高效液相色谱简介及操作_精品文档.ppt
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高效液相色谱High-PerformanceLiquidChromatography,HPLC,高效液相色谱概述及原理,主要注意事项,基本操作步骤,高效液相色谱仪的结构,主要内容,1,2,3,4,一、高效液相色谱概述及原理,高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪70年代在经典液相色谱和气相色谱的基础上迅速发展起来的一种高效、快速的分离分析技术。
1.色谱的演化,色谱:
由于不同的组分与固定相作用强弱不同,在一定的推动力下,它们在固定相中滞留的时间长短不一,从而使它们按一定顺序从色谱柱中先后流出。
经典的柱色谱,经典的柱色谱,渐渐地,人们以传统色谱为蓝本开发了气相色谱,气相色谱示意图,经典的柱色谱,高效液相色谱:
效仿气相色谱,用高压输液泵将流动相输入高柱效色谱柱,使其在柱内快速流动,并在柱末端附加检测器检测分离情况。
高效液相色谱就这样诞生了。
高效液相色谱仪就这样诞生了,LC,GC,HPLC,填料颗粒小(210m),受到的阻力较大,为了能迅速地通过色谱柱,必须对载液施加1530MPa的高压。
由于采用高压,载液在色谱柱内的流速可达l10mLmin,因而所需分析时间少。
使用细、规则、孔浅的颗粒做为固定相,分离效率大大提高。
采用紫外、荧光、蒸发激光散射、电化学、质谱等检测器,检测灵敏度高。
紫外检测器检测限可达0.01ng;荧光和电化学检测器可达0.1pg。
2.为什么叫高效液相色谱?
HPLC和经典液相色谱法的比较,3.高效液相色谱法的分类,通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图?
tR:
保留时间;tM:
死时间;:
调整保留时间;W:
峰宽,定性分析:
在同一色谱系统中相同物质具有相同的保留值定量分析:
组分含量与其响应值(峰高或面积)成正比,5.如何评价色谱峰?
柱效:
描述被分离组分的集中程度。
柱效越高,组分越集中,对应色谱峰的峰宽越窄。
可用理论塔板高度H描述。
H越小,柱效越高。
选择性:
描述不同组分的分离程度。
选择性越高两个色谱峰顶相距越远。
用R表示,(a)柱效和分离度都不好;(b)分离度高,柱效低;(c)理想色谱峰,用分离度R可以描述选择性和柱效的总效能,R值越大,表明两组分的分离程度越高,R=1.0时,分离程度可达98%,R1.0时两峰有部分重叠,R=1.5时,分离程度达到99.7%.所以,通常用R=1.5作为相邻两色谱峰完全分离的指标.,分析未知物质-联用技术,色谱-质谱联用色谱-核磁共振联用色谱-傅氏转换红外线光谱分析仪联用,二、高效液相色谱仪的结构,液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统以及检测和记录系统四大部分组成。
此外,可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。
高效液相色谱仪结构流程图,1高压输液系统,高压输液系统有贮液器、高压泵及压力表等组成,核心部件是高压泵。
(1)贮液器,流动相贮液器,一般由玻璃、不锈钢或聚四氟乙烯塑料制成,常用体积为0.52L。
流动相溶剂放入贮液器之前必须经过过滤和脱气处理。
常用脱气方法:
超声脱气、加热脱气、真空脱气、吹氮脱气等。
(2)高压输液泵主要部件之一,泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性,常用的压力范围:
(150350)105Pa。
输液泵应具备如下性能:
流量稳定;流量范围宽;输出压力高;液缸容积小;密封性能好,耐腐蚀。
高压泵的分类,往复式柱塞泵,分类,恒流泵,恒压泵,螺旋注射泵,柱塞往复泵,隔膜往复泵,2进样系统,进样方式:
注射器进样、阀进样、自动进样。
早期使用注射器进样,现在大都使用耐高压的六通阀进样或自动进样。
六通阀的结构:
色谱柱,是高效液相色谱的心脏。
柱管多用不锈钢制成。
两端的柱接头内装有筛板,防止填料漏出。
填料的粒度多为0.2-20m(5-10m)。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
常规分析柱:
内径25mm(常用4.6mm,3.9mm),柱长1030cm(15cm,25cm居多)。
3分离系统,包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。
4检测系统,主要作用:
监测经色谱柱分离后的组分浓度变化,并由工作站记录数据,定性、定量分析。
高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器等。
原理:
朗伯-比尔定律,a.紫外检测器(UVD):
应用最广泛的检测器。
特点:
使用面广;灵敏度高(检测下限为10-10gml);线性范围宽;对温度和流速变化不敏感;可检测梯度溶液洗脱的样品。
缺点:
只能检测有紫外吸收的物质,流动相的截止波长应小于检测波长。
b.示差折光检测器(RID),原理:
监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度。
特点:
通用性检测器;对温度变化比较敏感,要保持在0.001;灵敏度低(10-6g);对溶剂变化敏感,不适用于梯度洗脱。
凡具有与流动相折光率不同的样品组分,均可使用示差折光检测器检测。
目前,糖类化合物的检测大多使用此检测系统。
c.荧光检测器(FLD),原理:
某些溶质在紫外光激发后能发射可见光(荧光)的性质检测。
特点:
选择性检测器,灵敏度比紫外检测器高2-3个数量级,可达到10-12g;选择性好,对流量和温度敏感性低。
缺点:
只适合于能产生荧光的物质的检测。
只适用于具有荧光的有机化合物(如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等)的测定。
d.蒸发光散射检测器(ELSD),通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。
工作原理:
适用检测挥发性低于流动相的组分,主要用于检测糖类,高级脂肪酸,磷脂,维生素,氨基酸,甘油三酯及甾体等。
适用范围:
5数据处理系统,该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作,使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。
三、高效液相色谱基本操作步骤,
(1)检查电源线连接是否正确后打开电源开关
(2)泵体及流路内的气泡排除(3)正确连接色谱柱注意流向标志,切勿反接,(4)系统平衡第一步:
先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟,平衡活化色谱柱,并赶走管路中的杂质和水分。
第二步:
平衡色谱柱方法一:
若流动相为有机相与水相的混合物,则第一步完成后,按照分析样品的需要调节有机相与水相的比例后冲洗流路约30分钟后,待基线走平后即可进样。
方法二:
若流动相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸,则第一步完成后,先用95%的去离子水冲洗流路约20分钟后,再按照分析样品的需要调节流动相的比例,冲洗流路约30分钟,待基线走平后即可进样。
(5)色谱柱平衡后,打开检测器(开灯)(6)测定样品(7)清洗仪器色谱柱及流路清洗进样阀清洗进样针清洗,四、主要注意事项,1泵使用的注意事项,防止任何固体微粒进入泵体(用0.22um或0.45um的微孔滤膜过滤)流动相不应含有任何腐蚀性物质,含有缓冲盐的流动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。
泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完,否则空泵运转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、密封圈,最终产生漏液。
输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。
流动相应先脱气,以免在泵内产生气泡,影响流量的稳定性和分析结果。
2色谱柱使用的注意事项,3其他注意事项,色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。
当分析柱长期不使用,应用适当有机溶剂保存(一般为甲醇)。
每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁止直接进样分析。
要注意流动相的脱气。
避免使用高粘度的溶剂作为流动相。
使用新鲜配制的流动相,特别是水溶剂或缓冲液建议不超过两天,最好每天更换。
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