大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析学士学位论文.docx
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大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析学士学位论文
硕士学位论文
大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析
张文杰
指导教师
章元明教授
专业名称
作物遗传育种
研究方向
大豆耐逆遗传与生物统计
答辩日期
2012年6月
Evaluationandassociationmappingforsoybeansalt-alkalinetoleranceatseedingstage
By
ZhangWenjie
TheThesisSubmittedto
NanjingAgriculturalUniversity
NanjingP.R.China
InPartialFulfillmentoftheRequirements
for
TheMasterDegree
Supervised
By
Prof.ZhangYuan-Ming
CompletedinJune2012
原创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果。
除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。
学位论文作者(需亲笔)签名:
年月日
学位论文版权使用授权书
本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。
本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。
保密□,在年解密后适用本授权书。
本学位论文属于不保密□。
(请在以上方框内打“√”)
学位论文作者(需亲笔)签名:
年月日
导师(需亲笔)签名:
年月日
目录
摘要I
ABSTRACTIII
符号说明(英文缩略词)V
第一章文献综述1
1.盐碱胁迫对大豆生长的影响1
1.1盐胁迫对大豆生长发育的影响1
1.2碱胁迫对大豆生长发育的影响1
2大豆耐盐、碱性鉴定及大豆种质资源耐盐、碱性评价2
2.1大豆耐盐碱性鉴定2
2.1.1耐盐碱的鉴定方法2
2.1.1.1田间鉴定2
2.1.1.2室内鉴定2
2.1.2大豆盐害鉴定指标3
2.1.2.1相对盐害指数法3
2.1.2.2形态伤害评价法3
2.1.2.3综合指数法4
2.1.2.4测定钠离子、氯离子浓度法4
2.2大豆种质资源耐盐碱性评价5
3大豆耐盐性遗传、QTL定位和耐盐机理研究进展5
3.1经典遗传学研究5
3.1.1单基因控制5
3.1.2多基因控制6
3.2大豆耐盐碱QTL定位的研究进展6
3.2.1大豆耐盐性QTL定位研究进展7
3.2.2大豆耐碱性QTL定位研究进展8
3.3大豆耐盐机理研究进展9
3.3.1盐胁迫下盐离子的吸收、外排和转运9
3.3.2渗透调节机制9
3.3.3野生大豆的耐盐机理10
4关联分析的研究进展10
4.1关联分析的原理10
4.1.1连锁不平衡11
4.1.2连锁不平衡的度量11
4.1.3影响连锁不平衡的因素及LD衰减12
4.2关联分析特点13
4.3关联分析的方法、步骤与注意事项13
4.3.1关联分析的方法13
4.3.2关联分析的步骤15
4.3.3关联分析需注意的问题16
4.4关联分析在大豆中的应用17
5本研究的目的与研究内容18
第二章试验材料与分析方法21
1材料与方法21
1.1实验材料21
1.2大豆幼苗期耐盐碱相关性状考察21
1.3SSR全基因组扫描21
1.3.1实验仪器21
1.3.2DNA提取21
1.3.2.1试剂配制21
1.3.2.2DNA提取步骤22
1.3.3PCR扩增22
1.3.4凝胶电泳检测23
1.3.4.1试剂配制23
1.3.4.2凝胶电泳24
2数据的分析方法25
2.1表型数据分析25
2.2连锁不平衡分析25
2.3群体结构分析26
2.4关联分析26
第三章结果与分析29
1大豆幼苗期耐盐碱相关性状的表型特征、方差及相关分析29
1.1大豆幼苗期耐盐碱相关性状的表型特征分析29
1.2方差分析31
1.3相关和偏相关分析33
1.4连锁不平衡分析33
2大豆幼苗期耐盐碱性鉴定35
3、盐碱指数的定位结果38
3.1主根长耐盐、碱指数结果38
3.2根鲜重耐盐、碱指数结果38
3.3根干重耐盐、碱指数结果39
3.4下胚轴长耐盐、碱指数结果39
3.5幼苗生物量耐盐、碱指数结果43
4原始表型性状的定位结果43
4.1主根长定位结果44
4.2下胚轴长定位结果44
4.3根干重定位结果45
4.4根鲜重定位结果48
4.5优异等位基因的挖掘48
第四章讨论51
1.与前人耐盐、碱性QTL定位结果的比较51
2.相关分析与QTL成簇现象52
3.与拟南芥耐盐、碱基因的比较54
4.与现有大豆耐盐、碱基因的比较55
5.指数与原始性状定位结果的比较58
6方法间的比较63
第五章全文结论及创新点65
1全文结论65
2创新点66
参考文献67
附表79
致谢81
攻读硕士期间发表的学术论文82
大豆幼苗期耐盐碱性的鉴定与关联分析
摘要
土壤盐碱化是世界范围内影响农作物生产的主要非生物胁迫因子,同时也是降低作物产量的主要因子。
全世界大概有20%的农业灌溉用地受到盐碱的影响。
近年来,由于不合理农业灌溉进一步加重了耕地盐碱化。
为保持大豆在盐碱化土壤环境的持续生产,培育新品种是一种有效途径。
然而,其先决条件是解析大豆耐盐碱性的遗传机制。
大豆耐盐碱性遗传研究主要是利用双亲分离群体,其结果对作物育种贡献有限。
为克服这一缺陷,利用品种资源群体进行关联分析是一种有效的方式。
为此,本研究以分层随机抽样方法抽取的257份大豆品种为研究材料,在大豆幼苗期分别以浓度为100mM的NaCl溶液和10mM的Na2CO3溶液作为盐、碱处理液,以蒸馏水处理作为对照,大豆幼苗期主根长、下胚轴长、根鲜重、根干重和幼苗生物量的表型值以及各性状的耐盐、碱指数为指标,鉴定各大豆品种的耐盐碱性;利用135个SSR标记扫描该品种群体获得分子标记数据,通过上位性关联分析方法(EAM)和两种改进的压缩混合线性模型方法(ECMLMA和ECMLM)进行大豆耐盐碱性的关联分析;利用关联分析结果,发掘优异等位基因与载体品种,并实施设计育种。
其主要结果如下:
1、以大豆幼苗期根鲜重耐盐和耐碱指数为指标,鉴定出两年表现基本一致、重复性好的耐盐品种2个:
枫紫田岸豆和白秋1号;鉴定出耐碱品种8个:
临安八月白、嵊县田埂豆、遵义棕子豆、北川乌眼窝、枫紫田岸豆、广西大粒豆、合豆6号和冀豆13。
枫紫田岸豆既耐盐又耐碱。
2、以耐盐碱指数为指标,通过ECMLM方法检测到129个QTLs,其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有35、24、19、33和18个;通过EAM方法共检测到154个QTLs,其中主根长、根鲜重、根干重、下胚轴长和幼苗生物量分别有28、31、22、33和40个。
两种方法共同检测到30个QTLs,以QTL×环境互作为主,贡献率为0.68%-9.38%。
以原始观测值为指标,通过ECMLMA、ECMLM和EAM方法共同检测到20个QTLs,其中主根长、下胚轴长、根干重和根鲜重分别有6、10、1和3个。
上述两种结果间既有相同的QTL,又有一定的互补性。
本研究获得的大豆耐盐碱性部分关联标记与拟南芥耐盐基因的大豆同源基因连锁,例如satt453、satt656、satt411、satt687、satt256、satt413、sat_153、satt672和satt102。
3、利用关联分析结果,估计各QTL的等位基因效应,挖掘优异等位基因与载体品种,例如,主根长耐盐与耐碱指数减效最大的等位变异分别为353bp(sat_256)和401bp(sat_344),其载体品种分别为德兴老鼠牙和徐豆10号。
发现白秋1号和北川乌眼窝均携带耐盐、耐碱的优异等位变异,具有育种利用价值。
关键词:
大豆;耐盐碱性;抗性鉴定;关联分析;优异等位基因
EvaluationandassociationmappingforSOYBEANsalt-alkalinetoleranceATseedingstage
ABSTRACT
Soilsalinizationisanimportantabioticstressforcropproductionworldwide,andseriouslyreducedcropyieldaswell.About20%oftheagriculturalirrigationlandwasaffectedbysaltandalkaline.Inrecentyears,soilsalinizationismoreandmoreseriousowingtounsuitableirrigation.Tomaintainasustainableproductionofsoybeaninasaltstressenvironment,developingalkaline-salttolerantcultivarsisanefficientway.However,theprerequisiteforthebreedingistoelucidategeneticmechanismofthetolerance.
Previousstudiesonsoybeanalkaline-salttolerancefocusonbi-parentalsegregationpopulations,anditsresultshavealimitedroleincropbreeding.Toovercometheshortcoming,analternativeapproachistoconductgenome-wideassociationstudies(GWAS)ininsoybeancultivarresource.Inthisstudy,therefore,257soybeancultivarsrandomlyselectedfromChina,alongwith135SSRmarkerinformation,wereusedtocarryoutGWASforthetoleranceusingenrichedcompressionmixedlinearmodel(ECMLM)andepistaticassociationmapping(EAM)approaches.Evaluationofsoybeanalkaline-salttolerancewascarriedoutbasedonlengthofmainroot(LR),freshanddryweightsofroots(FWRandDWR),biomassofseedlings(BS)andlengthofhypocotyls(LH)forhealthyseedlingsaftertreatmentswithcontrol,100mMNaCland10mMNa2CO3foraboutoneweekundergreenhouseconditions.UsingresultsfromGWAS,geneticeffectsofalltheallelesforeachlocuswereestimatedsothatelitealleleanditscultivarcouldbefoundandbreedingbydesigncouldbeperformed.Themainresultswereasdfollows.
First,usingFWRindexatseedlingstage,twocultivars(Zifengtian’andouandBaiqiuNo.1)haveastablesalinetolerantperformance,andeightcultivars(Lin’anbayuebai,Shengxiantiangengdou,Zunyizongzidou,Beichuanwuyanwo,Zifengtian’andou,Guangxi-dalidou,HedouNo.6andJidouNo.13)haveastablealkalinetolerantperformancein2009and2010.NotethatZifengtian’andouhastheabovetwoperformancessimultaneously.
Second,withalkaline-salttolerantindices,atotalof129main-effectQTL:
35forLR,24forFWR,19forDWR,33forLHand18forBS,weredetectedbytheECMLMmethod,whereasatotalof154QTL:
19forLR,27forFWR,18forDWR,26forLHand32forBS,wereidentifiedbytheEAM.Itshouldbenotedthatthereare30commonQTLwiththeheritabilitiesof0.68%-9.38%,whicharemainlyQTL-by-environmentinteraction.Withoriginalobservationsforthealkaline-salttolerance,20commonQTL:
6forLR,10forLH,1forDWRand3forFWR,wereidentifiedbyECMLMA,ECMLMandEAMapproaches.SomesameQTLwereobservedbetweentheabovetwokindsofresults.
Moreimportantly,somealkaline-salttolerancegenesinArabidopsisthalianaandsoybeanarefoundtobearoundthetolerance-associatedmarkersinthisstudy,i.e.,satt453,ofsatt656,satt411,satt687satt256,satt413sat_153,satt672,andsatt102.
Finally,theaboveresultsfromGWASwereusedtoestimatealleliceffectssothatnovelalleleanditscultivarcouldbemined,forexample,eliteallelesforLRalkaline-salttoleranceindiceswere353bp(sat_256)and401bp(sat_344)andtheircorrespondingcultivarswereDexinlaoshuyaandXudouNo.10.NotethatBaiqiuNo.1andBeichuanwuyanwohavethetolerancetosaltandalkalinestressessimultaneously,whichareofuseinsoybeanbreeding.
KEYWORDS:
soybean;tolerancetoalkaline-saltstresses;resistancemeasurement;genome-wideassociationstudy;novelallele
符号说明(英文缩略词)
缩写
英文名称
中文名称
CTAB
CetyltrimethylAmmoniumBromide
溴代十六烷基三甲胺
EDTA
EthyleneDiamineTetra-aceticAcid
乙二胺四乙酸
PVP
PolyvinylPyrrolidone
聚乙烯吡咯烷酮
Tris
Tris(Hydroxymethyl)Aminomethane
三(羟甲基)氨基甲烷
DNA
DeoxyriboNucleicAcid
脱氧核糖核酸
Acr
Acrylamide
丙烯酰胺
Bis
Bis-Acrylamide
甲叉双丙烯酰胺
AP
AmmoniumPersulfate
过硫酸铵
TEMED
N,N,N,N-tetramethylethlenediamine
N,N,N,N-四甲基乙二胺
MAS
MolecularMarker-assistedSelection
分子标记辅助选择
PCR
PolymeraseChainReaction
聚合酶链式反应
SSR
SimpleSequenceRepeats
简单序列重复
SNP
SingleNucleotidePolymorphism
单核苷酸多态性
AFLP
AmplifiedFragmentLengthPolymorphism
扩增片断长度多态性
RAPD
RandomAmplifiedPolymorphicDNA
随机扩增多态性DNA
RFLP
RestrictionFragmentLengthPolymorphism
限制性片段长度多态性
EST
ExpressedSequenceTags
表达序列标签
QTL
QuantitativeTraitLocus
数量性状基因座
LD
LinkageDisequilibrium
连锁不平衡
GWAS
Genome-wideAssociationStudy
全基因组关联分析
GLM
GeneralLinearModel
一般线性模型
MLM
MixedLinearModel
混合线性模型
NAM
NestedAssociationMapping
巢式关联作图
cMLM
CompressedMixedLinearModel
压缩的混合线性模型
EAM
EpistaticAssociationMapping
上位性关联分析
ECMLM
EnrichedCompressedMixedLinearModel
改进的压缩混合线性模型
ECMLMA
EnrichedCompressedMixedLinearModel
Advanced
改进的压缩混合线性模型的提高
第一部分文献综述
第一章文献综述
1.盐碱胁迫对大豆生长的影响
盐胁迫对植物生长的影响主要分为两个阶段。
第一阶段,主要通过渗透胁迫抑制植物幼叶的生长,该过程相对较快。
当植株根际的盐溶液浓度达到临界水平时(大豆的临界值大约为40mMNaCl),植株茎和叶的生长量开始下降,新叶、新芽的形成减缓,甚至处于休眠状态,形成的侧枝也相应减少。
在单子叶植物中,盐胁迫的影响主要表现在植株分蘖数下降,从而降低植物总叶面积;而在双子叶植物中则主要是植株的叶片变小,分支数下降。
第二阶段为离子毒害,虽然该过程比较缓慢,但加速了成熟叶片的衰老进程。
当植株成熟叶片中盐浓度达到离子毒害浓度时,老叶衰亡。
因此,当老叶的死亡速率大于新叶的生长速率时,植株光合作用提供的碳水化合物不能满足新叶的要求,导致植株生长率降低。
盐胁迫通过两种不同的作用方式影响植物生长:
第一,土壤中高浓度的盐使得植株根系难以从土壤中吸取水分。
第二,植物体内高浓度的盐对植株产生离子毒害,根系外的盐间接地影响细胞生长,以及相关的代谢(MunnsandTester2008)。
1.1盐胁迫对大豆生长发育的影响
大豆属于中度耐盐碱作物,盐和碱的胁迫效应主要表现在抑制大豆生长(MaasandHoffman1977)。
在大豆中,高浓度的盐胁迫使种子发芽率,植株生物量,作物产量大幅下降;根、茎的生长减缓,茎节数减少,根冠比提高和干物质的积累下降,甚至导致植株衰亡(AbelandArnold1964;Parkeretal.1983;YangandBlanchar1993;Panneerselvametal.1998;罗庆云和於丙军2001;Phangetal.2008;贺莉等2011)。
但也有研究表明:
耐盐性较强的品种(Lee68)在低盐(50mMNaCl)胁迫下,株高反而有所提高(罗庆云和於丙军2001)。
盐胁迫还会降低植株根的渗透调节能力以及钠离子的外排和水分的吸收(Anetal.2001;Joly1989)。
除此之外,盐胁迫对大豆根瘤的形成也有较大影响。
有研究表明:
盐胁迫能显著地降低根瘤数和根瘤干重(BernsteinandOgata1966;SingletonandBohlool1984),致使根际间可利用的有效氧下降,刺激植株无氧呼吸途径(Serrajetal.1994)从而导致根瘤生长受到抑制。
盐胁迫还能显著的增加大豆叶片中氯离子和钠离子含量,而降低钾、钙、镁的累积(Abel1969;Anetal.2001;Essa2002)。
还有研究表明:
盐胁迫下大豆植株体内的可溶性糖,溶性蛋白质,氨基酸,脯氨酸等有机小分子也会发生相应的变化(El-SamadandShaddad1997)。
1.2碱胁迫对大豆生长发育的影响
植株受到碱胁迫的最显著的变化是叶片黄萎和植株矮化。
前人在水稻(Yangetal.1994)、小麦(Millaretal.2007)和番茄(Biatczyketal.1994)等作物中均有研究。
也有研究表明:
碱胁迫通过降低植物对营养物质的吸收,间接
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