第9章2-化学键合相色法-非极性键合相.ppt
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药物色谱分析药物色谱分析中国药科大学药物色谱分析课程第九章第九章22化学键合相色谱化学键合相色谱非极性键合相色谱非极性键合相色谱11/2/20221正相键合相色谱VS反相键合相色谱键合相极性键合相极性流动相极性流动相极性键合相极性键合相极性流动相极性流动相极性正正相相键键合合相相色色谱谱反反相相键键合合相相色色谱谱11/2/20222中国药科大学药物色谱分析课程郑枫一、概一、概述述非极性键合相色谱,又称反相非极性键合相色谱,又称反相HPLC(reversedphaseHPLC(reversedphaseHPLC,RP-HPLC),HPLC,RP-HPLC),或反相键合相或反相键合相色谱(色谱(RPBCRPBC):
):
硅胶表面键合硅胶表面键合了非极性有机基团了非极性有机基团(烃基硅烷烃基硅烷)的固定相。
常见的烃基有丙基、的固定相。
常见的烃基有丙基、己基、辛基、十六烷基、十八己基、辛基、十六烷基、十八烷基和苯基,其中以十八烷基烷基和苯基,其中以十八烷基键合相(简称键合相(简称ODSODS或或CC1818)应用应用最广泛。
最广泛。
11/2/20223中国药科大学药物色谱分析课程郑枫二、分离机理二、分离机理1、疏溶剂作用理论、疏溶剂作用理论2、双保留机理、双保留机理11/2/20224中国药科大学药物色谱分析课程郑枫11、疏溶剂作用理论、疏溶剂作用理论Horvath1976年在年在“JChromatogrphy”首次提出;首次提出;“Solvophobicinteractionsinliquidwithnon-polarstationaryphases,”用于解释反相液相色谱的保留机制用于解释反相液相色谱的保留机制中国药科大学药物色谱分析课程郑枫11、疏溶剂作用理论、疏溶剂作用理论11)“分子毛分子毛”疏溶剂作用理论认为非极性烷基键合相是疏溶剂作用理论认为非极性烷基键合相是在硅胶表面蒙覆了一层以在硅胶表面蒙覆了一层以Si-C键化学键合的键化学键合的十八烷基(或其它烃基)的十八烷基(或其它烃基)的“分子毛分子毛”。
强疏水性强疏水性中国药科大学药物色谱分析课程郑枫溶质分子溶质分子=非极性部分非极性部分+极性官能团部分极性官能团部分22)溶质分子(分析物)溶质分子(分析物)中国药科大学药物色谱分析课程郑枫33)“疏溶剂效应疏溶剂效应”solvophobicsolvophobicinteractioninteraction当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时,相当溶质分子的非极性部分与极性溶剂接触时,相互间产生斥力。
此现象称为互间产生斥力。
此现象称为“疏溶剂疏溶剂”。
当当键合相表面的烷基(分子毛)键合相表面的烷基(分子毛)与极性溶剂接触与极性溶剂接触时,相互间也产生斥力。
时,相互间也产生斥力。
而当溶质分子的非极性部分与而当溶质分子的非极性部分与键合相表面的烷基键合相表面的烷基(分子毛)(分子毛)接触时,则相互间产生接触时,则相互间产生缔合作用。
缔合作用。
这这种缔合作用是种缔合作用是可逆可逆的。
这种缔合作用的强弱决定的。
这种缔合作用的强弱决定了溶质分子色谱保留的强弱。
了溶质分子色谱保留的强弱。
溶质分子的极性部分与极性溶剂具有亲和力。
溶质分子的极性部分与极性溶剂具有亲和力。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫当溶质进入到极当溶质进入到极性流动相中后,溶性流动相中后,溶质分子(质分子(SS)被流)被流动相推动并与固定动相推动并与固定相接触时,溶质分相接触时,溶质分子的非极性部分会子的非极性部分会与非极性固定相上与非极性固定相上的烷基的烷基(LL)发生发生缔缔合作用,合作用,结合形成结合形成缔合物缔合物(LSLS)。
这种疏溶剂的缔合这种疏溶剂的缔合作用是作用是可逆可逆的。
的。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫44)溶质保留值的影响因素)溶质保留值的影响因素溶质分子结构对保留值的影响溶质分子结构对保留值的影响烷基键合固定相特性对保留值的影响烷基键合固定相特性对保留值的影响流动相性质对保留值的影响流动相性质对保留值的影响温度的影响温度的影响中国药科大学药物色谱分析课程郑枫溶质分子结构对保留值的影响溶质分子结构对保留值的影响在一定的洗脱液在一定的洗脱液和温度下,溶质和温度下,溶质分子的分子的loglogkk与溶与溶质分子中的非极质分子中的非极性部分总表面成性部分总表面成正比。
正比。
非洛普ABB中国药科大学药物色谱分析课程郑枫溶质分子中非溶质分子中非极性部分相同,极性部分相同,而增加极性基而增加极性基团,则因为增团,则因为增加了溶质分子加了溶质分子与洗脱液的极与洗脱液的极性分子间的作性分子间的作用力而使减用力而使减小。
小。
REASON中国药科大学药物色谱分析课程郑枫以下是降压药盐酸非洛普及其以下是降压药盐酸非洛普及其33个代谢物的化学结构,个代谢物的化学结构,请讨论它们在非极性键合相色谱分离分析过程中的出请讨论它们在非极性键合相色谱分离分析过程中的出峰先后顺序峰先后顺序。
盐酸非洛普的代谢物盐酸非洛普的代谢物M3M3盐酸非洛普的代谢物盐酸非洛普的代谢物M2M2盐酸非洛普的代谢物盐酸非洛普的代谢物M1M1盐酸非洛普盐酸非洛普中国药科大学药物色谱分析课程郑枫烷基键合固定相特性对保留值的影响烷基键合固定相特性对保留值的影响A.A.烷基数量越多,溶质保留越强。
烷基数量越多,溶质保留越强。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫B.B.烷基碳链越长,溶质保留越强烷基碳链越长,溶质保留越强随着烷基碳链的增长,增加了键合相随着烷基碳链的增长,增加了键合相的非极性作用的表面积,其不仅影响的非极性作用的表面积,其不仅影响溶质的保留值,还影响色谱柱的选择溶质的保留值,还影响色谱柱的选择性,即随烷基碳链的加长其对溶质分性,即随烷基碳链的加长其对溶质分离的选择性也增大。
离的选择性也增大。
烷基键合固定相特性对保留值的影响烷基键合固定相特性对保留值的影响中国药科大学药物色谱分析课程郑枫例:
地西泮分别在地西泮分别在C18柱和柱和C8柱上的色谱保留柱上的色谱保留流动相:
甲醇流动相:
甲醇-水(水(8020););1.C18柱上的色谱图;柱上的色谱图;2.C8柱上的色谱图柱上的色谱图中国药科大学药物色谱分析课程郑枫烷基键合固定相碳链的碳原子数烷基键合固定相碳链的碳原子数llggkk洗脱液:
水:
甲醇洗脱液:
水:
甲醇(9090:
1010)洗脱液:
水:
甲醇洗脱液:
水:
甲醇(1010:
9090)反相HPLC中烷基键合相碳链长度及流动相中有机相比例对某物质保留值的影响中国药科大学药物色谱分析课程郑枫流动相性质对保留值的影响流动相性质对保留值的影响流动相的表面张力流动相的表面张力流动相的表面张力越大流动相的表面张力越大解缔合时释放解缔合时释放的能量越多的能量越多越大。
越大。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫流动相极性流动相极性表面张力表面张力(有机溶剂(有机溶剂)中国药科大学药物色谱分析课程郑枫温度的影响温度的影响温度升高,保留值降低;温度升高,保留值降低;温度升高,柱效提高。
温度升高,柱效提高。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫中国药科大学药物色谱分析课程郑枫22、双保留机理、双保留机理双保留机理双保留机理溶质的保留值应包括两部分的贡献,即溶质的保留值应包括两部分的贡献,即疏疏溶剂效应溶剂效应和和亲硅醇基效应亲硅醇基效应。
“亲硅醇基效应亲硅醇基效应”silanophilicsilanophilicinteractioninteraction烷基键合相表面往往还有残余硅醇基,这是烷基键合相表面往往还有残余硅醇基,这是一种微量酸性的基团,可与溶质阳离子或氢键一种微量酸性的基团,可与溶质阳离子或氢键基团相互作用,主要影响基团相互作用,主要影响含氮类药物的分离含氮类药物的分离,造成色谱峰拖尾,柱效下降。
造成色谱峰拖尾,柱效下降。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫中国药科大学药物色谱分析课程郑枫加扫尾剂。
一般常用的扫尾剂为有加扫尾剂。
一般常用的扫尾剂为有机碱类,如三乙胺等。
机碱类,如三乙胺等。
其扫尾作用,主要是有机碱与硅胶的酸其扫尾作用,主要是有机碱与硅胶的酸性硅羟基作用,降低了硅胶的吸附作用性硅羟基作用,降低了硅胶的吸附作用。
解决办法中国药科大学药物色谱分析课程郑枫中国药科大学药物色谱分析课程郑枫流动相中加入三乙胺后对普萘洛尔在流动相中加入三乙胺后对普萘洛尔在C18C18柱上色谱行为的影响柱上色谱行为的影响1.1.甲醇甲醇-水(水(70700330)2.2.2.2.甲醇甲醇-水水-三乙胺三乙胺-乙酸(乙酸(707003305.00.55.00.5)中国药科大学药物色谱分析课程郑枫甲醇甲醇-水(水(4040:
6060)甲醇甲醇-水水+三乙胺三乙胺n-普鲁卡因酰胺普鲁卡因胺n-普鲁卡因酰胺普鲁卡因胺中国药科大学药物色谱分析课程郑枫Minutes0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.00Column:
HP-C18(5m,120,4.6x250mm,08050816168)Mobilephase:
ACN:
1%H3PO4=0.3:
99.7Flowrate:
1.0mL/minColumntem.:
RTWavelength:
210nmInjectionVolume:
10.0L用流动相稀释原样品溶液梓醇梓醇33。
溶样溶剂的影响。
溶样溶剂的影响溶剂效应:
注意用流动相稀释样品溶剂效应:
注意用流动相稀释样品中国药科大学药物色谱分析课程郑枫三、流动相三、流动相常用流动相常用流动相溶质保留值随溶剂极溶质保留值随溶剂极性变化的一般规律性变化的一般规律反相键合相色谱的反相键合相色谱的流动相选择流动相选择11/2/202229中国药科大学药物色谱分析课程郑枫11、分离中性化合物的流动相、分离中性化合物的流动相强极性溶剂(水、醇、乙腈)强极性溶剂(水、醇、乙腈)溶剂极性越低,其洗脱能力越强溶剂极性越低,其洗脱能力越强溶剂强度:
水溶剂强度:
水甲醇甲醇乙腈乙腈四氢呋喃四氢呋喃系统(系统(22)较系统()较系统(11)好,原因如下:
)好,原因如下:
AA)系统(系统(22)的粘度较系统()的粘度较系统(11)小,柱效好些)小,柱效好些。
(注:
粘度(注:
粘度柱压柱压,传质阻力,传质阻力(溶质扩散(溶质扩散阻力阻力)柱效柱效)BB)乙腈的紫外末端吸收较甲醇小,在低波长处乙腈的紫外末端吸收较甲醇小,在低波长处测定时,基线波动较甲醇小,测定误差小。
测定时,基线波动较甲醇小,测定误差小。
常用流动相常用流动相(11)甲醇)甲醇水水(22)乙腈)乙腈水水(33)四氢呋喃)四氢呋喃水水11/2/202231中国药科大学药物色谱分析课程郑枫22、反相色谱法的流动相选择、反相色谱法的流动相选择(11)二元溶剂系统)二元溶剂系统一般以洗脱能力最弱的水作为底剂,一般以洗脱能力最弱的水作为底剂,再加入一定量的可与水互溶的有机再加入一定量的可与水互溶的有机极性调节剂构成,常用的首选极性极性调节剂构成,常用的首选极性调节剂为甲醇与乙腈。
调节剂为甲醇与乙腈。
中国药科大学药物色谱分析课程郑枫在反相色谱中,有机相比例减小:
在反相色谱中,有机相比例减小:
(11)溶剂的极性增加,洗脱能力降低,)溶剂的极性增加,洗脱能力降低,溶质的保留时间增加。
溶质的保留时间增加。
(22)不同溶质组分之间的分离度增加;)不同溶质组分之间的分离度增加;(33)溶质的柱效下降。
)溶质的柱效下降。
溶质在反相色谱柱上的保留行为随有机相组成变化溶质在反相色谱柱上的保留行为随有机相组成变化的一般规律的一般规律中国药科大学药物色谱分析课程郑枫C18柱(15cm0.46cm),流量1.5ml/L,t0=1.0min反相反相HPLCHPLC改变流动相中有机溶剂比例对化合物改变流动相中有机溶剂比例对化合物AA、BB、CC、DD保留值
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- 化学键 合相色法 极性 键合相