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医学分子生物学15页word
重叠延伸PCR。
(OE-PCR)这种方法运用非常广泛、灵活,不受突变位置及突变类型的限制,利用OE-PCR不仅能实现基因点突变,还能便利地实现大片段的插入及删除。
其基本原理如图1所示。
首先设计两PCR反应以产生两个含突变位点的DNA片段,随后将上述两个PCR产物混合,二者通过末端互补区结合并在适宜的温度下互为引物延伸得到完整的含突变的基因,对第一次PCR产物进行纯化处理可显著提高突变效率。
OE-PCR不足之处在于:
一个突变需要两对引物,3次PCR,并且需对中间产物进行纯化。
相对而言步骤较烦琐,不经济;由于DNA二级结构及互补链的竞争等因素的影响,有时两个中间产物难于有效地相互结合,导致目的产物得率很低;当利用Taq聚合酶进行PCR反应时,经常在PCR产物末端加上腺苷酸,这一多余的腺苷酸一方面导致两个中间产物难于有效地相互结合,另一方面可能会插入基因中导致产生
非预期的移码突变。
针对这些不足,后来许多学者对OE-PCR进行了改进。
1997年,URBAN等提出一步重叠延伸PCR法,使得三个PCR反应得以在一个试管里进行,并且省略了烦琐的中间产物纯化过程。
其原理是首先将待突变的DNA以相反的方向克隆到两个载体中,这两个载体除了多克隆位点相反外其余均相同。
这样便得到两个模板。
将这两个模板,两个突变引物及一个与载体互补的通用引物置于一个试管中进行一次PCR反应即可得到含突变的目的基因。
1997年,WARRENS等J利用不对称PCR反应产生单链中间产物,消除了互补链的竞争性影响,显著提高了目的产物的得率。
1990年,HORTON等用T4DNA聚合酶处理中间产物,降低了移码突变的发生率。
由于OE-PCR几乎没有任何特殊条件的限制,而且成功率很高,因此运用非常广泛。
利用该方法实现定点突变的实例很多.MUKHOPADHYAY用该方法将’BAMH1限制性内切酶基因的第54位半胱氨酸用丙氨酸取代后提高了该酶的活性。
运用:
第一轮PCR反应
第二轮PCR反应
利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23基因
柑桔是世界上栽培最广泛、经济意义最重要的果树之一.柑桔衰退病是全球柑桔生产中破坏最强、经
济意义最为重要的病害之一[1].它是由一种正义单链RNA病毒,属于长线病毒科(CTV)长线病毒引起的。
主要通过蚜虫和嫁接传播,危害以酸橙作砧木的大多数柑桔品种以及影响嫁接在
其它砧木上的柚类、葡萄柚和部分甜橙的正常生长,主要表现为速衰、茎陷、苗黄等症状.
通过转基因柑橘表达23KD蛋白阻止病毒的正常侵染过程,从而达到抗病的目的,并证
实P23蛋白在CTV致病过程中发挥着重要的作用[9].本实验通过重叠延伸PCR法突变掉P23保守序列
第206位一个碱基,由于氨基酸序列发生改变,可能造成相应的蛋白结构发生改变.P23作为RNA沉默
抑制因子,可以利用P23序列设计RNA干扰载体,进行抗CTV研究.OzgurBatuman等利用RNA干扰
原理,将CTV基因组中的ORF12加上3pUTR(p23U)构建反向重复序列,转化烟草,转基因植物产生
病毒RNA序列再折叠成dsRNA结构,并对含有P23U序列的GVA病毒载体的浸染具有较高的抵抗
性[10].因此利用突变成后的SacI位点,酶切构建RNA干扰载体,有利于进一步的利用RNA干扰原理
进行抗CTV研究.
第一次PCR:
以P231/P23R为引物,以P23为模板,产物编号为①;第二次PCR:
以P23F/P232为引
物,以P23为模板,产物编号为②;第三次PCR:
以P231/P232为引物,①、②为模板,产物为突变产物.
利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成
1重叠延伸PCR技术的原理
重叠延伸PCR技术是根据目的基因的核苷酸序列,将目
的基因分成70~90bp不等的多条引物,分段进行合成,利用
相连片段间20~30bp重叠的核苷酸部分互相搭桥、互为模
板,通过几轮连续的PCR反应将各个片段组合成为目的
基因。
目前已有多家公司推出了高保真DNA聚合酶与高保真
扩增试剂盒,如TLIDNAPolymerase(Promege公司);KODDNA
Polynerase、KODPlus(Toyobo公司);PyrobestTMDNAPolymerase
(Takara公司)等,这些新型聚合酶的使用,极大地提高了重叠
延伸PCR反应的效率与准确性。
利用重叠延伸PCR技术扩增长片段DNA
获得基因的全长片段是进行基因功能研究的
首要一步,如果无法获得基因的全长片段,那么构
建突变体等进行基因功能分析工作就无从谈起.而
大多数基因的全长片段都在2.0kb以上,理论上,
常规PCR可以得到5.0kb以上的PCR产物,但在
实际的操作过程中由于模板质量、DNA聚合酶等
各种因素的影响和限制很难稳定得到5.0kb以上
的片段,这就给基因的研究工作造成了一定的困
难.PCR方法的应用似乎是无止境的,因此根据不
同的实验需要对PCR方法进行优化和改进也正在
不断的发展,重叠延伸PCR就是一种可以非常简
捷有效地获得长片段DNA的方法,该技术从建立
开始就得到世界各国学者的关注,它的建立使得长
链DNA的人工合成变为可能,而且可以比较稳定
的获得长片段DNA,促进了对基因及其功能的研
究水平的提高.经过十几年不断的实践与总结,重
叠延伸PCR方法的体系已日趋成熟.由于采用具
有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从
而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将相同
或不同来源的扩增片段重叠拼接起来[1].如果片
段来源相同就可以得到基因长片段DNA,片段来
源不同则可以形成融合基因.
1重叠延伸PCR的原理
重叠延伸PCR(splicingbyoverlapextension
PCR,SOE-PCR)技术是1989年由Horton等[2]
创建的,它是根据目的基因的核苷酸序列,将目的
基因分成70~90bp不等的多条引物,分段进行合
成,利用相连片段间15~20bp重叠的核苷酸部分
互相搭桥、互为模板,通过几轮连续的PCR反应将
各个片段组合成为目的基因[3],其关键点就是设
计嵌合引物对.该方法主要应用于制备嵌合分子或
完整cDNA、框内删除和插入片段以及定点突变
等,在扩增长片段DNA方面更是优势突出.
Shevchuk[4]等2004年利用重叠延伸PCR法成功
地将4个DNA片段连接在一起,获得了长度达20
kb的片段.
用重叠延伸PCR技术纠正人工合成乙型肝炎
病毒核心抗原基因中的突变
方法:
针对构建
的重组质粒PGEM-7Z/HBcAg中的两处突变设计三对引物,PCR定点突变后对重新构建的PGEM-7Z/HBcAg进行菌落PCR
和酶切鉴定,初步筛选的阳性克隆进一步通过序列分析进行确证。
结果:
经PCR定点突变后,测序证明HBcAg基因序列与设计
完全一致。
结论:
用该方法成功纠正了人工合成的乙肝病毒核心抗原基因中两个碱基的缺失,获得了预期的目的基因。
定点突变技术是通过分子克隆手段定点改变特
定基因的局部核苷酸序列,在改造、优化基因,研究
蛋白质结构和功能间的复杂关系方面发挥重要作
用[1]。
此外,定点突变还可用于纠正克隆基因中的突
变,改变酶切位点,构建各种质粒载体等方面。
本实
验室在前期用大肠杆菌偏爱密码子替换乙型肝炎病
毒核心抗原(HepatitisBCoreAntigen,HBcAg)基因
中的稀有密码子,通过二次重叠PCR技术人工合成
了HBcAg基因,并将其克隆到PGEM-7Z载体上。
经
DNA序列分析发现其中有两处发生了缺失突变,本
研究拟采用重叠延伸PCR定点突变技术将两处突
变纠正,以期获得完全正确的HBcAg基因,为构建
原核表达载体并进一步研制HBcAg治疗性疫苗奠
定基础。
重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用
重叠延伸PCR技术(genesplicingbyoverlapextensionPCR,简称SOEPCR)由于采用具有互补末端
的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重
叠拼接起来。
此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组,而且不需要内切酶消化和连接酶处
理,可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。
重叠延伸PCR技术成功
的关键是重叠互补引物的设计。
重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基
因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
本文综述了重叠延伸PCR的原理和目前的应用
情况,并指出了此技术中的注意事项,展望了其应用前景。
2SOEPCR的应用
2.1SOEPCR构建突变基因
基因突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术
之一,可以有目的改变DNA序列中的碱基。
它不仅
可以阐明基因表达的调控机理,还可利用研究蛋白
质结构与功能间的关系,改造天然蛋白质,使之更符
合应用需求。
基因突变包括单个碱基或整段序列的
替换、基因片段的插入与删除等类型(罗师平和冷希
岗,2005)。
定点突变的方法很多,而基于PCR的定点
突变技术由于其突变效率高、操作简单、耗时短、成
本低廉等优点而倍受瞩目。
SOEPCR运用非常广泛、
灵活,不受突变位置及突变类型的限制,利用此技术
不仅能实现基因点突变,还能便利地实现大片段的
插入及删除(SenanayakeandBrian,1995)。
在重叠延伸PCR中,两个重叠的DNA片段是
分别从两个独立的PCR扩增反应得到的。
预设突变
构建在重叠区域,存在于两个扩增片段中。
设计4种
引物,用第一对引物扩增含有突变位点及其上游序
列的DNA片段,第二对引物被用来扩增含突变位点
及其下游序列的DNA片段,两个侧翼引物含野生型
序列,两个突变引物含有希望引进的突变位点,如置
换插入或缺失。
混合两次PCR的产物,由于两个突
变引物有重叠区,重叠片段之间退火,延伸成异源双
链,加入外侧引物进行第三次PCR,即可得到目标突
变体。
由于重叠延伸PCR几乎没有任何特殊条件的
限制,而且成功率很高,因此运用非常广泛。
2.2SOEPCR构建融合基因
重叠延伸PCR法还可以用于两个或两个以上
异源基因DNA片段的拼接(Warrensetal.,1997)。
如
同致突变引物一样,SOE引物亦含有末段互补序列,
通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进
行剪接和扩增,从而获得重组体。
与定点突变不同的
是:
一是待融合的PCR产物来自两个不同的基因;
二是通过SOE引物在两种PCR产物中产生相互重
叠的链进而获得融合基因。
Shevchuk等(2004)利用此技术和长片段PCR结
合使用,并且在实验中采用高保真聚合酶pfu的校正
功能,成功地组装了不同的长度DNA分子,拼接长
度可达20kb,融合的错误率仅有1/16600。
此技术将
有利于多片段的正确组装,加速复杂基因工程的研
究,比如人类细胞的体细胞敲除、病毒全基因组的组
装、疫苗的研究、多克隆抗体的产生(Jonesand
Barnard,2005)以及在植物基因工程中有广泛的应用
(熊爱生等,2003)。
2.3SOEPCR用于长片段基因的合成
合成基因一般基于以下两种考虑:
引入一些突
变有助于基因的表达,包括调整起始密码子AUG附
近的结构而促进翻译的起始,将基因中的罕见密码
子变为惯用码等;在寡核苷酸的5'端引入便于克隆
的限制性酶切位点,而编码区的改变又产生了新的
限制性酶切位点,但并不影响氨基酸序列。
基因的合成有化学合成和基因的组装。
化学合
成寡核苷酸片段的能力一般局限150~200bp以内。
然而,绝大多数基因的大小都超过了这个范围。
因
此,需要一种特殊的程序,才能把合成的寡核苷酸片
段构建成完整的基因。
将这种按设计要求用许多寡
核苷酸片段组装成完整基因的过程,叫做基因的组
装。
用几对寡核苷酸引物,以其3'末端的一个短互补
序列退火形成小段双链,从而互为模板和引物,通过
引导合成可达400bp的目的序列。
对于较长的靶序
列,则需将大的目的片段分成300~400bp大小的片
段,然后再进行二次组装。
合成的寡核苷酸片段的长度对全基因的正确组
装也有很大影响。
一方面,长度太短,会增加寡核苷
酸片段的数目和PCR的次数,导致发生错误的几率
增加;另一方面,长度太长又会使合成中出现错误的
几率增加,合成成本和难度极大增加。
因此,合成的
寡核苷酸片段的长度要综合考虑合成和组装过程中
的各种因素,我们实验室合成基因时选择了50~60
个寡核苷酸的长度,即可保证组装基因的质量,又大
大降低了寡核苷酸合成的成本;此外,采用高保真的
DNA聚合酶,可以极大限度地减少PCR重叠延伸过
程中的错误,是获得正确的全长基因的关键(Xionget
al.,2004)。
近年来我们通过遗传密码偏爱并结合基因
内部二级结构调整,多个植酸酶在甲醇酵母和油菜
种子中实现了高表达(Xiongetal.,2005;Pengetal.,
2006)。
我们还通过将苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白
δ-内毒素基因cryIA(c)Bt按照用荧光假单胞菌偏爱
密码进行了基因的设计和合成,并且在大肠杆菌和
荧光假单胞菌进行了高表达(Pengetal.,2003)。
2.4SOEPCR用于基因敲除
基因敲除(geneknockout)或基因破坏(genedisruption)通常需要在选择性标记基因的两端带上目的
基因的序列,将这种线性化片段转化宿主后与基因
组DNA发生同源重组,使选择性标记基因插入基因
的目的基因序列的特定位置而破坏目的基因的表
达,表达选择性标记基因产物。
Kuwayama等(2002)
将SOEPCR技术应用到dictyosteliumdiscoideum的
pkaC基因的敲除。
他们在实验中首先通过标准PCR
得到了pkaC基因的5'序列,pkaC基因的3'序列和
选择性标记基因———杀稻瘟菌素抗性基因,然后将
他们检测融合的效率,由于pka被破坏后,突变体表
现出不能聚合的表型,因此他们将融合产物转化
dictyosteliumdiscoideum后,计数不能聚合的菌株与
能聚合的菌株的数量比,得出基因的破坏效率为
90%,并通过下一步的嵌套PCR来证实。
这说明重
叠延伸技术在基因敲除方面能够得到良好的结果。
SOEPCR在应用于基因破坏时有如下优点:
所携带
的侧翼序列较长,保证了同源重组的正确性和有效
性;不受酶切位点的限制,可以在任意已知基因序列
的内部进行。
2.5SOEPCR用于基因的体外分子进化
体外分子进化技术(DNAshuffling)也称同源基
因拼接技术,最早是由Stemmer(1994)提出的一项蛋
白质体外快速进化的方法。
该方法的具体步骤是:
目
的基因经DnaseⅠ随机酶切得到大量的酶切片段,
接着采取“无引物”PCR扩增法将同源片段随机重
组,然后再通过特异引物PCR扩增全长基因。
通过
这种方法能够构建出广泛多样的嵌和体基因文库,
最后运用定向的筛选手段从嵌和体基因文库中筛选
得到所需要的突变基因。
这一方法的关键在于第一
个“无引物”PCR扩增反应,常规的PCR需要设计特
定的引物对目标基因进行扩增。
然而,DNA体外随
机拼接技术无需加特定引物,扩增反应是通过目的
基因随机片段化后得到的同源片段在PCR反应中
互为引物,反复随机重组,最后形成高度多样的嵌和
体基因文库。
近年来,许多体外分子进化的新策略和新方法
层出不穷,得到了良好的发展和应用(熊爱生等,
2006)。
特别是进入21世纪以来,体外分子进化技术
在新技术和新理论的推动下,又得到了长足的发展,
取得了一些显著的成绩,在农业、化学工业、基因治
疗、疫苗、蛋白药物等方面有广泛的应用。
不仅仅获
得了活性或耐高温性能提高的β-葡萄糖苷酸酶(熊
爱生等,2002),还对aacC1基因启动子进行优化,为研
究真核生物启动子的结构和功能提供了一条新途径。
2.6SOEPCR扩增目的基因
在多数情况下扩增目的编码基因都采取
RT-PCR的策略,首先选取目的基因mRNA丰度较
高的组织或细胞提取总RNA,逆转录为cDNA后再
行PCR扩增。
RNA提取过程繁琐,易被RNA酶污
染,而且扩增片段长度有限;对于较大的基因,时常
需要多次扩增才能得到全长。
相比较而言,DNA的
提取及其PCR扩增则容易得多。
王宝利等(2004)通
过重叠延伸PCR成功得到了OPG(osteoprotegerin)
的编码序列,OPG发挥生物活性的主要结构区由两
个外显子编码,他们依靠这种方法将两个外显子拼
接在一起,避免了RT-PCR的繁琐与RNA酶的污
染,使基因的克隆过程得到简化,为基因工程研制有
生物活性蛋白提供了可行的技术手段。
3SOEPCR的注意事项
SOE寡核苷酸引物上有两个部分,即“引发”部
分和“重叠”部分。
引发部分在寡核苷酸引物的3'端,
起引物作用;而重叠部分在寡核苷酸引物的5'端,与
重叠延伸中待融合的DNA片段互补。
在寡核苷酸引
物设计时除要考虑到引物设计的一般原则,还应考
虑到重叠部分的长度,一般重叠部分应设计15~20
个碱基。
另外,引物的Tm值对结果也有影响,建议设
计的全部引物最好有相同或相近的Tm值,以便融合
扩增步骤的顺利进行。
重叠延伸的融合效率还要根据实验有针对性地
摸索。
另外,现有的重叠延伸技术在构建突变体或嵌
合病毒时,只能做到引物与突变体的一对一关系,因
此要构建多个突变体库,重叠延伸技术并不占优势,
但利用重叠延伸改进而成的体外分子进化技术已成
为基因突变比较流行的技术。
基因敲除(geneknockout)或基因破坏(genedisruption)通常需要在选择性标记基因的两端带上目的基因的序列,将这种线性化片段转化宿主后与基因组DNA发生同源重组,使选择性标记基因插入基因的目的基因序列的特定位置而破坏目的基因的表达,表达选择性标记基因产物。
重叠延伸技术在基因敲除方面能够得到良好的结果。
OE-PCR在应用于基因破坏时有如下优点:
所携带的侧翼序列较长,保证了同源重组的正确性和有效性;不受酶切位点的限制,可以在任意已知基因序列的内部进行。
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