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奈瑟菌的分离和鉴定,卫生部北京医院陈东科,、脑膜炎奈瑟菌,脑膜炎奈瑟菌(Neisseria.meningitidis)简称脑膜炎球菌,是引起流行性脑脊髓炎(简称“流脑”)的病原菌。
多发年龄在529岁。
对本菌的鉴定是确定诊断的重要依据,同时给临床治疗提供参考价值。
人类是脑膜炎球菌的唯一宿主。
流行性脑脊髓炎病人和带菌者是本病的传染源。
本病经飞沫传染,潜伏期14d。
细菌首先侵害鼻咽腔,引起上呼吸道感染或局部炎症。
当少量细菌侵入血流时,可引起菌血症突发恶寒、发热、恶心、呕吐等,并有出血或红斑性皮疹及脾肿大。
当大量细菌侵入血流时,由血液或淋巴到达脑脊髓膜则发生脑脊髓炎的症状和体症。
在我国以A群流行为主。
1.生物学性状,
(1)形态与染色脑膜炎球菌为革兰阴性双球菌,菌体呈肾形或豆形,成双排列凹面(短轴)相对。
由病人体内新分离的菌株有多糖荚膜。
(2)培养特点本菌为专性需氧菌,营养要求高,58%CO2可促进生长,其最适生长温度为3637,最适pH值为7.47.6。
在巧克力平板上经1824h培养,形成圆形、光滑、透明、湿润、边缘整齐菌落。
直径23mm,在血平板上不溶血。
培养时间延长,由于细菌自溶酶的作用,菌落可变成酪样或胶样。
(3)生化反应特点脑膜炎球菌可分解葡萄糖、麦芽糖,产酸不产气。
不分解蛋白质,不产生靛基质,不产生硫化氢,不分解尿素,硝酸盐还原试验阴性,氧化酶试验阳性。
2.标本采集:
根据病期不同,采集的标本也有所不同。
菌血症期病人可采取血液;出现出血点或瘀斑者,可挑取瘀斑渗出液;如出现脑脊髓膜刺激症状者,必要时可抽取脑脊液;上呼吸道感染期的疑似病人和带菌者,可取鼻咽腔分泌物进行检查。
因该菌易自溶,故应立即送检,最好在床边接种。
3.检验方法:
(1)直接检查法:
1)脑脊液以无菌方法获得脑脊液标本后,经3000r/min离心30min,取沉淀物,首先接种培养,然后再涂片染色检查。
通常制两张涂片,一张作革兰染色,一张作美蓝染色进行镜检。
若脑脊液较清应先增菌,即在脑脊液中加入少量葡萄糖肉汤培养液,经3746h增菌培养后,再行涂片染色镜检,可提高阳性检出率。
一般情况下,患病早期的脑脊液中脑膜炎球菌数量较少,且大多数在细胞外;在疾病后期菌量增大,大多数在细胞内。
2)瘀斑(出血点)选择细小的色泽鲜红,境界明显的瘀点,或无瘀点时用充血皮肤,经消毒干燥后刺入0.5cm,用清洁玻片采血三滴,涂成血膜片,自然干燥。
用美蓝或革兰染色镜检。
第一滴血含菌量比第二、三滴血高数倍,故不能按常规采血弃去第一、二滴血。
(2)培养检查法,1)脑脊液取脑脊液离心沉淀物,立刻接种巧克力平板,37,58%CO2环境培养1824h。
如脑脊液混浊可直接种入培养基。
2)瘀斑渗出物渗出物直接涂于巧克力平板上,37,58%CO2环境培养1824h。
3)鼻咽腔分泌物将绵拭标本立即涂于,P.V(PolymyxinB.Vancomycin)卵黄琼脂或P.V巧克力平板一端,再用接种环划线分离,进行培养观察。
4)血液抽取静脉血58ml,立刻接种注入血培养瓶,按血液细菌培养常规操作。
(3)生化反应,取纯培养物,如其形态、菌落特征典型,氧化酶阳性,可按表1进行鉴定。
(4)凝集试验,包括血清凝集试验、SPA协同凝集试验、反向乳胶凝集试验等方法。
(5)荚膜肿胀试验,取一接种环菌掖或脑脊液,于玻片上,再加一环抗血清及二环吕氏美蓝液混合,加上盖玻片,20min,用油镜观察荚膜是否肿胀,同时用盐水作对照。
此试验仅适用于A群和C群菌株。
二、淋病奈瑟菌,淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)简称淋球菌,它是淋病的病原菌。
主要通过不洁性交引起泌尿生殖系统化脓性炎症,也可通过污染器械、带菌衣物、用具发生间接污染。
也有肛门及咽部的淋球菌感染病例。
新生儿经过产道时,可被感染而患淋病性眼结膜炎。
1.生物学性状:
(1)形态与染色淋球菌的形态与脑膜炎球菌很相似,菌体呈球形、肾形或豆形,成对排列,两球菌接触面平坦,形似一对黄豆。
革兰染色阴性,无芽孢、无鞭毛、有荚膜。
在急性淋病患者尿道脓汁标本中可见细菌被吞噬于中性粒细胞内;慢性淋病时多在细胞外。
(2)培养特点,本菌对营养要求高,需用巧克力平板,或含万古霉素、多粘菌素及制霉菌素的Thayer-Martin培养基(GC琼脂加生长添加剂)才能生长。
初次分离需供给58%CO2,最适生长温度为3637,最适pH值为7.5。
经48h培养,形成圆形、不透明、灰白色凸起,细小颗粒状菌落。
直径0.61.0mm,进一步培养,菌落可呈粘液样。
(3)生化反应特点,淋球菌只分解葡萄糖,产酸不产气,不产生靛基质,不产生硫化氢,硝酸盐还原试验阴性,氧化酶及触酶试验均阳性。
2.标本采集:
(1)男性尿道炎患者,先以无菌生理盐水清洗尿道口,采集尿道脓性分泌物;前列腺炎患者则从直肠侧对前列腺进行按摩,待分泌物排出后采集。
(2)女性尿道炎患者,先以无菌生理盐水清洗尿道口,从阴道后壁由后向前压迫尿道,使分泌物排出,然后用无菌拭子或接种环采集;对于宫颈炎患者,先无菌生理盐水清洗宫颈口和阴道壁,再用阴道窥镜压迫子宫阴道部,使分泌物排出,然后用无菌拭子或接种环采集标本;合并肠炎的患者,可在直肠镜下,用无菌绵拭子采集直肠窝粘膜的粘液进行送检。
(3)眼分泌物、血液、关节液等以无菌操作方式采集。
注意事项:
最好在治疗前采集样品;取材前不论有无症状一律禁用消毒药;对女性患者取材时不要碰阴道粘膜,以防污染正常菌群;由于本菌抵抗力甚弱,标本采集要迅速并立即送检,最好床边接种,立即培养。
3.检验方法:
(1)直接检查法取标本直接涂片进行革兰染色,急性期在脓细胞内可找到许多革兰阴性双球菌,有诊断意义。
本法最适用于泌尿生殖道标本,男性与培养结果符合率达到98%,一般可不作培养;女性与培养结果符合率仅达50%左右,需进行培养鉴定。
(2)培养检查法采取脓汁或粘液标本后,应立即接种于预温的巧克力平板上进行分离培养。
(3)生化反应取纯培养物,如其形态、菌落特征典型,氧化酶阳性,可按表1进行鉴定。
表1G-球菌的鉴别特征,菌名巧克力琼脂营养琼脂葡萄糖麦芽糖还原还原DNA酶乙酰脂酶(22)(35)NO3NO2脑膜炎奈瑟菌+淋病奈瑟菌+V卡他莫拉菌V+其他奈瑟菌V+*V*粘膜奈瑟菌阳性。
V:
不定。
三、其他奈瑟菌,其他奈瑟菌大多寄居在人的上呼吸道中,很少有致病性。
菌落较干燥,有咬琼脂的现象,大多呈黄色。
也有少数菌落呈光滑型,且无色素,易于脑膜炎奈瑟菌及嗜血杆菌菌落相混淆,应注意鉴别,奈瑟菌落一般较粘,用接种环不易刮取。
解乳糖奈瑟菌,浅黄奈瑟菌,编织奈瑟菌,编织奈瑟菌,淋病奈瑟菌是否需要进行-内酰胺酶的检测?
一般来说,不需要对淋病奈瑟菌中的-内酰胺酶进行检测。
当前经验治疗淋病的药物为头孢曲松、头孢克肟或喹诺酮类抗菌药物,而这些药物的抗菌活性均不受-内酰胺酶的影响。
由于多年前就已经不提倡用青霉素进行经验治疗,因此,不必要对淋病奈瑟菌进行-内酰胺酶的测试。
除非在有些国家,青霉素仍在使用且有一定的抗菌活性,在这种情况下,就有必要进行-内酰胺酶的检测。
另外,出于流行病学调查的需要,美国一些公共卫生部门可能也会要求实验室进行-内酰胺酶的测试。
但在大多数情况下,绝大部分的公共卫生部门可以从国家性、地区性和当地的耐药监测网络中得到这些数据,从而不需要实验室常规对林病奈瑟菌进行-内酰胺酶的检测。
谢谢!
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