第21章常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt
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目录目录常用分子生物学技术的常用分子生物学技术的原理及应用原理及应用ThePrincipleandApplicationofCommonUsedTechniquesinMolecularBiology第第21章章目录目录第一节第一节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique目录目录n核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在在DNA复复性性过过程程中中,如如果果把把不不同同DNA单单链链分分子子放放在在同同一一溶溶液液中中,或或把把DNA与与RNA放放在在一一起起,只只要要在在DNA或或RNA的的单单链链分分子子之之间间有有一一定定的的碱碱基基配配对对关关系系,就就可可以以在在不不同同的的分分子子之之间间形形成杂化双链成杂化双链(heteroduplex)。
一、分子杂交与印迹技术的原理一、分子杂交与印迹技术的原理目录目录复性复性RNADNA目录目录
(一)印迹技术
(一)印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上,使之成为固相化分子。
等各种膜上,使之成为固相化分子。
这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹,因此称之为此称之为“blotting”,译为印迹技术。
,译为印迹技术。
目录目录用放射性核素、生物素或荧光染料标记其用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针探针”,探针可以与固定在,探针可以与固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。
酸结合,判断是否有同源的核酸分子存在。
(二)探针技术
(二)探针技术目录目录二、印迹技术的类别及应用二、印迹技术的类别及应用
(一)
(一)DNA印迹印迹(SouthernBlotting)
(二)
(二)RNA印迹印迹(NorthernBlotting)(三)蛋白质的印迹(三)蛋白质的印迹(WesternBlotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
、重组质粒和噬菌体的分析。
用于用于RNA的定性定量分析。
的定性定量分析。
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
目录目录n其他:
其他:
斑点印迹斑点印迹(dotblotting)原位杂交原位杂交(insituhybridization)DNA点阵点阵(DNAarray)DNA芯片技术芯片技术(DNAchip)三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较分子杂交实验分子杂交实验目录目录放放射射自自显显影影照照片片目录目录DNA点阵点阵目录目录第二节第二节聚合酶链反应聚合酶链反应PolymeraseChainReaction目录目录5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA一、一、PCR技术的技术的工作原理工作原理55555555目录目录Cycle355555555555555552530次循环后,模板次循环后,模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。
万倍以上。
目录目录模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶dNTPsMg2+nPCR体系基本组成成分体系基本组成成分目录目录nPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性9595CC延伸延伸72C退火退火Tm-5C目录目录利利用用特特异异性性引引物物以以cDNA或或基基因因组组DNA为为模模板板获获得得已已知知目目的的基基因因片片段段,或或与与逆逆转转录录反反应应相相结结合合,直直接以组织和细胞的接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段;为模板获得目的片段;利利用用简简并并引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中获获得得序列相似的基因片段;序列相似的基因片段;利利用用随随机机引引物物从从cDNA文文库库或或基基因因组组文文库库中中克克隆隆基因。
基因。
二、二、PCR技术技术的主要用途的主要用途
(一)目的基因的克隆
(一)目的基因的克隆目录目录利利用用PCR技技术术可可以以随随意意设设计计引引物物在在体体外外对对目目的的基基因因片片段段进进行行嵌嵌和和、缺缺失失、点点突突变等改造。
变等改造。
PCR技技术术高高度度敏敏感感,对对模模板板DNA的的量量要要求求很很低低,是是DNA和和RNA微微量量分分析析的的最好方法。
最好方法。
(三)(三)DNA和和RNA的微量分析的微量分析
(二)基因突变
(二)基因突变目录目录将将PCR技技术术引引入入DNA序序列列测测定定,使使测测序序工作大为简化,也提高了测序的速度;工作大为简化,也提高了测序的速度;待待测测DNA片片段段既既可可克克隆隆到到特特定定的的载载体体后后进行序列测定,也可直接测定。
进行序列测定,也可直接测定。
PCR与与其其他他技技术术的的结结合合可可以以大大大大提提高高基基因突变检测的敏感性因突变检测的敏感性。
(四)(四)DNA序列测定序列测定(五)基因突变分析(五)基因突变分析目录目录逆转录逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)是将是将RNA的逆转录反应和的逆转录反应和PCR反应联合反应联合应用的一种技术。
应用的一种技术。
RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分进行定性及半定量分析的最有效方法。
析的最有效方法。
(一)逆转录
(一)逆转录PCR技术技术三、几种重要的三、几种重要的PCR衍生技术衍生技术目录目录原原位位PCR(insituPCR)是是在在组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片上上的的单单个个细细胞胞内内进进行行的的PCR反反应应,然然后后用用特特异异性性探探针针进进行行原原位位杂杂交交,即即可可检检出出待待测测DNA或或RNA是否在该组织或细胞中存在。
是否在该组织或细胞中存在。
原原位位PCR方方法法弥弥补补了了PCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足,是是将将目目的的基基因因的的扩扩增增与与定定位位相相结结合合的的一一种最佳方法。
种最佳方法。
(二)原位
(二)原位PCR技术技术目录目录(三)实时(三)实时PCR技术技术实实时时PCR(real-timePCR)技技术术通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量,消消除除了了产产物物堆堆积积对定量分析的干扰,亦被称为定量对定量分析的干扰,亦被称为定量PCR。
目录目录n实时实时PCR技术原理技术原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物荧光标记引物荧光标记引物RQ3355目录目录第三节第三节核酸序列分析核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis目录目录n核酸序列分析的基本原理:
核酸序列分析的基本原理:
化学裂解法化学裂解法(Maxam-Gillbert法法)DNA链的末端合成终止法链的末端合成终止法(Sanger法法)目录目录一、一、DNA链末端合成终止法链末端合成终止法目录目录GATC测序反应测序反应电泳电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA53正极正极负极负极ddGddAddTddCn链末端合成终止法测定链末端合成终止法测定DNA序列的原理序列的原理目录目录二、二、DNA自动测序自动测序采采用用荧荧光光替替代代放放射射性性核核素素标标记记是是实实现现DNA序序列列分分析析自自动动化化的的基基础础。
用用不不同同荧荧光光分分子子标标记记四四种种双双脱脱氧氧核核苷苷酸酸,然然后后进进行行Sanger测测序序反反应应,反反应应产产物物经经电电泳泳(平平板板电电泳泳或或毛毛细细管管电电泳泳)分分离离后后,通通过过四四种种激激光光激激发发不不同同大大小小DNA片片段段上上的的荧荧光光分分子子使使之之发发射射出出四四种种不不同同波波长长荧荧光光,检检测测器器采采集集荧荧光信号,并依此确定光信号,并依此确定DNA碱基的排列顺序。
碱基的排列顺序。
目录目录ddGddAddTddC红色红色荧光荧光绿色绿色荧光荧光黄色黄色荧光荧光蓝色蓝色荧光荧光电泳电泳DNA序列自动分析原理及结果图序列自动分析原理及结果图目录目录第四节第四节基因文库基因文库GeneLibrary目录目录基因组基因组DNA文库文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库文库(cDNAlibrary)n基因文库基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部是指一个包含了某一生物体全部DNADNA序列序列的克隆群体。
的克隆群体。
目录目录一、基因组一、基因组DNA文库文库基因组基因组DNADNA文库是指生物的文库是指生物的基因组基因组DNA的的信息(包括所有的编码区和非编码区)以信息(包括所有的编码区和非编码区)以DNA片段形式贮存的克隆群体。
片段形式贮存的克隆群体。
用于构建基因组文库的载体有用于构建基因组文库的载体有噬菌体、噬菌体、粘粒和酵母人工染色体等。
粘粒和酵母人工染色体等。
目录目录n基因组文库和基因组文库和cDNA文库的构建和筛选文库的构建和筛选目录目录第一轮筛选第一轮筛选第二轮筛选第二轮筛选第三轮筛选第三轮筛选n基因组文库筛选结果举例基因组文库筛选结果举例目录目录cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部件下所表达的全部mRNAmRNA经逆转录而合成的经逆转录而合成的cDNA序列序列的克隆群体,它以的克隆群体,它以cDNA片段的形片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。
式贮存着该组织细胞的基因表达信息。
二、二、cDNA文库文库目录目录第五节第五节生物芯片技术生物芯片技术BiologicalChipTechnique目录目录是指将许多特定的是指将许多特定的DNADNA片段有规律地紧密排片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧列固定于单位面积的支持物上,然后与待测的荧光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等光标记样品进行杂交,杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的对芯片进行扫描,通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出荧光信号做出检测、比较和分析,从而迅速得出定性和定量的结果。
该技术亦被称作定性和定量的结果。
该技术亦被称作DNA微阵列微阵列(DNAmicroarray)。
一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(genechip)目录目录n基因芯片工作流程示意图基因芯片工作流程示意图目录目录是是将将高高度度密密集集排排列列的的蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针点点阵阵固固定定在在固固相相支支持持物物上上,当当与与待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时,可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白,再再经经检检测测系系统统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片蛋白质分子间的亲和反应蛋白质分子间的亲和反应n蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)n蛋白质芯片蛋白质芯片作用原理作用原理目录目录第六节第六节生物大分子相互作用研究技术生物大分子相互作用研究技术TheMethodofProtein-proteinandProtein-DNAInteractionStudy目录目录一、蛋白质相互作用研究技术一、蛋白质相互作用研究技术酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析(标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等)各种亲和分析(标签蛋白沉淀、免疫共沉淀等)荧光共振能量转换效应分析荧光共振能量转换效应分析噬菌体显示系统筛选噬菌体显示系统筛选n常用蛋白质相互作用的研究技术常用
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- 21 常用 分子生物学 技术 原理 及其 应用
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