凤眼莲叶绿素Fe钠盐制备条件的优选及稳定性研究论文.docx

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凤眼莲叶绿素Fe钠盐制备条件的优选及稳定性研究论文

科技创新论文（设计）

题目：

凤眼莲叶绿素亚铁钠盐制备条件的优化及稳定性研究

目录

摘要4

引言4

1实验材料与方法5

1.1材料5

1.1.1实验材料5

1.1.2实验试剂5

1.1.3实验用具5

1.1.4实验设备5

1.2方法5

1.2.1实验原理5

1.2.2实验注意事项6

1.2.3皂化与铁代实验的前期准备6

1.2.3.1材料的采集与培养6

1.2.3.2材料的预处理6

1.2.3.3浸提叶绿素6

1.2.3.4乙醇回收6

1.2.4皂化条件的探究7

1.2.4.1试管分组编号7

1.2.4.2皂化正交实验7

1.2.4.3皂化实验数据的测定与记录7

1.2.5铁代条件的探究7

1.2.5.1试管分组编号7

1.2.5.2叶绿素的重新提取与浓缩7

1.2.5.3皂化分离提取叶绿酸钠7

1.2.5.4调酸7

1.2.5.5铁代正交实验8

1.2.5.6铁代实验数据的测定与记录8

1.2.6叶绿素亚铁钠盐的制备8

1.2.6.1叶绿素亚铁钠盐制备流程简图8

1.2.6.2材料的预处理8

1.2.6.3叶绿素的提取8

1.2.6.4皂化分离提纯叶绿酸钠8

1.2.6.5叶绿素铁酸的制备8

1.2.6.6叶绿素铁钠的制备9

1.2.7叶绿素亚铁钠盐稳定性的研究9

1.2.7.1叶绿素亚铁钠盐溶液的配置与波长扫描9

1.2.7.2耐光性研究9

1.2.7.3耐热性研究9

1.2.7.4蔗糖的影响9

1.2.7.5氧化剂的影响9

1.2.7.6还原剂的影响10

1.2.7.7PH的影响10

2实验结果与分析10

2.1分析方法10

2.2实验结果分析10

2.2.1叶绿素产品的可见吸收光谱曲线10

2.2.2皂化实验结果分析10

2.2.2.1叶绿酸钠波普分析10

2.2.2.2皂化条件优选11

2.2.3铁代实验结果分析11

2.2.3.1叶绿素铁酸波谱分析11

2.2.3.2铁代条件优选11

2.2.4叶绿素亚铁钠盐稳定性研究实验结果分析13

2.2.4.1叶绿素亚铁钠盐波谱分析13

2.2.4.2耐光性研究结果分析13

2.2.4.3耐热性研究结果分析14

2.2.4.4蔗糖的影响14

2.2.4.5氧化剂的影响15

2.2.4.6还原剂的影响15

2.2.4.7PH值的影响16

3实验结论16

4讨论17

5参考文献：

18

6附录：

实验过程中部分图片19

凤眼莲叶绿素亚铁钠盐制备条件的优化及稳定性研究

摘要：

在叶绿素亚铁钠盐制备的实验过程中，研究表明最佳皂化条件为：

5%的氢氧化钠、控制温度60℃，皂化60min，皂化最完全。

在铁代反应中，将脱镁叶绿酸的PH值调至4.0，控制水浴温度80℃，铁代的Fe2+浓度为0.4mol/L，铁代处理60min，铁代最完全。

所制得的叶绿素亚铁钠盐对室内自然光、热、蔗糖、还原剂的耐受性较好，在PH为3—6的酸性环境中也较稳定，但色素的耐氧化性较差。

关键词：

凤眼莲叶绿素叶绿素亚铁钠盐皂化铁代稳定性

引言

凤眼莲（Eichhorniacrassipes（Mart.）Solms），俗称水葫芦（waterhyacinth），传入我国约有50年的时间，是天然的野生资源，因其繁殖速度极快的特点，广泛分布于各大江河湖泊中，成为一种入侵植物。

凤眼莲能起到净化水体的作用，国内外对其净化养殖、工业污水、生活污水的研究已取得了较多进展[1]-[3]。

在凤眼莲单一利用方式所产生的经济效益有限、彻底有效利用存在困难的情况下，加快开发可行的综合利用方式或新型利用方式迫在眉睫[4]。

凤眼莲叶片中含有丰富的天然绿色素——叶绿素。

叶绿素难溶于水，对光、热、酸敏感，性质不稳定，遇酸时中心金属镁被氢置换脱离成暗绿至暗褐色的脱镁叶绿素[5]。

因此叶绿素的应用范围有一定的局限性。

为增强叶绿素的稳定性，以扩大天然绿色素的应用范围，近些年人们掀起了对叶绿素衍生物研究的热潮。

叶绿素亚铁钠盐（Sodiumsaltofchlorophyllferrous）是一种叶绿素衍生物，其结构与血液中的血红素结构非常接近，在人体内的生物利用率很高[6]。

因此制备并研究叶绿素铁钠盐无论在食品工业上还是医药上都有重要的意义。

为了有效利用天然的生态资源，化害为利，本项目以凤眼莲为实验材料，基于吴荣金、林泽浩[7]等人对凤眼莲叶绿素的提取工艺的优化成果，从凤眼莲叶片中提取叶绿素。

并经过对叶绿素进一步皂化、酸化、铁代、成盐等过程，将叶绿素制备成水溶性的叶绿素亚铁钠盐，并研究叶绿素亚铁钠盐的稳定性。

1实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验材料

新鲜的凤眼莲叶（材料采自衡阳市苗圃公园水潭）

1.1.2实验试剂

95%的乙醇、碳酸钙粉末、石油醚、1mol/L的盐酸、5%的氢氧化钠-乙醇溶液、蒸馏水、丙酮、氢氧化钠溶液（质量分数分别为1.0%、2.5%、5.0%）、硫酸亚铁溶液（浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L）、蔗糖溶液（浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、过氧化氢溶液（浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L）、亚硫酸钠溶液（浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L）

1.1.3实验用具

研钵、各种大小的烧杯、试剂瓶、移液管、胶头滴管、定容瓶、洗耳球、比色皿、试管、试管架、剪刀、玻璃棒、布氏漏斗、分液漏斗、各种型号注射器、各种精度的PH试纸、滤纸、标签纸

1.1.4实验设备

粉碎机、旋转蒸发仪（201D-II,郑州长城科工贸有限公司）、循环水式多用真空泵（SHB-III,郑州长城科工贸有限公司）、低压抽滤器、恒温水浴锅（HH-S,江苏国胜实验仪器厂）、紫外可见721型分光光度计、真空干燥箱、分析天平

1.2方法

1.2.1实验原理

叶绿素的结构为一个镁与四个吡咯环上的氮结合以卟啉为骨架的绿色色素[5]。

在叶绿素的分子结构中，含有一个由4个吡咯环和4个次甲基交替相连形成的卟吩环，四个吡咯环中的氮原子可以共价键和配位键与不同的金属结合，在叶绿素中结合的是镁。

叶绿素的主要成分是叶绿素a和叶绿素b的镁的配合物（a:

b一般为3:

1）,其卟啉环的4个吡咯环上的氮与镁相结合，它们都是双羧酸的酯，一个为甲基所酯化，另一个为叶绿醇所酯化，所以可发生皂化反应[8]。

由于镁和叶绿素分子核结合的很不牢固，在弱酸环境下，镁极易被氢取代，生成脱镁叶绿酸。

脱镁叶绿酸又能很快与其他的金属如铜、铁或锌的盐反应，金属离子进入原来的镁的位置，生成叶绿素铜酸、叶绿素锌酸或叶绿素铁酸等叶绿素衍生物。

它们在碱性环境中均能发生皂化反应生成叶绿酸盐，其绿色依旧，水溶性增大，稳定性增强[9]。

1.2.2实验注意事项

叶绿素在高温，光照环境下不稳定，因此提取出的叶绿素应放置冰箱避光保存。

由于皂化和铁代是叶绿素亚铁钠盐制备过程中的关键步骤，为减少实验的偶然性因素带来的误差，确保筛选出最优皂化和铁代条件，本项目在筛选皂化和铁代条件时，选用新鲜的凤眼莲叶进行实验。

考虑到实验仪器的局限性，在制备叶绿素亚铁钠盐以研究稳定性时，使用于室内阴干至水分约为10%的凤眼莲叶实验。

浓缩叶绿素提取液，进行乙醇回收时，为保存叶绿素的活性，温度需控制在60℃以下。

叶绿素不稳定，新鲜的叶绿素提取液不宜保存太久。

为减少实验误差，在进行铁代条件探究实验时，应重新提取新鲜叶片的叶绿素。

在整个实验中，尽量避免强光。

1.2.3皂化与铁代实验的前期准备

1.2.3.1材料的采集与培养

到衡阳市苗圃公园的水潭中打捞凤眼莲植株，移入实验室。

将凤眼莲放入洁净的塑料盆，加入适量自来水（浸没根部及部分茎部为宜）进行水培，及时换水补水，维持凤眼莲的正常生命活动和生长，为实验准备足够的新鲜实验材料。

1.2.3.2材料的预处理

在皂化和铁代实验阶段，根据实验进度，取适量新鲜叶片，用清水洗净，稍轻甩叶片，尽量减少叶片上的水珠，并于室内晾1-2小时，待叶片无残留水后，用剪刀剪碎。

用分析天平称量，记录实验材料的用量。

1.2.3.3浸提叶绿素

本实验采用吴荣金，林泽浩[7]等人对凤眼莲叶绿素的提取研究所得的最佳工艺（用95%的乙醇按1:

5的料液比，浸提温度60℃，浸提时间5h）。

将乙醇注入蒸馏水中，按19:

1（体积比）混合，搅拌均匀，配成95%的乙醇—水溶液，备用。

将称量好的叶片置于研钵中，加入适量碳酸钙粉末和95%的乙醇，充分研磨。

之后，将研磨好的叶片转移至洁净的烧杯中，并继续加95%的乙醇，使材料的质量与加入的提取剂体积比为1:

5。

避光静置提取5小时，低压过滤并收集滤液。

取1mL滤液，用95%乙醇稀释定容至10mL，以95%乙醇做参比，进行波长扫描。

1.2.3.4乙醇回收

将滤液转移至旋转蒸发仪，控制温度为55℃，进行低压旋转蒸馏，浓缩至原体积的3/10左右时停止蒸馏。

用磨口试剂瓶收集混合液，贴上标签，放置冰箱低温避光保存，待用。

1.2.4皂化条件的探究

本实验部分主要参考王立娟[6]、杨挺[10]等人对叶绿素皂化的正交实验方法。

1.2.4.1试管分组编号

取27只试管均分成三组（三个平行组），并按顺序编号为1-9，贴上标签（标签内容包括编号、实验条件等），放置于试管架。

1.2.4.2皂化正交实验

用注射器分别取4ml叶绿素浓缩液，并注入每只试管中，按照表1分别加入1ml质量分数为1.0%、2.5%、5.0%的氢氧化钠溶液，设置条件，进行正交实验。

1.2.4.3皂化实验数据的测定与记录

反应后，取1mL皂化液，用蒸馏水稀释至10mL，并以蒸馏水做空白对照，调零。

在波长340nm-700nm间对一号试管中的皂化液进行波长扫描，确定吸收峰，于吸收峰处分别测定皂化液的吸光值，记录并处理实验数据，得出皂化条件。

1.2.5铁代条件的探究

本实验部分主要基于孟会娟[9]、王立娟[11]等人对叶绿素金属衍生物制备的基本反应原理，参考杨挺[10]等人对叶绿素皂化的正交实验方法，进行正交实验。

1.2.5.1试管分组编号

取45只型号一致的试管，洗净，烘干。

按顺序分别编号为1-45，置于试管架上。

1.2.5.2叶绿素的重新提取与浓缩

重新称取60g新鲜凤眼莲叶，充分研磨，用同样的方法，提取并浓缩叶绿素。

1.2.5.3皂化分离提取叶绿酸钠

将叶绿素混合液与氢氧化钠按体积比为4:

1充分混合，根据已得出的结论设置皂化条件进行皂化。

将叶绿素皂化液转移至分液漏斗，加入等体积的石油醚，充分振荡，静置，分层，萃取其中的脂溶性杂质，收集下层的叶绿素层（主要为叶绿酸钠），并反复萃取几次。

1.2.5.4调酸

将上述的叶绿素层用1mol/L的盐酸调节PH值到6.0-6.5，呈弱酸性。

加热到65℃，搅拌1h，此时生成脱镁叶绿素钠。

将脱镁叶绿素钠混合液均分至三个烧杯，贴上标签。

再次向混合液滴加盐酸，分别调节PH为2、3、4，并搅拌反应1h。

此时生成脱镁叶绿素酸。

1.2.5.5铁代正交实验

按表2，分别将不同PH值的脱镁叶绿素酸加入已编号的试管，进行正交实验。

（加入的叶绿素酸与硫酸亚铁溶液的体积比为5:

1。

）

1.2.5.6铁代实验数据的测定与记录

取一号试管，并在340nm-700nm范围内对其进行波长扫描，绘制并分析波谱图，并与皂化后的波谱图进行分析比较，确定吸收峰为405nm；于405nm处测定并记录每号试管中叶绿素铁酸的吸光值。

1.2.6叶绿素亚铁钠盐的制备

本实验部分主要参考王立娟等以竹叶[6]、松针[11]为材料，制备叶绿素铁钠盐的工艺流程，制备叶绿素亚铁钠盐。

1.2.6.1叶绿素亚铁钠盐制备流程简图

阴干的凤眼莲叶→粉碎机粉碎→浸泡发软→乙醇浸提→低压过滤→浓缩→皂化（叶绿酸钠）→石油醚萃取→调酸（脱镁叶绿素酸）→铁代→抽滤水洗（叶绿素铁酸）→溶解→加碱→成盐→过滤→干燥→产品（叶绿素亚铁钠盐）

1.2.6.2材料的预处理

将从新鲜凤眼莲上采摘的叶片用清水洗净，置于室内通风的环境下阴干至含水量为10%左右（35℃左右的气温下阴干约需36h）。

除去发黄的叶片，剪碎，并置于粉碎机中粉碎。

1.2.6.3叶绿素的提取

称取100g凤眼莲叶片粉末，将其置于1000mL烧瓶中，加入适量的水拌匀,使水浸没叶片粉末为宜，放置过夜，使其充分发软。

加500mL、95%的乙醇提取5h，抽滤。

再用同样的方法萃取第二次，合并滤液。

将滤液转入旋转蒸发仪，控制安全温度为55℃，低压旋转蒸馏，以确保叶绿素不被破坏。

蒸至原混合液体积的3/10左右，停止蒸馏，得叶绿素的浓缩液。

1.2.6.4皂化分离提纯叶绿酸钠

将上述叶绿素浓缩液转入大烧杯，并按体积比4:

1滴加5%的氢氧化钠，60℃下恒温水浴，皂化60min。

冷却后转入分液漏斗，加入等体积的石油醚，激烈震摇，以萃取其中的不造化物和未皂化的叶绿素。

静置分层，不皂化物及未皂化物集中在上层的有机层，下层为叶绿素皂化层。

放出下层液体，并反复萃取两次。

此时的皂化叶绿素已成叶绿酸钠。

1.2.6.5叶绿素铁酸的制备

将叶绿酸钠用1mol/L的盐酸调节PH值至6—6.5呈弱酸性，加热至65℃，搅拌1h，此时生成脱镁叶绿素钠，再调节PH至4.0，搅拌反应1h，生成脱镁叶绿素酸。

在脱镁叶绿素酸液中按体积比5:

1滴加0.4mol/L的硫酸亚铁溶液，80℃下水浴加热60min。

过滤，用蒸馏水洗涤固体，以除去盐类，60℃下真空干燥得叶绿素铁酸。

1.2.6.6叶绿素铁钠的制备

将叶绿素铁酸溶于丙酮，过滤，除去盐类。

向滤液中加入5%的乙醇—氢氧化钠液，调节PH至9，溶液开始变稠，析出晶体，继续调节PH至10，析晶1h。

抽滤，水洗，真空干燥（60℃），得2.375g墨绿色有金属光泽的晶体。

1.2.7叶绿素亚铁钠盐稳定性的研究

在对叶绿素亚铁钠盐稳定性研究实验部分，基于吴荣金，林泽浩[7]等人对凤眼莲叶绿素稳定性研究结论，主要参考王立娟[6]、[11]、王晓[8]、杨挺[10]等人对叶绿素金属衍生物稳定性的研究方法，对比分析，探究叶绿素亚铁钠盐的稳定性。

1.2.7.1叶绿素亚铁钠盐溶液的配置与波长扫描

取干燥的叶绿素亚铁钠盐0.1g，稀释定容至1000mL，配置成0.1g/L的叶绿素亚铁钠水溶液，并放置冰箱低温保存，以备实验之用。

取一管叶绿素亚铁钠盐溶液，在340nm至700nm波长下进行波长扫描，并进行波普分析。

1.2.7.2耐光性研究

等量量取5mL的色素溶液三份于试管中，贴上标签，密封试管口，并分别置于黑暗处、室内自然光、室外强光3天，观察溶液的颜色变化，于402nm波长下测定吸光值，记录并处理数据。

1.2.7.3耐热性研究

分别取等量的5mL色素溶液十五份，分成三个平行组进行实验，再分别将各溶液置于20℃、35℃、50℃、65℃、80℃下水浴加热30min，于402nm波长下测定吸光值，记录并处理数据。

1.2.7.4蔗糖的影响

分别取等量的5mL色素溶液十五份，分成三个平行组进行实验，再分别向各试管中加1mL蔗糖溶液（五个质量分数分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%），1h后于402nm波长下测定吸光值，记录并处理数据。

1.2.7.5氧化剂的影响

分别取等量的5mL色素溶液十五份，分成三个平行组进行实验，再分别向各试管中加1mL双氧水溶液（五个浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L），于1h后在402nm波长下测定吸光值，记录并处理数据。

1.2.7.6还原剂的影响

分别取等量的5mL色素溶液十五份，分成三个平行组进行实验，再分别向各试管中加1mL亚硫酸钠溶液（五个浓度分别为0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L），于1h后在402nm波长下测定吸光值，记录并处理数据。

1.2.7.7PH的影响

分别取等量的20mL色素溶液18份，置于小烧杯中，分成三个平行组实验。

实验前测定色素的PH值。

然后用1mol/L的盐酸或氢氧化钠分别调节色素溶液的PH至3、5、6、8、10、12,2h后于402nm波长下测定吸光值，记录并处理数据。

2实验结果与分析

2.1分析方法

本实验采用正交试验法、波普分析法、对比试验法

2.2实验结果分析

2.2.1叶绿素产品的可见吸收光谱曲线

图1.四种叶绿素产品可见吸收光谱图

Fig1.Absorptionspectraoffourchlorophyllproducts

2.2.2皂化实验结果分析

2.2.2.1叶绿酸钠波普分析

叶绿素经皂化反应后，得到叶绿酸钠，由叶绿酸钠的波长扫描图可知，叶绿酸钠在651nm处有一个明显的吸收峰。

与叶绿素的吸收光谱曲线相比，叶绿酸钠的吸收光谱曲线向低波长方向发生蓝移。

因此实验选取在651nm处测定叶绿素皂化液的吸光值，吸光值越大，则皂化效果越好。

2.2.2.2皂化条件优选

表1：

叶绿素皂化正交实验

Table1:

Orthogonaltestonsaponificationofchlorophyll

实验号

A

B

C

吸光值

NaOH质量分数∕%

温度∕℃

时间∕min

1

1

60

30

0.561

2

1

70

60

0.490

3

1

80

90

0.466

4

2.5

60

60

0.772

5

2.5

70

90

0.630

6

2.5

80

30

0.385

7

5

60

90

0.629

8

5

70

30

0.632

9

5

80

60

0.669

T1

1.517

1.962

1.587

5.234

T2

1.787

1.752

1.931

T3

1.93

1.52

1.725

range

0.137

0.147

0.115

／

由正交实验表1可知，最优组合为A3B1C2。

即用质量分数为5%的氢氧化钠，60℃下水浴加热60min为叶绿素的最佳皂化条件。

由各因素的极差关系RB>RA>RC可知，皂化温度是影响皂化反应的主要因素，其次是氢氧化钠的质量分数，再次为皂化时间。

2.2.3铁代实验结果分析

2.2.3.1叶绿素铁酸波谱分析

脱镁叶绿酸经铁代反应后，得叶绿素铁酸，由叶绿素铁酸波长扫描可知，叶绿素铁酸在405nm和648nm处均有吸收峰，且在405nm处的吸收峰明显，吸光值最大。

与叶绿素及叶绿酸钠的吸收光谱曲线相比，叶绿素铁酸的吸收光谱曲线下移。

故实验在405nm处测定铁代后溶液的吸光值，吸光值越小，则铁代越完全。

2.2.3.2铁代条件优选

表2：

叶绿素铁代正交表

Table2.OrthogonaltestonironsubstitutionofSodiumsaltofchlorophyllferrous

实验号

A

B

C

D

PH值

温度∕℃

时间∕min

Fe2+∕mol·L-1

吸光值

1

2

40

20

0.1

1.038

2

2

60

40

0.1

0.817

3

2

80

60

0.1

0.205

4

2

40

20

0.2

1.076

5

2

60

40

0.2

0.745

6

2

80

60

0.2

0.231

7

2

40

20

0.3

0.910

8

2

60

40

0.3

0.690

9

2

80

60

0.3

0.194

10

2

40

20

0.4

0.892

11

2

60

40

0.4

0.613

12

2

80

60

0.4

0.187

13

2

40

20

0.5

0.841

14

2

60

40

0.5

0.620

15

2

80

60

0.5

0.176

16

3

40

40

0.1

0.476

17

3

60

60

0.1

0.422

18

3

80

20

0.1

0.162

19

3

40

40

0.2

0.396

20

3

60

60

0.2

0.417

21

3

80

20

0.2

0.197

22

3

40

40

0.3

0.342

23

3

60

60

0.3

0.286

24

3

80

20

0.3

0.184

25

3

40

40

0.4

0.284

26

3

60

60

0.4

0.187

27

3

80

20

0.4

0.155

28

3

40

40

0.5

0.268

29

3

60

60

0.5

0.323

30

3

80

20

0.5

0.138

31

4

40

40

0.1

0.297

32

4

60

60

0.1

0.289

33

4

80

20

0.1

0.127

34

4

40

40

0.2

0.377

35

4

60

60

0.2

0.255

36

4

80

20

0.2

0.125

37

4

40

40

0.3

0.231

38

4

60

60

0.3

0.212

39

4

80

20

0.3

0.110

40

4

40

40

0.4

0.239

41

4

60

60

0.4

0.198

42

4

80

20

0.4

0.123

43

4

40

40

0.5

0.233

44

4

60

60

0.5

0.200

45

4

80

20

0.5

0.373

K1

9.235

7.9

6.451

3.833

16.861

K2

4.099

6.274

6.628

3.819

K3

3.527

2.687

3.782

3.159

K4

／

／

／

2.878

K5

／

／

／

3.172

range

1.903

1.738

0.949

0.191

／

从正交表2可知，铁离子在酸化PH值为4，铁代温度为80℃，铁代时间为60min，Fe2+浓度为0.4mol/L时铁代最完全。

由各因素的极差关系RA>RB>RC>RD可知，铁代PH值是影响铁代反应的主要因素，其次是铁代温度，再次是铁代时间，最后是亚铁离子的浓度。

2.2.4叶绿素亚铁钠盐稳定性研究实验结果分析

2.2.4.1叶绿素亚铁钠盐波谱分析

本实验所制得的叶绿素亚铁钠盐溶液在340~700nm范围内测定吸收光谱曲线，由图1可知，叶绿素亚铁钠盐在402nm和665nm处分别有吸收峰，所测得的吸收峰与参考文献[11]所测定的结果基本一致，与叶绿素的光谱曲线相比，最大吸收峰的位置发生蓝移。

2.2.4.2耐光性研究结果分析

图2.光照对色素的影响

Fig2.The