实时荧光定量PCRTaqMan探针法及设计原则_精品文档.ppt
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实时荧光定量PCRTaqMan探针法,序列选取应在基因的保守区段;避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构;典型的引物18到24个核苷长。
引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。
Tm值在5565,GC含量在40%60%;引物之间的TM相差避免超过2;引物的3端避免使用碱基A,引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基;为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子;Taqman探针技术要求片段长度在50bp150bp;引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。
TaqMan技术引物设计原则,TaqMan探针设计原则,先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针;探针长度应在15-45bp(最好是20-30bp),以保证结合特异性;探针的DNA折叠和二级结构;尽量避开二级结构;Tm值在65-70,通常比引物TM值高5-10(至少要5),以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合,GC含量在40%70%;探针的5端应避免使用G鸟嘌呤因为5G会有淬灭作用,而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用;整条探针中,碱基C的含量要明显高于G的含量G含量高会降低反应效率,这时就应选择配对的另一条链作为探针;为确保引物探针的特异性,最好将设计好的序列在blast中核实一次,如果发现有非特异性互补区,建议重新设计引物探针。
TaqmanMGB探针设计,探针的5端避免出现G,即使探针水解为单个碱基,与报告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。
Tm值应为65-67。
尽量缩短TaqmanMGB探针,但探针长度不少于13bp。
尽量避免出现重复的碱基,尤其是G碱基,应避免出现4个或4个以上的G重复出现。
原则上MGB探针只要有一个碱基突变,MGB探针就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交,不产生荧光信号)。
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