毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选范本模板.docx
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毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选范本模板
毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选
菌体的准备:
1。
挑取酵母单菌落,接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中,30℃、250—300r/min培养过夜;
2.取100-500µl(≤1:
100)的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中,28~30℃、250—300r/min培养过夜(约20h),至OD600达到1.3~1。
5;
3。
将细胞培养物于4℃,1500g离心5min,用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬;
4。
按步骤3离心,用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬
5。
按步骤3离心,用2—5ml,1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬;
6。
按步骤3离心,用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬,其终体积约为240ul;
备注:
可将其分装为80µl一份的包装-70冷冻起来,2周之内使用,但会影响其转化效率。
比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛,然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。
对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后,转大瓶BMGY摇瓶发酵。
一般对于甲醇诱导菌株,摇瓶一天左右后开始补加甲醇,就类似BMMY的功能了。
✓KM71比GS115生长的要慢。
毕赤酵母都应该是白色菌落的
✓对于LOX家族蛋白的表达,可尝试在酵母培养基中加入Cu2+离子,提高表达量和蛋白活性?
菌种保存:
挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:
1加入30%灭菌甘油,—80oCul/管冻存
(一般用10ug以上质粒用SalI酶切,然后直接加乙醇沉淀,70%乙醇洗一遍,约20ulddH2O重溶。
转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。
建议你不要用胶回收kit,回收的DNA可能还有盐,导致电击时放电时间很短。
乙醇沉淀主要步骤如下:
1)酶切体系(80ul)中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2NaAC,混匀
2)—20℃20分钟沉淀
3)13200rpm,20min,离心后弃上清
4)75%乙醇300ul轻轻洗,同上离心5min,弃上清
5)37度烘箱至无乙醇气味(或是用摇床的出风口吹出的暖风吹)。
6)20ulddH2O重溶)
电击转化:
8.将5~20µg的线性化DNA溶解在5~10µlTE溶液中,与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀,转至0.2cm冰预冷的电转化杯中;
9。
将电转化杯冰浴5min;
10.根据电转化仪提供的资料,参考其他文献及多次摸索,确定合适的电压、电流、电容等参数,按优化的参数,进行电击;
11。
电击完毕后,马上加入1ml1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀,转至1。
5ml的EP管中;(置于30度摇床低速培养1h,再涂板)
12。
将菌体悬液涂布于MD平板上,每200~600µl涂布一块平板;
13。
将平板置于30℃倒置培养,直至单个菌落出现(3—4天).
推荐:
电压1.5kV;电容25µF;电阻200Ω。
电击时间为4~10msec。
Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法
1.平板上的菌落长到肉眼可见时(约12小时);
2.取1ml酵母悬液4000rmp离心,pbs重悬,煮沸5mins,放到冰上5mins,直接就可以用做pcr的模板了
3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好,并分装.
3.用灭菌的牙签挑取菌落,在PCR管中涮一下,PCR扩增,
利用5’AOX1和3'AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组,则会扩增到两条带,一条为2。
2kb(KM71为3。
6kb)宿主茵AOXI基因,另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。
)
Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium。
Muts表型重组酵母的诱导表达实验
Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10—30%ofyourtotalflaskvolume。
1.挑选一单菌落,置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中,于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16—18h);
2。
室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用1/5到1/10原培养体积的MM,BMM或BMMY重悬菌体(约2。
5~5ml);
3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28-30°
C/250—300rpm的摇床上继续生长;
4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0.5~1。
0%;
5。
按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5mlEP管中,最大转速离心2~3min,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间.时间点一般取:
0、24、48、72、96和120h;
6。
对分泌表达,分离样品的上清液;对胞内表达,分离样品的菌体沉淀,带检测样品用液
氮或干冰速冻后,于—80°C保存备用;
7.可以用SDS—PAGE、Western—Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达.
Mut+表型重组酵母的诱导表达实验
1.挑选一单菌落,置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中,于28—30°C/250—300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h);
2.室温下1500~3000g离心5min,收集菌体,用MM、BMM或BMMY重悬菌体,使OD600=1.0左右(约100~200ml);
3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布或粗棉布封口,放置于28—30°C/250—300rpm的摇床上继续生长;
4.每24h向培养基中添加100%甲醇至终浓度为0。
5~1.0%;
5。
按时间点分别取菌液样品,取样量为1ml,置于1.5mlEP管中,最大转速离心2~3min,分别收集上清和菌体,分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
时间点一般取:
0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h;
6.对分泌表达,分离样品的上清液;对胞内表达,分离样品的菌体沉淀,带检测样品用液氮或干冰速冻后,于—80°C保存备用;
7。
可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。
BMGY和BMMY的换液方式有2种:
1)一种是离心换液,即在生长培养结束后,转移到灭菌大离心管中,4000rpm室温离心5分钟后,用BMMY洗下菌体,再转移到摇瓶,整个过程均用灭菌移液管操作.
2)另一种是静止换液,即在生长培养结束后,将摇瓶在无菌室静止4小时后,直接在酒精灯旁倾倒培养液,再加入诱导培养基,此种方法的缺点有少量生长培养基残留。
是离心换液或者静止换液,到底那个好,只有根据自己的实验结果来考量。
如果只是从防治污染的角度来说,静止换液也好一些,因为操作毕竟少一些,速度也快。
用新开启的分析纯甲醇,一直放在无菌室里面,每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。
也有人试过用膜过滤,结果膜都溶解了.
菌体是在BMMY中培养的,可以不用BMMY做对照,在600nm处测OD值,培养基和PBS光吸收都很低,PBS更方便.
麦芽浸提液培养酵母(不换液,补料),生长阶段结束后,密度可达到10-12,诱导培养结束后,密度可达到18左右。
如果用1体积的BMGY,在生长阶段结束后,换液时,加入1/10—1/2体积的BMMY进行诱导培养(即浓缩培养),细胞密度也可达到20以上。
通常,真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现,OD600可达到40-60及以上。
摇瓶很难达到那样的密度,不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。
摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量,但可以通过装量来暂时替代这个指标.
Mut+/Muts的筛选
用SacI,SalIorStuI线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后,多数转化子应为Mut+,但也有His+Muts的转化子存在(见Invitrogenprotocolp36),NotIorBglII线性化插入AOXI位点的载体转化GS155后,用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。
UsetheplatescontainingtheHis+transformantsandscreenfortheMut+andMutSphenotypeasdescribedbelow。
1.Usingasteriletoothpick,pickonecolonyandstreakorpatchoneHis+transformantinaregularpatternonbothanMMplateandanMDplate,makingsuretopatchtheMMplatefirst。
2。
Useanewtoothpickforeachtransformantandcontinueuntil100transformantshavebeenpatched(2—3plates)。
3。
TodifferentiateMut+fromMutS,makeonepatchforeachofthecontrols(GS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β—gal)ontotheMDandMMplates.
4.Incubatetheplatesat30°Cfor2days.
5.After2daysorlongerat30°C,scoretheplates。
Mut+transformantswillgrowwellonbothMDandMMplates。
MutStransformantswillgrowwellonMDplates,butshowlittleornogrowthontheMMplates.
WerecommendpurifyingyourHis+transformantstoensureisolationofapureclonalisolates。
YoumaydothisbeforeoraftertestingfortheMutphenotype.
Replica-PlatingProcedure
Thisproceduregivesalowerrateofmisclassifications,butitincreasestheoverallMut+/MutSscreeningprocedureby2days.Youwillneedequipmenttoreplica-plate.
1。
Usingsteriletoothpicks,patch100His+transformantonMDplates(2—3plates)。
Forcontrols,makeonepatchfromeachofthestrainsGS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-galontotheMDplates.
2.Incubatetheplatesat28-30°Cfor2days。
3.After2days,replica—platethepatchesfromtheMDplatesontofreshMMandMDplatestoscreenforMutStransformants。
4.Incubatethereplicaplatesat28-30°Cfor2days。
5。
After2daysat28—30°C,scorethereplicaplates.LookforpatchesthatgrownormallyontheMDreplicaplatesbutshowlittleornogrowthontheMMreplicaplates.IncludingHis+Mut+andHis+MutScontrolpatchesoneachplatewillprovideexamplesofMut+andMutSphenotypes.
ScreeningbyFunctionalAssay
SomeresearchershaveusedafunctionalassaytodirectlyscreenforhighexpressingPichiarecombinantcloneswithoutfirstscreeningforMutSorMut+phenotypes.Ifyouelecttoscreendirectlyforhigh-expressingrecombinants,besuretoalsochecktheMutphenotype.Thiswillhelpyouoptimizeexpressionofyourrecombinantclone。
毕赤酵母基因组提取方法
⑴接种重组和空质粒转化子于5mlYPD+k抗生素培养基,GS115菌于YPD培养基作对照,30℃,培养16~18小时。
⑵室温下,1500g离心5-10min收集菌体
⑶100ulTE(pH7。
0)重悬,加入300ulEDTA(pH8.0),0。
07MTris-HCl,3ulβ—巯基乙醇,1ulLyticase,37℃水浴30min。
⑷10000g离心5~10min,取沉淀,加90ulTE重悬.
⑸200ul饱和酚,200ul氯仿,混匀,离心30s,取上层水相。
⑹加入两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC,—20℃放置30min;
⑺10000g离心20min,弃上清;75%乙醇漂洗沉淀一次;
⑻干燥后,加入15μl的TE或H2O溶解,-20℃备用。
重组菌株传代次数太多,确实可能存在菌株退化的现象。
所以一定要保存好最原始的重组菌株,每次从中划板,挑单克隆表达,尽量减少菌株传代次数。
不行的话再用相同的方法重新转化筛选高表达菌株.
Pichia菌落PCR破壁方法(史飞):
30ul培养液,0.2%SDS
Votex15sec
离心1min
取上清,稀释5—10倍
用于PCR模板
GS115的鉴定方法
接种GS115于5mlYPD液体培养基,30℃,200rpm振荡过夜,涂布YPD平板,30℃培养48小时,用YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化,挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板,4℃保存.GS115的his4基因突变了,不能在组胺酸缺陷型培养基上生长,一般的YPD培养基营养丰富,什么都有了,而YNB却只含基本氮源,GS115应该在上面不长,就是从YPD上挑菌落,在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下,在HIS上长而YNB上不长的是GS115,这样能挑到纯的,以防突变
毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制
10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基)4℃保存。
34g酵母基础氮源培养基(无硫酸铵)+100g硫酸铵,溶于1000ml水中,过滤除菌,或134gYNB固体溶于1L蒸馏水,过虑除菌or115℃15—20min灭菌。
注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好,所用YNB的量是酿酒酵母中的两倍。
500*B(0.02%生物素Biotin)20mg的生物素溶于100ml水中,水浴加热溶解,温度不能高于50度。
过滤除菌。
4℃保存保存期为1年。
D-生物素是具有生物活性的生物素,也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中,作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加,因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素,但是做高密度发酵还是必须要添加的。
MD、MM属于基础培养基,没有哪种成分会含有微量生长因子(如生物素),所以肯定要加的。
100*H(0。
4%Histidine组氨酸)4℃保存保存期为1年.400mg的L-组氨酸溶于100ml水中,(加热至50℃以促进溶解),过滤除菌。
10*D(20%Dextrose葡萄糖)保存期为1年。
200g葡萄糖溶于1000ml水中,115℃灭菌15—20min或过滤除菌。
10*M(5%Methanol甲醇)保存期为2个月.将5ml的甲醇与95ml水混匀,过滤除菌.
10*GY(10%Glycerol甘油)保存期为1年以上。
将100ml甘油和900ml水混匀后,高压灭菌或过滤除菌。
100*AA(0。
5%ofeachAminoAcid,各种氨基酸)4℃保存保存期为1年。
分别将500mg的L—谷氨酸、L—蛋氨酸、L—赖氨酸、L-亮氨酸和L—异亮氨酸溶于100ml水中,过滤除菌.
1M磷酸钾溶液(potassiumphosphatebuffer,pH6。
0),将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀,其pH为6。
0,如需调节pH,则使用磷酸和氢氧化钾调节pH.
1M山梨醇
毕赤酵母表达的培养基配制
2.1LB(Luria-Bertani)培养基:
Tryptonl%
YeastExtract0.5%
NaCll%
PH7。
0制作平板时加入2%琼脂粉.121℃高压灭菌20min。
可于室温保存.
2.2LLB(LowSaltLB)培养基:
Tryptonl%
YeastExtract0。
5%
NaCl0.5%
PH7。
0制作平板时加入2%琼脂粉.121℃高压灭菌20min。
可于室温保存数月。
2。
3YPD完全培养基(又称YEPD)(YeastExtractPeptoneDextroseMedium,酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基)
Yeastextract1%10g/L
Trypton2%20g/L
dextrose(Dglucose)2%20g/L
+agar2%20g/L
液体YPD培养基可常温保存;琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。
YPD或YEPD:
YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1L),又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基,加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖(YPD)琼脂培养基.
YPD培养基配制方法:
1.溶解10gYeastExtract(酵母膏),20gPeptone(蛋白胨)于900ml水中,如制平板加20g琼脂粉
2。
高压121度20min
3。
加入100ml20%(10X,共20g)的Dextrose(glucose)(葡萄糖),(葡糖糖溶液灭菌后加入)
注:
葡萄糖,yeastextract,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应,导致培养基成分变化,所以要分别灭菌后再混合.葡萄糖可以过滤除菌,也可以115℃15—20min灭菌。
YPD培养基用途:
用于酵母菌的培养,及供药品和生物制品含王浆和蜂蜜的合剂酵母菌数测定。
YPEG:
除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外,其他成分同YPD;YPDZ是在YPD的基础上加上ZEOCIN抗生素;YPDA是在YPD的基础上加0。
003%的腺嘌呤硫酸盐。
2。
4MD与MDH选择培养基
MinimalDextroseMedium+(Histidine)最小葡萄糖培养基+(0。
004%组氨酸)(含有:
1。
34%YNB;;4X10-5%生物素;2%葡萄糖)
1.灭菌800ml的ddwater,冷却到60℃左右,加入
2ml的500*B,
100ml的10*YNB
100ml的10*D母液,4℃保存
2。
如配制MDH,可在上述的MD中加入10ml的100*H即可,4℃保存;
3.如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15g的琼脂。
4℃可保存数月。
2.5MM和MMH培养基
MinimalMethanolMedium+(Histidine)(含有:
1。
34%YNB;4X10—5%生物素;0.5%甲醇)
1.灭菌800ml的ddwater,冷却到60℃左右,加入
2ml的500*B,
100ml的10*YNB
100ml的10*M,4℃保存
2.如配制MMH,可在上述的MM中加入10ml的100*H即可,4℃保存;
3.如配制平板,可无菌水的灭菌前,加入15g的琼脂。
4℃可保存数月。
MMorMD是筛选mutS和mut+表型的。
2。
6BMG和BMM培养基
BufferedMinimalGlycerol,BufferedMinimalMethanol(含有100mMpotassiumphosphatepH6。
0,1.34%YNB;4X10—5%生物素1%glycerolor0.5%methanol)
1.灭菌700ml的ddwater,冷却到室温,加入
2ml的500*B,
100ml的10*YNB
100ml的1Mpotassiumphosphatebuffer
100ml的10*GY,4℃保存
2.如配制MMH,可在上述的BMG中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可,4℃保存,可保存2个月.
2。
7BMGY和BMMY
BufferedGlycerolcomplexMedium,BufferedMethanolcomplexMedium(含有1%yeastextract,2%peptone,100mMpotassiumphosphatepH6.0,1.34%YNB;4X10-5%生物素1%glycerolor0.5%methanol)
1.溶解10g的
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