大蒜素注射液对铜绿假单胞菌生物膜致病因子表达.docx
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大蒜素注射液对铜绿假单胞菌生物膜致病因子表达
大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜群体密度感应系统调控毒力因子表达的影响
林丽华,余加林,卢起,刘官信(重庆医科大学附属儿童医院,重庆400014)
摘要:
目的通过体外测定铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)群体密度感应(QuorumSensing,QS)系统调控的毒力因子表达,比较大蒜素干预前后毒性因子表达的差异以及对铜绿假单胞菌PAO1成熟生物膜(biofilm,BF)的影响。
方法应用ELISA法比较处理前后外毒素A的含量差异;利用弹性蛋白-刚果红染色的方法,测定处理前后弹性蛋白酶活性;用蒽酮-硫酸法测定鼠李糖脂;荧光酶标仪检测青脓素含量变化;利用激光共聚焦显微镜观察干预前后大蒜素对铜绿假单胞成熟BF的影响。
结果大蒜素干预后与生理盐水对照组比较,外毒素A、弹性蛋白酶、鼠李糖脂和青脓素表达分别由(19.630±0.573)pg/μl、(0.467±0.003)、(2.009±0.063)g/L、(9325.833±367.675)下降到(6.529±0.289)pg/μl、(0.032±0.001)、(0.269±0.009)g/L、(7819.167±111.800)。
激光共聚焦显微镜观察可见生理盐水对照组细菌菌落云集呈蘑菇状分布,干预组黏附的细菌稀疏散在平坦分布。
结论大蒜素可抑制铜绿假单胞菌群体密度感应系统调控毒力因子表达,减弱其毒力,干扰BF分化成熟。
关键词:
铜绿假单胞菌;群体密度感应系统;毒力;生物膜;大蒜素
中图法分类号:
文献标识码:
EffectsofallitrideonQuorumSensing-ControledVirulenceFactorsProductioninPseudomonasaeruginosabiofilm
LINLi-hµa,YUJia-lin,LUQi,LIUGuan-xin(Children′sHospitalofChongqingMedicaluniversity,Chongqing400014)
Abstract:
ObjectiveQuorum-sensing(QS)systemisakeyregulatorofvirulenceandbiofilmdevelopmentinP.aeruginosa.AllitridewasexaminedinthisstudyforitseffectsonP.aeruginosavirulencefactorsandbiofilmformationinvitro.MethodsSensitivesandwichenzeme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)systemsforthequantificationofexotoxinA,Expressionofelastaseandpyoverdinwereassessedsemi-quantitativelyusingelastinCongoredandfluorescencerespectively.ProductionofrhamnolipidwasdeterminedbyH2SO4-anthroneanalysismethod,absorbanceat553nm;Scanningconfocallasermicroscope(CLSM)wasusedtostudytheeffectsofallitrideonmaturebiofilminvitro.ResultsAllitridedownregulatedvirulencefactors:
exotoxinA,elastase,rhamnolipidandpyoverdin,productionofexotoxinA,elastase,rhamnolipidandpyoverdindeceasedfrom(9.630±0.573)pg/μl,(0.467±0.003),(2.009±0.063)g/l,(9325.833±367.675)to(6.529±0.289)pg/μl,(0.032±0.001),(0.269±0.009)g/land(7819.167±111.800)respectively.UndertheCLSM,innormalsodiumcontrolgroupP.aeruginosaformedmaturemushroomsrtuctures,whileformedflatundifferentiatedbiofilm,susceptibletotreatmentwithallitrideintheinterventiongroup.ConclusionsAllitrideattenuatesitsvirulencesignificantlyandsupressedbiofilmformationbyinterventingQSsystemofP.aeruginosa.
Keywords:
Pseudomonasaeruginosa;Quorum-sensingsystem;virulence;biofilm;allitride
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)是临床上最常见的引起严重院内获得性感染的条件致病菌,能释放多种与毒力有关的物质,如外毒素A、弹性酶、青脓素、鼠李糖脂、碱性蛋白酶、溶血素、氰化物等,而且容易黏附于导管上,形成生物膜(biofilm,BF),从而能够克服宿主防御机制,改变宿主防御机制和细菌毒素产生之间的平衡,逃逸机体免疫防御,导致组织损伤、毒素播散、慢性感染、全身炎症反应综合征甚至最终死亡。
这些毒力因子的表达需要群体密度感应(QuorumSensing,QS)系统的参与,QS系统在铜绿假单胞菌的分化以及生长过程中是必需的,对于其形成复杂的生物膜的过程也起到重要作用[1-4];这也暗示了治疗BF的一种可能的方法,使用信号因子类似物或其他方法阻断QS系统,减少毒力因子的产生,并能通过干扰BF的分化从而恢复铜绿假单胞菌对抗生素的敏感性。
大蒜素为百合科植物大蒜鳞茎中所含的抗菌活性成分,化学名称为二烯丙基三硫化合物,其分子式为C6H10S3[5]。
本课题在前期实验基础上,探讨大蒜素对铜绿假单胞菌QS系统调控的毒力因子表达以及成熟BF的影响,以期为临床治疗铜绿假单胞菌BF提供实验依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
铜绿假单胞菌PAO1菌株(本实验室保存)。
大蒜素注射液(AllitrideInjection,规格:
30mg/2ml,上海禾丰制药有限公司批号H31022371)。
弹性蛋白酶-刚果红(ECR,Sigma公司);Trypticasesoybroth(TSB,胰酶大豆肉汤,OXOID公司),蛋白胨(Peptone,上海升博制品公司),LB培养基(Luria-BertaniMedium,LB)螯合树脂-100(Sigma公司),PEA试剂盒(E0974h,武汉中美科技),L13152LIVE/DEAD®BacLight™BacterialViabilityKits(美国MolecularProbes公司),Tris(0.1mol/L)/CaCl2(1mmol/L)(pH7.2),0.12mol/L乙二胺四乙酸(EDTA,分析纯),0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4),2mol/L谷氨酸钠,甘油,鼠李糖,蒽酮,浓硫酸,硝酸铵,硫酸镁,磷酸一氢钾,磷酸二氢钾,氯化钙,氯仿,甲醇均为分析纯。
1.2实验器材
TCSSP2型激光共聚焦显微镜(CLSM,德国Leica公司),紫外分光光度计UV-1700(苏州岛津仪器有限公司),24孔细胞培养板(美国Corning公司),10mm×10mm玻片(聚氯乙烯材料,上海天呈科技有限公司),44mm透析袋、一次性滤器(0.45μm)、WhatmanNo.1滤纸均为Millipore产品。
1.3大蒜素对铜绿假单胞菌生长的影响
挑取新鲜PA01菌株单菌落接种于5mlLB培养基中,37℃振荡培养过夜,次日按1%的比例转种于250mlLB培养基中传代培养。
实验分成2组,生理盐水对照组和大蒜素120μg/ml干预组,每隔1.5小时监测D(600),持续24h,以培养基为空白对照。
根据3次重复测定所得的数据,求出D(600)平均值,以D(600)为纵坐标,时间为横坐标汇出生长曲线。
1.4细菌外毒素A的测定[6]
1.4.1培养基与细菌培养物上清液的制备
1.4.1.1透析袋的处理将适当长度的透析袋用蒸馏水清洗3次,去除表面的甘油及杂质,之后用0.12mmol/L的EDTA中煮沸10min,以去除表面的重金属离子。
1.4.1.2DTSB培养基的制备30gTSB粉溶于100ml双蒸水中,加入5g螯合树脂-100,室温下持续搅拌6h后装入透析袋中,扎紧透析袋,浸入盛有1000ml双蒸水的烧杯中,在4℃持续搅拌条件下透析18h,除了分子量太大无法通过透析袋的以外,透析后的溶液包括了所有的TSB的营养成分,透析培养基即是含有TSB中的低分子量物质的溶液。
在透析的培养液中加入2ml50%的CaCl2,煮沸5min,用WhatmanNo.1滤纸除去沉淀物,将培养基高压蒸汽灭菌,临用前在TSB透析液中加入无菌的50%甘油和2mol/L谷氨酸钠溶液。
终浓度分别为1.0%和0.05mol/L。
1.4.2PAO1的培养及外毒素A的制备挑选新鲜PAO1的菌落接种于装有10mlDTSB培养基的250ml锥形瓶中,32℃、200r/min孵育18h后,按1%的比例转种于250ml锥形瓶中(分为生理盐水对照组和大蒜素120μg/ml干预组,每组重复8次,复孔3组。
培养5.5h后终止培养,将培养物10000g4℃离心30min后,吸取上清液,用一次性过滤器(0.45μm)过滤除菌,之后储存于-70℃中备用。
1.4.2ELISA测定PEA的含量[7]按照试剂盒说明操作。
1.5弹性蛋白酶的测定[8,9]
1.5.1PTSB培养基的制备每1000ml双蒸水中加入蛋白栋50g、TSB2.5g,加热熔化后高压灭菌20min,冷却后置于4℃冰箱备用。
1.5.2PAO1的培养及细菌上清液的制备挑选新鲜PAO1的菌落接种于装有25mlPTSB培养基的250ml锥形瓶中,37℃振荡培养至对数曲线中段后,离心清洗后用PTSB培养基重悬,调整浓度至0.05[D(600)],在37℃振摇培养15h后,分别给予生理盐水、大蒜素120μg/ml,共培养6h。
将培养物10000g4℃离心30min后,吸取上清液,用一次性过滤器(0.45μm)过滤除菌,之后储存于-70℃中备用。
1.5.3弹性蛋白酶活性的测定15ml振荡培养管中加入20mgECR和1ml反应缓冲液[Tris(0.1mol/L)/CaCl2(1mmol/L),pH7.2],之后加入50μl细菌上清液,37℃振荡培养15h后,加入0.1ml0.12mol/LEDTA终止反应,将反应物置于冰上,5000×g4℃离心10min除去不可溶的ECR。
背景吸光度值(主要为铜绿假单胞菌色素所产生的吸光度)为未加ECR时的D(495)值,酶-底物反应的吸光度值减去背景吸光度值即为最终的吸光度值。
每次测定3份同样的待测样品,重复8次。
1.6青脓素的测定[10]
1.6.1PAO1的培养及细菌上清液的制备挑选新鲜PAO1的菌落接种于LB培养基,37℃振荡培养过夜,按1%比例接种于50mlLB培养基,培养8h后,分别予生理盐水、大蒜素120μg/ml,共培养6h。
将培养物10000×g4℃离心30min后,吸取上清液,4℃保存。
1.6.2多功能荧光酶标仪检测青脓素相对荧光量仪器参数:
激发光滤光片405nm/20,发射光滤光片465nm/20,光学位置bottom,灵敏度auto,每孔样品检测次数12次;高值为10000,所有荧光强度值均指减去本底荧光强度后的值。
用pH7.4,0.1mol/LTris-HCl稀释10倍,在96孔内加入200μl上述上清液,置荧光酶标仪下检测。
尽管青脓素是QS信号调控的毒力因子之一,但其产量的pH值和铁离子浓度的影响较大[11],因此我们在实验中同时监测pH,保持在5.0左右。
1.7鼠李糖脂的提取和测定
1.7.1铜绿假单胞菌培养[12]种子扩大培养:
挑取铜绿假单胞菌菌落接种于LB培养基中,37℃下振荡培养24h;铜绿假单胞菌发酵培养:
按3%比例接种于发酵培养基上,按1:
5(培养基体积/容积)接种于锥形瓶中,37℃下振荡培养54h后,分别予生理盐水和大蒜素共培养6h后终止。
改良发酵培养基配方:
LB培养基25.0g,NH4NO33.0g,K2HPO43.0g,KH2PO43.0g,MgSO4·7H2O0.2g,CaCl2·2H2O0.25g,定容至1L,pH6.5;1.0×105Pa灭菌15min。
1.7.2鼠李糖脂的提取[13]发酵培养液10000×g4℃离心15min去除菌体,上清液用1mol/LHCl调节pH至2.0,加入等体积氯仿/甲醇(2:
1)萃取3次,合并有机相,40℃旋转蒸发干,用0.05mol/LNaHCO3溶解。
1.7.3鼠李糖脂的测定采用蒽酮-硫酸法,置试管于冰浴中,加入0.2%蒽酮-浓硫酸显色剂4.0ml,沿着管壁缓慢滴加1.0ml提取试样并不断振荡散热,冷却后置沸水浴中加热15min,再冷却后于553nm波长处检测吸光度值[D(553)],以蒸馏水为空白对照。
标准曲线以鼠李糖为准定(0~200mg/L),测定出的鼠李糖含量乘以相关系数3.4[14]即为鼠李糖脂的含量。
1.8体外模型的构建[15]
挑取新鲜PAO1单菌落接种于LB培养液中,37℃、180r/min振荡培养过夜。
分光光度计测定菌液D(600)值,调整D(600)值至0.5。
接种PAO1菌液于预先放置无菌盖玻片(10mm×10mm,作为BF生长的载体)的24孔细胞培养板中,每孔1ml。
37℃培养7d,隔日换液。
即可形成熟的BF。
分别给予生理盐、大蒜素120μg/ml干预6h,每组重复3孔。
1.9CLSM观察大蒜素对成熟BF的影响
1.9.1荧光探针标记BF标本将各组模型从培养液中取出,每张玻片用1mlPBS水轻轻洗涤3次,除去BF表面的游离细菌。
在每张玻片BF表面滴加50µl配制好的荧光染液,37℃避光孵育15min,再用1mlPBS冲洗未结合荧光探针后,置CLSM观察。
1.9.2CLSM观察氩激光(488nm)激发,分别采用绿色通道接收绿色信号,红色通道接收红色信号,由BF游离面向BF与玻片附着面逐层扫描(沿Z轴扫描),每个标本取5个随机视野,每个视野扫描8~16层。
1.10统计学处理
实验数据以
±s表示,用SPSS10.0软件对所得的结果行正态性分布检验,均符合正态性分布,后进行方差分析。
2结果
2.1大蒜素对铜绿假单胞菌生长的影响
本实验的目的是考察对QS系统调控毒力因子的影响,因此实验浓度必须低于抑制细菌生长的浓度。
从生长曲线可以看出120μg/ml大蒜素干预后,稳定期稍微延迟,但对细菌生长没有影响(图1)。
图1大蒜素干预后对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响
2.2外毒素A含量、弹性蛋白酶活性以及青脓素的测定结果
大蒜素干预后,其毒力因子外毒素A、弹性蛋白酶以及青脓素分泌表达明显下调,见表1。
表1外毒素A含量、弹性蛋白酶活性、以及青脓素测定结果(
±s,n=8)
组别
外毒素A(pg/μl)弹性蛋白酶青脓素
生理盐水对照组
大蒜素120μg/ml组
19.630±0.5730.467±0.0039325.833±367.675
6.529±0.289*0.032±0.001*7819.167±111.800*
t
57.699354.28413.582
P值
0.00010.00010.0001
2.3鼠李糖脂测定
鼠李糖脂的分子结构中同时含有亲水性的基团-鼠李糖和疏水性基团-脂链,由于脂肪酸链的长度常有变化,因此在鼠李糖脂的定量分析中,通常用分析鼠李糖脂水解液中的鼠李糖的含量。
以鼠李糖质量浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘标准曲线图,标准回归曲线方程图见图2。
标准回归曲线方程为:
Y=0.006X-0.011,相关系数r=0.999,由图可见鼠李糖含量的高低与吸光度呈线形关系。
大蒜素作用后,鼠李糖脂的含量由(2.009±0.063)g/L下降到(0.269±0.009)g/L,其产量显著下降(P<0.01)。
图2鼠李糖标准回归曲线方程图
2.4CLSM观察大蒜素对成熟BF的影响
每组有3个标本,每个标本取随机视野3个,每个视野分红绿通道扫描8层。
进行图像横纵截面的叠加,红色信号代表死菌(死菌被PI着色而发出红色荧光),绿色信号代表活菌(活菌不被PI着色而被SYTO9着色发出绿色荧光),部分图像呈橙色或桔黄色,一般认为是死菌和活菌重叠造成。
生理盐水对照组可见细菌密集,层叠如集云状、棉絮样,细菌之间有不能被SYTO9/PI着色的黑色区域,呈管道或泡状。
死菌较多BF厚度较厚29µm左右,死菌与活菌混杂,可见BF表面粗糙不平,脊状突起;在大蒜素120μg/ml干预下,BF厚度有明显减少,约18µm左右,纵切面见呈扁平状,BF结构中不能被SYTO9/PI着色的区域较多,结构较稀疏,细菌散在分布(图4)。
AC为空白对照组;BD为大蒜素干预组
图4铜绿假单胞菌成熟BFCLSM纵、横扫描图
3讨论
QS系统在铜绿假单胞菌感染过程中发挥重要的调节和协调作用,调控毒力因子的表达。
铜绿假单胞菌拥有至少2个以上的群体感应系统,即las系统和rhl系统。
las系统由lasR(LuxR受体蛋白)和LasI(LuxI蛋白)组成,LasI是酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine-lactone,AHL)信号分子N-3-oxododecanoy1)-L-homoserinelactone(3-O-C12-HSL)的合成酶,3-O-C12-HSL与lasR结合后可激活QS调节基因的转录。
rhl系统与las系统相似,由信号分子合成酶和rhlR受体蛋白组成。
Las系统可调节如外毒素A、弹性蛋白酶、蛋白酶等的表达,Rhl系统能调节铜绿假单胞菌不同的细胞外毒力因子如鼠李糖脂、青脓素的表达,同时Rhl系统也为产生弹性蛋白酶、氰化物和碱性蛋白酶等提供最佳条件。
toxA基因编码毒素A,外毒素A为铜绿假单胞菌分泌的一种相对分子质量为66×103的单链多肽,具有ADP-核糖基转移酶活性,可以导致细胞内蛋白质合成受阻,干扰宿主的细胞免疫功能。
弹性蛋白酶由LasB基因编码,其成熟蛋白分泌至胞外,降解病灶细胞外基质,分解机体免疫分子,在铜绿假单胞菌感染过程中起到重要的作用。
RhlAB操纵子编码鼠李糖脂生成所需要的鼠李糖转移酶,而鼠李糖转移酶又是鼠李糖脂的产生和稳定σ因子所必须。
鼠李糖脂是维持微菌落间的通道所必需的,而且有助于成熟BF的形成,青脓素与哺乳动物转铁蛋白竞争铁,为细菌生长BF的形成提供足够营养物质,且作为QS系统的类似物,调控毒力因子的表达使铜绿假单胞菌分化为具三维结构的成熟生物膜,而这高度组织化的多细胞结构,对抗菌药物的抗性可提高10~1000倍[16-19]。
因此通过抑制QS系统来干扰依赖细胞间信号传递的毒力因子的产生及控制BF的分化是一种减少与铜绿假单胞菌定植和慢性感染有关的疾病的有效治疗方式。
本实验显示大蒜素显著减少外毒素A、弹性蛋白酶的表达,抑制鼠李糖脂、青脓素的产生,可能通过不同的途径来干扰QS系统:
如AHL分子与受体蛋白结合;抑制AHL分子的产生;灭活AHL分子;或者不是直接作用QS系统,而是作为调控子发挥转录后水平的抑制作用,如GacA蛋白、Vfr蛋白和RelA蛋白,这些还需进一步的探索。
在铜绿假单胞菌BF形成的起始阶段、黏附阶段、增值阶段是否有信号因子的参与尚不明确,但这些信号因子却参与BF的分化过程。
因此我们还考察大蒜素对BF分化的影响,从CLSM扫面图片中可见空白干预组BF结构不均匀,由类似蘑菇形状的微菌落形成,具有三维空间结构;而干预后结构变得稀疏,以散在分布为主。
铜绿假单胞菌细胞外毒力因子的产量与环境中的物质,如铁离子、pH、温度、渗透压培养基中氮源、碳源有关。
研究[9,20]显示外毒素A在最大通气、32℃、低浓度铁离子(0.05μg/ml)的TSB透析液中产量最高;PTSB培养基是最适合弹性蛋白酶产生的培养基,其产量比DTSB培养基和营养肉汤培养基高出至少4倍。
本研究即是采用了此两种培养基来提高两种物质的产量和活性的;不同的pH值对毒力因子表达影响的研究显示,青脓素在pH为5.0产量最高,随着pH增高,其产量下调[11],因此我们在实验中,监控培养基的pH变化,保持在5.0左右,避免混淆因素。
大蒜素[21]是一种天然抗菌药物,具有一定的抑制细菌和真菌的作用,并具有生物性能好、毒副作用小、无抗原性、具有氧自由基消除作用和抗氧化作用,同时因大蒜素在体内有一定的免疫调节作用,更有益于抗感染的治疗。
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[6]KozakKJ,SaelingerCB.PreparationofPseudomonase
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