不同浓度钙处理对紫苏生理生化的影响.docx

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不同浓度钙处理对紫苏生理生化的影响

不同浓度钙处理对紫苏生理生化的影响

目录

中文摘要1

英文摘要（Abstract）2

1前言3

1.1紫苏介绍3

1.2研究目的及意义3

1.2.1实验目的3

1.2.2实验意义3

1.3国内外研究进展4

1.3.1紫苏的开发价值的研究4

1.3.2紫苏的化学成分和药理作用的研究4

2材料与方法5

2.1实验材料5

2.2实验用品及仪器5

2.2.1实验药品5

2.2.2实验仪器5

2.3实验方案设计5

2.3.1生理指标的选择5

2.3.2实验方法的选择5

2.4实验原理6

2.4.1叶绿素含量的测定原理6

2.4.2游离脯氨酸含量的测定原理6

2.4.3丙二醛含量的测定原理6

2.4.4可溶性糖含量的测定原理7

2.5实验方法7

2.5.1材料处理7

2.5.2测验项目7

2.5.3叶绿素含量的测定7

2.5.4脯氨酸含量的测定8

2.5.5丙二醛含量的测定8

2.5.6可溶性糖含量的测定8

3结果与分析8

3.1不同浓度钙处理对紫苏叶片中叶绿素含量的影响8

3.2不同浓度钙处理对紫苏叶片中丙二醛含量的影响10

3.3不同浓度钙处理对紫苏叶片中脯氨酸含量的影响11

3.4不同浓度钙处理对紫苏叶片中可溶性糖含量的影响12

3.5各项生理指标与钙离子浓度的相关性分析13

4结论15

参考文献16

附录17

致谢18

不同浓度钙处理对紫苏生理生化的影响

华娟

化学与生命科学学院生物科学专业200701班

摘要：

紫苏为唇形科紫苏属，一年生草本植物。

紫苏属于综合交叉商品既可药用，又是临床常用药，又能食用，在全国各地均有分布或栽培。

本实验在盆栽条件下研究了不同浓度（0、40、80、120、160、200mmol/L）CaCl2胁迫对紫苏中叶绿素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）和可溶性糖含量的影响。

结果表明：

随着Ca2+浓度的升高，叶绿素含量先上升后下降，脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量表现出先缓慢上升后急速上升的趋势。

用低浓度（40-120mmol/L）CaCl2处理时叶片中脯氨酸、丙二醛和可溶性糖的含量与对照相比增加的并不是很明显，叶绿素增加明显，但用高浓度（200mmol/L）的CaCl2处理时，丙二醛含量增加明显，叶绿素含量减少，品种3减少的较平缓，这显示植物受到了伤害，品种3的抗逆性较其它两品种好，伤害程度较轻。

可见低浓度的Ca2+处理对紫苏的生长具有一定的刺激作用，而高浓度的钙处理（200mmol/L）抑制了紫苏的生长甚至对其造成伤害。

关键词：

紫苏；Ca2+胁迫；生理生化指标

DifferentConcentrationofCalciumonthePhysiologyandBiochemistryofPerilla

HUAJuan

Class200701,Biology,CollegeofChemistryandLifeScience,HNU

Abstract:

PerillafrutescensbelongingtothePerillaadansoflabiataeisaone-year-oldherb.Perillaisanintegratedcross-merchandisewhichcanbemedicinalandarecommonlyusedforclinicaldrugsaswellasfood.Itdistributesorcultivatesthroughoutthecountry.TheeffectofdifferentconcentrationsofCa2+（0,40,80,120,160,200mmol/LCaCl2）aboutthecontentofchlorophyll,malondialdehyde（MDA）,proline（Pro）andsolublesugarofPerillaleaveswerestudiedbypotexperiment.Theresultsshowedthat:

WiththeincreasedconcentrationofCa2+,thecontentofchlorophyllofPerillaleafincreasedgraduallythendecreased,firstlythecontentofsolublesugar,proline（Pro）andMDAincreaseslowlythenincreaserapid.Whenitisdealtwithlowconcentration（40-120mmol/L）CaCl2,theincreaseofPro,MDAandsolublesugarofPerillaleavesisnotveryobviouswhilecomparedwiththecontrast,theincreaseofchlorophyllisobvious.Howeverwithhighconcentrations（200mmol/L）,theincreaseofMDAisobvious,thecontentofchlorophylldecrease,thespeciesof3decreaseslowly.thisshowthattheplantisdamage,thespeciesof3damageslightly.SowhatcanweseeisthatlowconcentrationofCa2+treatmentonthegrowthofPerillahasastimulatingeffectandonthecontrarytodealwithhighconcentrationsofCa2+（200mmol/L）inhibitedthegrowthofPerillaorevenharmit.

Keywords:

Perillafrutescens;Ca2+stress;physiologicalandbiochemicalindexes

1前言

1.1紫苏介绍

紫苏［Perillafrutescens（L.）Brittonvar.Acuta（Thnb.）Kudo］，别名荏子、赤苏、红苏等，唇形科，一年生直立草本植物，高0.8m，紫色或淡紫色，单叶对生，总状花序顶生或腋生，花小淡紫色，花期7-8月，果期9-10月，小坚果倒卵圆形，666.7m2产籽40-50kg。

传统中药，全草药用。

茎叶具有发表、散寒、理气功能，可治感冒、风寒、咳嗽、胸腹胀满；种籽具有降气消痰、平喘、润肠功能，用于痰壅气逆、咳嗽、气喘、肠燥便秘。

全草可提芳香油，为食用和化妆品的香料，也作为糕点的防腐剂。

我国有悠久的种植历史，全国广泛栽植，是卫生部首批的既是食品又是药品的60种物品之一。

紫苏籽出油率34%-45%，果实油名苏子油，苏子油在种植区内，群众早有食用习惯，油粕充饲科。

近年来，由于紫苏籽油富含α-亚麻酸，成为国内外专家研究的热点，有关其成分和生理功能的研究较多。

1.2研究目的及意义

1.2.1实验目的

本实验主要研究在不同浓度Ca2+处理下紫苏的叶绿素、丙二醛、游离脯氨酸、可溶性糖含量这四种生理生化指标的变化及不同品种间的差异。

1.2.2实验意义

紫苏主要用于药用、油用、香料、食用等方面，其叶（苏叶）、梗（苏梗）、果（苏子）均可入药，嫩叶可生食、作汤，茎叶可淹渍。

近些年来，因其特有的活性物质及营养成分，成为一种倍受世界关注的多用途植物，紫苏经济价值很高。

俄罗斯、日本、韩国、美国、加拿大等国对紫苏属植物进行了大量的商业性栽种，开发出了食用油、药品、淹渍品、化妆品等几十种紫苏产品。

近年关于紫苏化学成分和药理作用研究较多。

然而，在紫苏生理生化等各方面的研究还未曾见报道，这是紫苏研究领域的一个缺陷。

本实验是研究外界胁迫对不同品种紫苏生理生化变化的影响，比较品种间的差异。

希望本实验能够在一定程度上弥补对紫苏研究的不足，为以后的研究提供依据，对充分了解紫苏的价值和推广种植做出贡献。

1.3国内外研究进展

1.3.1紫苏的开发价值的研究

近年来，随着社会的进步，科学新技术的发展，人口素质的不断提高，卫生安全的各类保健品越来越受到消费者青睐。

紫苏深加工产品作为保健品市场的新军，在国外市场上很受欢迎。

紫苏是传统的中药，以茎、叶子种子入药，具有发汗散寒、行气解毒等功效。

紫苏叶有解热抗菌作用，主治感冒、咳嗽、胸腹胀满、恶心呕吐等病症。

紫苏茎杆有顺气、安胎、发散风寒、通血脉的功用。

紫苏子粒有镇咳平喘、祛痰的功能[1,2]。

紫苏籽是重要的工业原料。

紫苏油是优良的干性油，挥发性强，易干燥，其油膜坚韧而有弹性，遇热不易熔化。

可用来制造清漆、色漆、染料、人造革、高级车辆和飞机的润滑油甚至加工新型燃油等[3,4]。

全世界科技界公认α-亚麻酸及其代谢产物对人体有增强智力、提高记忆力、保证视力、改善睡眠，抑制血栓性疾病、预防心肌梗塞和脑梗塞，降血脂、血压，抑制出血性脑中风，预防过敏等保健作用，是值得信赖的优良食用油品种，是未来可以长期使用的油类。

由此可见，在我国特别是山西积极开发α-亚麻酸及相关产品，可以提高我国人民健康水平，是建设发达文明社会的需求[4,6,8,11]。

1.3.2紫苏的化学成分和药理作用的研究

紫苏中主要化学成分有：

粗脂肪与脂肪酸[5,6]，蛋白质与氨基酸[5]，微量元素[7]，挥发油[5]及其它成分，这些化学成分与功能密切相关。

紫苏籽油中富含α-亚麻酸，而α-亚麻酸只能从外界摄取，不能在体内合成，被称为必需脂肪酸，也称为维生素F[10]。

所以，紫苏籽油的生理功能主要是a-亚麻酸的作用。

它的主要生理功能有：

降血脂，预防脑血栓和心肌梗塞[11]，降压作用[12]，促进神经系统、脑和视网膜的发育，提高脑功能和学习记忆[13]，预防老年痴呆症和过敏症，抗肿瘤作用[10]。

日本从上世纪60年代就开始了对紫苏的研究，并从中开发出了具有药用价值的保健食用油、保健食品、蔬菜、药品，其价值是一般食用油、保健品、药品的数倍乃至几十倍。

目前世界上对紫苏的开发利用工作，日本处于领先地位，美国、加拿大、韩国也各有特色[1]。

近年来，我国在紫苏研究中取得了一系列成果，综合应用研究已达到国际先进水平。

吉林、云南两省已有企业生产出了相关药品，山东省的一家企业生产出了含紫苏油成分的调和油，南京开发出了紫苏叶保健茶。

2材料与方法

2.1实验材料

本实验的材料为实验室种子培育所得的紫苏幼苗，有三个品种，品种1是重庆紫苏，品种2是黄冈本地紫苏，品种3是甘肃紫苏。

2.2实验用品及仪器

2.2.1实验药品

丙酮、石英沙、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、磺基水杨酸、冰乙酸、茚三酮、甲苯、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖、无水乙醇、碳酸钙、磷酸、氢氧化钠、氯化钙、活性炭

2.2.2实验仪器

分光光度计、分析天平、碾钵、漏斗、移液管、打孔器、滴管、剪刀、容量瓶、恒温水浴箱、离心机、干热鼓风干燥箱、刻度试管、烧杯、量筒

2.3实验方案设计

2.3.1生理指标的选择

在胁迫下，植物体必然做出一些相应的生理生化反应。

这些反应结果或是植物体受到伤害，或是植物体为了抵抗胁迫而发生的变化。

在盐胁迫下，植物生理的最大变化是体内会产生大量的氧自由基，即活性氧，降低具有清除自由基作用的SOD（超氧化物歧化酶）活性[15-17]，增大了植物细胞的膜脂过氧化作用，而丙二醛是膜脂过氧化的产物，使细胞膜受到伤害，最终导致膜透性发生变化，结构和功能受损[18,19]。

植物细胞的叶绿体是对盐胁迫比较敏感的细胞器，生物膜的破坏使其解体。

植物为了抵抗胁迫，也采取了一些措施[20]，比如：

合成积累有机溶质来提高植物的渗透调节。

大量实验证明，脯氨酸可提高植物细胞的渗透调节能力。

可溶性糖也是一种渗透调节剂，在钙胁迫后期，植物中可溶性糖含量快速增加[14]。

综上所述，叶绿素、丙二醛、脯氨酸和可溶性糖的含量的变化能够真实地反应出植物的生理生化变化。

2.3.2实验方法的选择

根据郑兴莲[21]等人的研究，钙离子浓度为200mmol/L时，对茄子产生的影响较大。

郑兴莲等采用0、80、120、160、200、240mmol/L硝酸钙处理对茄子进行生理生化变化的研究，能够说明钙胁迫对茄子生理生化变化的影响。

本实验采用0、40、80、120、160、200mmol/L钙离子浓度来处理材料。

根据本实验室所能提供的仪器设备和药品试剂，参考张志良[22]等人的方法，本实验对可溶性糖含量的测定采用蒽酮比色法；对游离脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法；对叶绿素含量的测定采用丙酮提取法，对丙二醛含量的测定采用硫代巴比妥酸法，来测量各项生理生化指标。

2.4实验原理

2.4.1叶绿素含量的测定原理

丙酮提取法：

叶绿素分为叶绿素a和叶绿素b，它们都能够溶于丙酮试剂。

利用丙酮提取叶片中的叶绿素，分别在663nm和645nm测定OD值（叶绿素a的最大吸收波长为663nm，叶绿素b的最大吸收波长为645nm）。

根据Lambert-Beer定律计算叶绿素的含量。

2.4.2游离脯氨酸含量的测定原理

磺基水杨酸法:

当植物受到渗透胁迫时，造成生理缺水，植物体内脯氨酸大量积累。

在pH为1-7时用人造沸石可以除去一些干扰的氨基酸，在酸性条件下，茚三酮与脯氨酸反应生成红色化合物，其含量和色度成正比，用分光光度计测定520nm处OD值，最后从标准曲线查得脯氨酸的含量，此法有专一性。

脯氨酸标准曲线的制作：

100µg/mL脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10µg/mL的标准溶液。

取标准溶液各2mL，加入2mL冰乙酸，2mL蒸馏水，4mL2.5%酸性茚三酮，混匀后沸水显色60min，取出冷却后用4mL甲苯振荡萃取，静止片刻，吸取甲苯相（粉红色）在520nm波长处测定OD值。

以OD值为纵坐标，脯氨酸浓度（µg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

2.4.3丙二醛含量的测定原理

硫代巴比妥酸法：

在酸性和高温的条件下，丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色的3,3,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大的吸收波长。

但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm。

因此在测定中需排除前者的干扰，通常加入低浓度的Fe3+，以显著增加TBA与糖的反应产物在450nm处的吸收。

最后采用双组分光光度法可求出丙二醛的含量。

2.4.4可溶性糖含量的测定原理

蒽酮比色法：

糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖的含量有关。

在625nm波长下的OD值与糖的含量成正比。

由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色法该实验方法简便，但没有专一性，绝大部分的碳水化合物例如蔗糖、果糖、葡萄糖都能与蒽酮试剂反应，产生颜色。

可溶性糖标准曲线的制作：

称取已在80℃烘箱中烘至恒重的葡萄糖100mg，配制成500mL的溶液，即每毫升含糖量为200µg的标准液。

取标准糖溶液将其稀释成一系列0-100µg/mL的不同浓度的溶液。

吸取标准液各1mL，加入5mL蒽酮试剂，沸水水浴10min，取出自然冷却至室温，在625nm波长下测定OD值，以OD值为纵坐标，可溶性糖浓度（µg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

2.5实验方法

2.5.1材料处理

本实验于2011年2~5月在黄冈师范学院化学与生物科学学院，植物生理生态开放实验室以及生物楼3楼阳台进行。

实验采用盆栽土培法进行，按实验设计量对不同品种盆栽幼苗紫苏进行CaCl2溶液浇灌，以不浇灌CaCl2溶液为对照。

CaCl2溶液浓度分别为0、40、80、120、160、200mmol/L，每盆浇30mL。

对照为正常浇水处理，随机摆放，在相同环境条件下栽培管理。

于处理后第7天，进行生理生化指标的测定。

2.5.2测验项目

幼苗生理生化指标的测定：

叶绿素含量的测定，脯氨酸含量的测定，丙二醛含量的测定和可溶性糖含量的测定。

2.5.3叶绿素含量的测定

采用丙酮提取法：

取新鲜叶片去除粗大叶脉后剪碎混匀，称取0.5g放入研钵中加纯丙酮5mL，少许碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加入80%丙酮5mL，将匀浆转入离心管，并用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至20mL。

取色素提取液1mL，加80%丙酮4mL稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，分别测定663nm，645nm处的光密度值。

按照公式Ca=12.7OD663-2.69OD645，Cb=22.9OD645-4.68OD663。

计算叶绿素a、叶绿素b和叶绿素的含量。

2.5.4脯氨酸含量的测定

采用磺基水杨酸法：

剪取0.2g新鲜叶片放入10mL刻度试管中，加入5mL3%的磺基水杨酸溶液，加盖，置于沸水浴中提取15min，冷却后离心，取上清液待测。

在20mL刻度试管中后加入上清液0.5mL，蒸馏水1.5mL，冰乙酸2.0mL和茚三酮2.0mL，摇匀后沸水浴30min，冷却，各加入5.0mL甲苯，充分摇匀萃取（暗中静置2-3h）。

用吸管吸取甲苯层，在520nm下测定吸光度，计算Pro含量。

2.5.5丙二醛含量的测定

剪取0.4g新鲜叶片置研钵中，加2mL5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂，研磨成匀浆，转移至离心管中，再加入8mL5%TCA冲洗研钵，合并提取液。

然后在3000r/min下离心10min。

取l0mL刻度试管2支，一支加入离心管内的上清液3mL，另一支加水3mL（空白）；各加入0.5%TBA3mL，摇匀，在沸水浴中煮沸10min（自试管内溶液出现小气泡开始计时），取出后立即在冷水中冷却。

如有沉淀，应离心。

在600nm，532nm，450nm下测定吸光度，计算MDA含量。

2.5.6可溶性糖含量的测定

采用蒽酮比色法：

将植物叶片在110℃烘箱中烘15min，然后调至70℃过夜。

干叶片研磨后取0.05g，放入10mL刻度试管中，加入4mL80%酒精，于80℃水浴中提取40min，冷却后离心，收集上清液，其残渣加2mL80%酒精重复提取2次，合并上清液。

在上清液中加10mg活性炭80℃脱色30min，然后定容至10mL，过滤后为待测液。

吸取1mL待测液，加5mL蒽酮试剂，沸水水浴10min，取出自然冷却至室温，在625nm波长下测定OD值。

在标准液浓度分别为：

0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100µg/mL做标准曲线。

3结果与分析

3.1不同浓度钙处理对紫苏叶片中叶绿素含量的影响

叶绿素是光合作用的主要色素，其含量的高低在一定程度上反映了植物光合作用的强弱，叶绿素含量的降低是衡量叶片衰老的重要指标之一。

从表1和图1中，我们可以看出叶绿素的含量随着钙离子浓度的增加呈现出先增大后减少的趋势，三个品种的叶绿素含量在0-160mmol/L之间均高于对照组，品种3在160mmol/L时达到最大值，而其它两个品种在120mmol/L达到最大，虽然这两个在160mmol/L较120mmol/L有下降，但仍然高于对照组，3个品种在200mmol/L的CaCl2处理下叶绿素的含量都下降，这表明在不大于160mmol/L浓度，CaCl2对紫苏幼苗的光合作用有一定促进作用；而只有达到较高浓度时，CaCl2才会对它产生破坏，并且对品种2的破坏最严重。

表1各Ca2+梯度叶绿素的平均含量

Tab.1TheaveragecontentofchlorophyllinvarietyCa2+gradient

项目（mmol/l）

品种

1

2

3

叶绿素平均含量

叶绿素平均含量

叶绿素平均含量

0

8.551

8.542

8.558

40

8.925

8.842

8.982

80

9.318

9.416

9.451

120

9.914

9.894

9.978

160

9.728

9.632

10.184

200

9.425

9.385

9.431

图1各Ca2+梯度叶绿素的平均含量

Fig.1TheaveragecontentofchlorophyllinvarietyCa2+gradient

3.2不同浓度钙处理对紫苏叶片中脯氨酸含量的影响

表2各Ca2+梯度脯氨酸的平均含量

Tab.2theaveragecontentofProinvarietyCa2+gradient

项目

品种

1

2

3

0mmol/L

2.894

2.496

2.512

40mmol/L

3.271

2.812

3.877

80mmol/L

3.711

3.312

4.212

120mmol/L

4.409

3.734

4.814

160mmol/L

5.369

4.245

5.989

200mmol/L

6.742

5.434

8.815

脯氨酸的累积是紫苏的一种保护性适应，因为脯氨酸是植物体内的一种重要的渗透调节物质。

渗透调节被认为是植物适应逆境的主要生理调节机制，脯氨酸的积累参与了渗透调节。

图2各Ca2+梯度脯氨酸的平均含量

Fig.2TheaveragecontentofProinvarietyCa2+gradient

从表2中我们可以看出脯氨酸的含量随着钙离子浓度的增加呈现出增大趋势，在40、80、120、160mmol/L的钙离子浓度胁迫下叶片中脯氨酸的含量均高于对照组。

在200mmol/L时脯氨酸的含量达到最大值。

然而在40-160mmol/L时脯氨酸的含量增加的不是很明显，说明在低浓度时对幼苗胁迫程度轻，但当浓度达到200mmol/L时，脯氨酸的含量骤然上升，可见植物受到了外界环境的强烈干扰。

品种3的脯氨酸含量一直比另外两个品种高，说明品种3调节植物细胞渗透维持细胞吸水的能力强，品种1次之，品种2最弱。

3.3不同浓度钙处理对紫苏叶片中丙二醛含量的影响

植物在逆境时，细胞原生质膜中的不饱和脂肪酸会发生过氧化作用产生MDA，使质膜系统受到伤害，细胞质内电解质外渗量增加，因而MDA含量可反映细胞膜脂过氧化作用的强弱。

表3各Ca2+梯度丙二醛的平均含量

Tab.3TheaveragecontentofMDAinvarietyCa2+gradient

项目

品种

1

2

3

0mmol/L

0.379

0.342

0.351

40mmol/L

0.381

0.374

0.372

80mmol/L

0.401

0.401

0.381

120mmol/L

0.416

0.422

0.394

160mmol/L

0.421

0.441

0.402

200mmol/L

0.521

0.672

0.451