。

若考察培养后的细菌浓度，在砂体组件中，特定地方的菌体浓度经常很高或很低的倾向不能被确认，由此判断砂体组件内的油饱和度不存在具有一定倾向的不均一性。

只有NO.7，中心部分的菌体浓度特别地，究其原因，从在两端测量到高的菌体浓度这一现象出发，认为是因硅质砂在充填时粒度的不均一充填形成的。

其次，在三种油饱和度组（group）中,比较油饱和度的影响时，在NO.1——NO.2及NO.4——NO.5（高的油饱和度）和NO.7——NO.8（低的油饱和度）有最大约80倍的差值（6.8——8.7[logccell/ml]）,且同一条件的砂体组件之间也存在着这种程度的差异。

从以上两种差异来考虑油饱和度的影响，认为砂体组件中的硅质砂充填的不均一程度及初始菌体浓度和培养时间的差异造成实验误差是比较恰当的原因。

所以，判断不存在油饱和度对菌体浓度的直接影响。

以下，用图1表示生成气体的压力随时间变化，用表2表示气体组成分析结果。

表2气体分析结果

No.

2

5

8

油饱和度[%]

84

55

26

生成气量[ml]

7

NT

40

CO2[%]

19.1

52.4

50.2

N2[%]

21.2

7.1

4.2

H2[%]

59.7

40.5

45.6

合计[%]

100

100

100

在随时间变化曲线上，可以发现不同油饱和度组的压力上升时间、上升斜率及最高压力方面存在差异。

油饱和度高的比低的诱导时间长，其原因是高饱和度环境对微生物的生存是严酷的，又因为先前培养是在油不存在的环境下进行的，所以，微生物在存在油的环境下的适应需要时间。

这正如上一次报告所说的：

在微小孔隙内的增殖实验，微生物对环境的适应需要时间。

油饱和度是20%时，压力曲线的斜率及最高压力最大，这是因为菌体得以存在的培养基的量较多，即因为菌体的绝对量多，所以生成气的增加速度及总生成量也多。

此外，在达到最高压力后，压力缓慢下降，这是作为气体主要成分之一的CO2溶解到液相之中所造成的。

若分析气体的组成，，被检测出的是CO2、N2和H2三种成分，这些气体是在利用培养基中的各种有机物质的微生物的能量代谢中生成的。

认为CO2和H2是与糖的分解有关的各种发肖作用的生成物，N2是由氨基酸的分解而产生的。

若考察油饱和度使气体组成受到的影响，则油饱和度在26%和59%时没有发现显著的变化，而饱和度在84%的时候，CO2减少，相对地N2和H2增多。

这种各成分代谢量的变化原因被认为是气体的生成量变少，相对地CO2溶解于液相的比率增加，而生存环境中的油占有体积的大小对代谢机理给予影响的可能性较小。

从以上事实中，明确了油的饱和度不直接影响9A型细菌的增殖机理和代谢机理。

但是，饱和度影响气体的生成量，因此而推测的代谢产物的量等也不相同，所以。

在实际的MEOR实施时，，在饱和度具有很大差异的情况下，有时其影响也被反映到增进回收量及增进回收率上。

3、使用砂体组件的溢流评价法之研究

3．1、概述

在液体培养系统内的微生物性能实验中，即使有效的机能得到了确认，在实际进行溢流实验时，能够谋求到多大程度的回收率，也还是不明确的。

此外，油的饱和状态使微生物的增殖和代谢受到直接影响的可能性也不能完全地否定。

加之，认识实际油层内的菌的动态，在技术上和经济上都伴有许多的困难，所以，有必要对采菌的MEOR的适应性室内研究之最后阶段进行评价。

再者，若了解了上一次报告中说明的玻璃管的培养结果与油回收实验结果之间的关系，则使用简易实验的菌的评价就变得具有更重要的意义了。

在此，首先叙述溢流实验方法的设定。

3．2、实验装置

在溢流实验中使用了砂体组件（参阅图2）。

本实验，在内径60mm。

外径70mm,长度530mm的丙稀管内充填与前述相同的硅质砂（平均粒径是110mm）,把这个称为油层。

用丙稀做管子的材料，是为了使观察内部成为可能。

作为油层内部的砂层是500mm.在管子的两端安有橡胶栓，把它用板压住后再用长螺丝固定。

在橡胶栓内部贯通两根1/4″的金属管，由此，使得用泵注入培养液等、油水的排除及压力测定成为可能。

在橡胶栓的内侧安装金属网状物，以防止管内侧的硅质砂的流出。

再者，在金属管上连接软管，在培养时用弹簧夹夹住使其密封。

3．3、实验方法

实验的顺序如下设置。

以下在没有特别记述的地方表示不进行灭菌操作。

1）、硅质砂充填

在丙稀管内计量、装入经过脱气处理的水，在其中充填硅质砂。

此时，为了使硅质砂充填得均一、严密，使用震动器对丙稀管施加震动，并用塑料锤从四面敲击管子。

而后，在硅质砂充填结束时，使用注入管内的水的体积和管子的容积求出砂层的孔隙度。

2）、水的渗透率测定

制作砂层的水的渗透率测定，是以固定流量实验进行且用达西定律计算的。

流速设定在

（1）式成立的末端效应（endeffect）不出现的范围内，测定满足式

（2），即在达西定律成立的粘性流动区域内，且使流速在数个阶段内变化。

Lvμw>1

（1）

VPwd/（μwφ）<1

（2）

此处，L：

油层的长度[cm]

v:

流速[cm/min]

μw:

水的年度[cp]

d:

砂粒的平均粒径[cm]

φ:

孔隙度[-]

3）、注入油

在水的渗透率测定完成以后，给砂体组件注入油。

这种操作一直进行到管内在没有水流出为止。

此时，由于油的注入而流出的水量是置换油层内水的油量，该油量称为初始油量，此时的油饱和度为初始油饱和度。

4）、注水后的回收

用以上顺序向砂体组件中注入脱气水以回收油（水驱回收实验）。

注入流速是6.0ml/min，注入量是6.0PV以上。

产出的油用量筒按时收集。

5）、菌的注入

把经过调整初始菌体浓度的菌体悬浊液2.0pv注入砂体组件之中。

此时，为了压制残余油的流动，设定的培养基注入压力不超过水驱回收实验时的压力。

在本实验中，由于注入流速是一定的，且培养基和水的黏度分别为1.2cp和1.0cp，所以，使流量降低了20%。

为了缩短或省略诱导期，注入的菌体是经过先前培养的。

所谓先前培养是从保存的培养基中向本培养实验使用的同种培养基内植入菌体，把进入对数增殖期的菌体作为接种菌的方法，菌体浓度的调整在即将注入时进行。

另外，作为比较的对象，也要准备不注入菌的空白样品（blank）。

6）、培养

将注入菌体的砂体组件在一定温度下（本实验是30°C）的恒温环境下静止培养。

7）、增进回收实验

在设置的培养期过去后，在一次注入水以进行增进回收实验。

顺序等同于在4）项中叙述的方法。

在培养中产生的气体用水上置换来收集，在测定了生成量以后，进行气体的色层分离谱分析。

对被回收的培养液，进行菌体浓度、PH值、界面张力（对n——辛烷）的测定。

此外，水驱回收实验和增进回收实验都在室温（20°C）进行。

3．4、关于菌体悬浊液注入的探讨

表3砂体组件的初始条件和培养基注入条件

充填层容积[ml]

1370

孔隙容积[ml]

520

孔隙度[%]

38

水渗透率[darcy]

3.2

初始油量[ml]

430

初始油饱和度[ml]

83

水注入流量（平均）[ml/min]

6.6

水注入量[pv]

6.1

油回收率[%]

70

实验菌

9A

培养基

I

培养基菌体浓度logC[cells/ml]

5.4

培养基注入流量[ml/min]

2.7

在上一节设定的实验方法中，有关菌体注入方面，以下叙述的问题有必要加以讨论。

其一为注入微生物是否是不被持久地充满、全部被注入到砂体组件内。

其二是为了认识基础特性，有必要在油层内均匀地注入菌体，为达此目的的菌体悬浊液所需的最小注入量是多少。

所以，按照上一节所设定的顺序，进行与溢流实验相同的操作，在注入菌体悬浊液时，随时测量从

产出端排出的液体的菌体浓度以掌握菌体的注入状况。

本实验使用以前沿用下来的属于大种类的9A型菌和I培养基，且使用煤油。

水驱时的注入流速是6.0ml/min，注入菌体悬浊液的初始菌量调整到了105数量级（单位：

cells/ml）。

把砂体组件的初始条件和培养基的注入条件用表3表示，其结果用图3表示。

图中虚线表示注入菌体悬浊液的初始浓度。

由该图，在注入量达到1.0pv以前，排除液体中出现菌体，注入量达到1.6pv以后，排出液的菌体浓度近与初始调整浓度且恒定下来。

由这一事实出发，本实验没有发生持久充满现象，且判断出注入量是1.6pv时，菌被充分、均匀地注入。

这一结果，使我们充分地认识到：

对培养基所需的最小注入量是1.6pv，但是，在本实验中，为了更确切地进行均匀注入，决定以2.0pv来注入。

4、使用砂体组件的溢流评价实验

从以上叙述的结果中，推测到油饱和度对菌体增殖的影响，当该值在50%以下时，影响较小，且明确了不存在菌体悬浊液注入的持久充满问题，所以，按设定的实验顺序进行溢流实验，并评价微生物的MEOR能力。

在本实验中，根据以前的研究结果，使用在微小孔隙内显示良好的或特征性的增殖的9种细菌及相应的具有良好增殖的培养基一起进行培养，且培养温度是30°C。

把溢流的初始条件等用表4表示，而增进回收实验的结果用表5表示。

4．1、初始条件的探讨

各砂体组件的初始条件是否齐全，对比较研究来说是非常重要的。

由表4，孔隙度在37%前后，硅质砂充填进行得大致相同。

但是，却发现绝对渗透率值在2.3——3.5darcy之间，显得没有规律，暗示着硅质砂的充填率即使相同，其在充填方式上也产生差异。

但是，初始油饱和度是大致相同的，且除No.9和No.10以外，注入后的油回收率也大致是一定的，所以，在以后的增进回收实验中，各砂体组件对实验结果带来影响而产生的差异不存在，可分析为大致处于相同的条件。

表4溢流实验的初始条件和水驱回收实验的结果

砂体

组件

号

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

充填层容积[ml]

1390

1390

1410

1390

1390

1410

1390

1400

1380

1390

孔隙容积

[ml]

525

515

515

520

510

510

520

510

527

515

孔隙

度

[%]

38

37

37

37

37

36

37

36

38

37

水渗

透率

darcy

2.9

2.7

3.1

2.8

2.3

3.5

3.1

3.0

2.6

2.7

初始

油量

[ml]

430

430

425

430

425

440

425

440

411

415

初始油饱和度

[%]

82

83

83

83

83

86

82

86

78

81

注入水流量

5.8

6.2

5.8

5.9

5.9

5.8

6.0

5.9

5.0

2.3

注水量[pv]

5.8

6.5

6.0

6.1

6.2

6.5

8.0

7.3

5.3

7.3

油回收率

[%]

67

67

68

66

68

68

67

68

74

73

表5增进回收实验结果

砂体组件号No.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

实验菌

3H-1

3H

4D

7A-1

7A-2

7A-4

7A

8L

9A

空白

培养基

Ⅱ

Ⅱ

I

I

I

I

I

I

I

I

培养基菌体浓度

[cells/ml]

4.5

4.5

4.7

4.4

4.4

NT

4.8

4.9

6.3

-

培养时间[days]

7

7

10

10

12

9

10

10

21

61

生成气量[ml]

>500

>120

280

>240

>430

>780

>170

25

NT

0

注水流量

[ml/min]

4.9

5.2

5.6

4.9

5.9

5.6

4.7

5.5

5.0

2.8

注水量[pv]

5.6

5.7

6.2

5.7

6.9

5.9

5.9

6.5

5.8

1.9

回收

流体

菌体浓度

[cells/ml]

7.3

8.4

7.2

7.4

6.4

6.9

7.3

7.1

NT

ND

界面张力

[Mn/m]

14.0

9.5

11.2

24.2

12.6

24.4

13.1

12.5

NT

NT

PH

5.2

5.4

5.3

5.4

5.1

5.2

5.2

4.3

6.0

5.9

增进回收率

初始油[%]

9.3

7.9

2.1

6.0

6.8

3.2

3.1

1.1

7.8

0.0

水驱回收

残余油[%]

28.6

24.3

6.9

17.9

21.0

9.9

9.3

3.5

30.1

0.0

4．2、增进回收实验结果的探讨

在供实验的9种菌中，3H菌和7A菌是没有进行分离操作的两种菌。

除blank以外，所有的菌都有气体产生，且在回收液体中可确认菌体的存在。

在采集气体时，培养基也同时被排出而没有发现油产生。

特别是对气体生成量多的实验，开放产出端，在使其与大气压相通后，观察内部，则可以发现在砂体组件的长度方向上气体和水的饱和度以各自高的部分形成层状条纹。

这一现象的原因认为是在硅质砂充填时，因砂的粒度茶而产生沉降速度的不同，由此形成粗粒部分和细粒部分而产生不均一性，开放的气体积存在较多粗粒硅质砂上，就形成了层状条纹图案。

另外，No.1和No.5这两个砂体组件，软管没有耐住生成气压力产生的负荷，分别在培养后的第四天和第五天发生了泄露，所以，实际的气体生成量比记载的测量值要多得多。

表6气分析结果

砂体组件号No.

1

2

3

4

5

6

7

8

CO2[%]

47.3

36.5

76.9

66.2

52.2

70.0

50.6

85.8

N2[%]

0.0

2.4

0.6

3.5

0.8

1.0

2.8

13.3

H2[%]

52.7

61.1

22.5

30.3

47.0

29.0

46.6

0.9

合计[%]

100

100

100

100

100

100

100

100

把生成气的气体色层分离谱分析结果用表6表示，其主要成分是CO2和H2。

然而，除了3H-1菌以外，其他的样品甚至检测出微量的N2，这种N2可认为是分解糖浆中的氮元素而产生的（分析结果请参阅大上一次报告）。

对No.9,记录了气压的随时间变化，并把他们用图4表示。

压力变化动态与图1相同，可看到极短的诱导期部分，达到最高压力之后，缓慢地下降，而当培养时间超过80小时之后，压力又再次转向上升。

这是因为气体向液相之中的溶解迅速进行，一旦压力下降，且远离饱和状态，气体的生成量超过溶解量的缘故。

产出液体中的菌体浓度因砂体组件的不同产生最大100倍的差值，而界面张力只要按顺序比较，没有多大的差别，且没有显示出明显的界面活性物质的产生。

培养液的初始PH值是5.6，显示明显降低的只有No.8，暗示产生了某些酸性物质。

除此之外，几乎没有发现什么变化。

但是，除blank以外的砂体组件，或多或少都发现了油的产出，对应初始油量的增进回收率达到从1.0%到最高的9.3%。

若将此换算成对应的残余油量的增进回收率，则最高值为9A型菌，其增进回收率为30%。

此外，对分离菌和集合培养菌，或许是由于竞争的关系，分离菌具有良好的结果。

对于谋求增进回收的主要因素，在增殖、界面活性物质的生成、酸性物质的代谢以及气体的生成之中，哪一个因素较大地贡献于增进回收呢？

这要考虑多数原因的相互关联。

由此，进行了其他途径的实验，即在砂体组件内，注入表面活性剂水溶液后，再注入气体是其产生气泡，观察注入水实验的结果，发现注入水的前端是极均匀地推进的，没有发现指状分布。

对本实验的注入水前端推进情况的观察，显现出实现了大致均等的注入，没有发现界面张力的显著下降，相反地，界面张力若在所有的场合下都有所下降，则可以认为生成的气体在孔隙中形成了气泡，可谋求置换效率的改善。

4．3、与使用玻璃瓶的培养结果的对比

对比在大上一次报告和上一次报告中研究过的用玻璃瓶在微小孔隙内的培养实验与存在油的砂体组件的培养实验的结果，把回收液的菌体浓度、PH值以及界面张力的对比用表7表示。

在这两种