可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究.docx
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可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究
可促进VEGF持续释放类胶原微球的制备与特性研究
摘要:
本次研究中,我们准备了组织工程中的可注射胶原以实现人类重组VEGF(血管肉皮生长因子)的可持续释放。
胶原溶液在油质乳液条件下形成,同时与碳化二亚胺实现交联。
通过控制转速与表面活性剂浓度可形成各种在1-30um直径下的胶原微球。
颗粒直径随转速增加比例下降(在300-1200rmp下,每增加100转降低1.8um).在置有磷酸盐的培养基中,胶原微球表现8.86-3.15mv的轻微正电荷。
研究结果显示,rhVEGF持续释放过程延续了4周。
释放的VEGF可诱导人脐静脉内皮细胞中毛细管的形成,且释放后维持一段时间的生物活性。
所以,我们得出结论,胶原微球可促进VEGF的持续释放。
1介绍
最近有研究报告显示血管生成术在组织工程中有所应用,尤其是大型组织的形成。
VEGF是一种有效的血管生成分子,然而,机体内被管理的VEGF可在短时间内分解和清除,从而导致重复循环。
基于上述原因,许多有利于VEGF持续传递的材料已被研究。
胶原基质DDS(药物输送体系)引起了广泛关注,因为它的可注射性与传递多样性。
以胶原、明胶、白蛋白、透明质酸为代表的天然高分子聚合物已经在DDS中有所应用。
相对于合成聚合物而言,它们有极好的生物相容性。
尤其是胶原显示出更优异的生物相容性,因为它是细胞基质的主要组成成分,并且在生物界中扮演了非常重要的角色。
尽管有如此优势,可注射性胶原在DDS的研究却少有突破。
本研究中,我们在水油混合乳液条件下准备了可注射性胶原,以便实现VEGF的可持续性释放。
首先,我们研究了乳化混合中表面活性剂浓度和转速对微粒直径的影响。
其次,做了显微观察和表面电荷的的测算。
另外,我们从胶原微球中评估了人类重组VEGF的持续释放。
最后,我们对人脐静脉血管肉皮细胞中释放后的VEGF的生物活性进行了化验。
这里,我们论证了形成1-30um微粒直径的胶原微球的制法以及描述了胶原微球在DDS中可作为一种有用材料。
2材料准备和方法
2.1试剂
猪皮胶原蛋白、液状石蜡、山梨聚糖醇、可溶水的碳化二亚胺、rhVEGF、DMEF、FBS(胎牛血清)、VEGFELISAkit、NHDFS(人类正常皮肤纤维母细胞)、EGM-2
2.2胶原微球的制备
在50ml不同浓度(0-1.5%)液状石蜡中乳化10ml1%(W/V)的胶原溶液,室温下,用高速离心机在300-1200rhm(每分钟转速)离心5分钟,用1ml50%的碳化二亚胺交联,在乳液条件下不停搅拌1小时以形成微球。
添加50ml50%的酒精以使微球与油相分离。
以3500rhm高速离心5min后去除上清液。
再加入50%酒精以同样转速和时间再次离心。
去除上清液,添加磷酸盐水缓冲溶液,再次以3500rhm,5min,混合离心。
如此三次,除去余下的酒精,在0.3%的表面活性剂浓度,600rhm条件下,进行胶原微球中VEGF的注入,界面电动势,显微观察。
2.3胶原微球中VEGF的注入
4摄氏度条件,磷酸盐水缓冲溶液中浸泡1ug/ml的rhVEGF以及胶原微球24小时,装载了rhVEGF的胶原微球在3500rhm条件下离心5min后去除上清液,再加入PBS(磷酸盐水缓冲液)混合微球并以同样转速、时间离心。
此过程持续三次后去除多余的rhVEGF.
2.4颗粒大小
通过手数法测出胶原微球颗粒直径,在PBS中搅拌胶原微球一昼夜以使微粒均匀分散。
用显微镜对胶原微球取相,人工手数法最少要500颗微球才能测算出微粒直径。
2.5黏度
用黏度计在不同温度下测量液状石蜡和胶原溶液的黏度。
2.6电动电势
用Zetasizer通过测量电泳迁移率得出胶原微球表面电荷,此测量在PBS和EGM中进行以满足电动电势的溶剂依赖性。
用Smoluchowsky模型计算电动电势的电流淌度。
所有测量在25摄氏条件下进行3次。
2.7显微观察
胶原微球由2.5%的戊二醛固定并被酒精和醋酸异戊醛脱水。
随后冷冻干燥样本,然后用金属离子溅射镀膜仪涂上Pt(铂金)后以扫描电子显微镜进行扫描,工作电压为20KV.
2.8SDS聚丙烯酰胺明胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-PAGE用XVpantera系统形成。
分享凝胶的浓度为5%。
胶原微球与ph=3的稀盐酸稀释到浓度为10mg/ml.胶原及明胶分别被ph=3的稀盐酸稀释至0.1%及1%。
样品与0.1M的盐酸酸化的三异丙基乙磺酰(ph=6.8,由69.3mMSDS,40%的甘油,0.7mM的蓝色溴苯酚)混合,在99摄氏度条件下加热5min.电泳后,用考马斯亮兰R250对明胶染色。
2.9体外释放研究
把装载了胶原微球(100mg)的rhVEGF置入insertwells,400ul的溶剂添加到lowerwells.在PBS中浸泡的胶原溶液和EGM作为溶剂。
胶原样本在恒温37摄氏度下培养。
一段时间后,更换新的溶剂再次培养。
释放的rhVEGF主要成分决定于VEGFELISAkit上面的厂商说明。
为了评估胶原微球在胶原溶液和PBS的可降解性,用蛋白质化验仪测出其蛋白质含量。
2.10毛细管形成化验
HUVECs干细胞中毛细管由以前描述的方法形成,含有释放rhVEGF,经过调整处理后的EGM准备如下:
EMG和装载了胶原微球的rhVEGF在恒温37度下培养一周后更换新的EGM和培养液再培养一周。
相同操作重复三次共四周。
2.11统计分析
student’ttest和95%的置信水平对数据的分析对统计有必要意义。
有误差的数据会在标准平均偏差中体现出来
3结果与讨论
3.1表面活性剂对微粒直径的影响。
数据1表明了表面活性剂对微粒直径的影响。
平均直径,标准偏差,变异系数总结在表1.表面活性剂浓度在0.1-0.5%范围时直径随活性剂浓度比例下降。
此范围内,直径随着表面活性剂浓度每增加0.5%变化3.1um,当浓度超过0.5%微粒直径只有微小变化。
同时,表面活性剂的缺乏引起了引起了微粒直径和标准偏差的增大。
Student’ttest表明了表面活性剂尝试有意义地影响微粒直径。
因此,可以通过改变转速控制微粒直径,600rhm的转速有利于形成更优良的微球。
3.3黏度和温度对微粒直径的影响
乳化混合物中的黏度和反应温度是控制胶原微球微粒直径的重要因素。
油相的黏度随温度增加而减小,但水相中只有微波变化。
此外,油相黏度的增加引起微粒直径的减小。
数据1;表面活性剂浓度对微粒直径的影响(A)
照片显示了表面活性剂浓度在0%(B),0.1%(C),0.3%(D),0.5%(E),1%(F),1.5%(G)
时的微球直径。
转速600rpm.
表1;表面活性剂浓度对粒子直径和胶原微球离散系数的影响
数据2;乳剂系统下转速对粒子直径的影响(A),图B,C,D,E分别显示了转速在300,600,900,1200rhm条件下胶原微球的直径。
活性剂浓度为0.3%
表2;转速对微粒直径和胶原微球离散系数的影响
可以推断,油相黏度的减小可形成更好的乳剂和更大的液滴。
另一方面,水溶液中胶原浓度的增加也改变了粒子直径。
胶原溶液黏度随着浓度的增加而增加(数据3,A),所以水溶液中,黏度的增加改变了微粒直径。
因此,可以通过控制温度和黏度来制取所要的微球。
数据3:
图A为反应温度对液状石蜡,0.5%,1%,1.5%浓度胶原溶液黏度的影响
图B为油相对粒子直径的影响;C图为水溶液中胶原浓度对粒子直径的影响。
表面活性剂浓度为0.1%,转速500rpm.
3.4界面电动势
通过测试电泳淌度我们可以得知胶原微球的表面电荷,表格3表现了在PBS和EGM中的胶原微球的界面电动势。
最新研究结果显示,胶原微球有轻微正电。
Berthold等人曾经报告说海洋胶原蛋白表现出轻微的负电(ph=7时约为30Mv.交联剂的种类会造成以上区别。
目前用WSC,通过氨羧缩合反应实现交联。
另一方面,先前有用戊二醛(只有氨基间交联)。
所以,胶原分子中官能团电荷分布导致了界面电动势的区别。
同时,在EGM中的界面电动势带电量比在PBS中的低。
同时有报导说,带正电的微球与阴离子的静电约束力可能观察到。
所以,EGM和PBS中的缓冲阴离子浓度的差异可以影响界面电动势。
3.5SEM(扫描电镜)和SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺明胶电泳)
表格3PBS和EGM中胶原微球界面电动势的估算
图4胶原微球的扫描电镜图片。
转速为600rpm,表面活性剂浓度为0.3%。
放大率;15,000
3.6rhVEGF的释放概况
胶原微球中rhVEGF的释放情况随所用溶剂改变(图5,A)。
在胶原酶溶液中,释放后的rhVEGF在最初的8天快速生长,随后慢慢减缓。
图表5;A为分别在胶原酶溶液、PBS、EGM.中装载了胶原微球的rhVEGF的体外释放概况。
B:
在胶原酶溶液和PBS中胶原微球的体外降解速率。
胶原酶溶液的释放曲线与胶原酶溶液中胶原微球的降解曲线(图五B)类似,这表明,胶原微球的降解伴随着药物的释放。
实验中所用的胶原酶浓度在生理有关的浓度范围内。
所以,胶原微球可能与胶原酶溶液表现出相同的释放状况。
同时,在EGM中的释放速率大于在PBS.说明在EGM和PBS中药物扩散程度可能不一样。
此外,溶剂中胶原微球的带电状况可能影响释放速度(表3)。
可能认为,有某种约束力,例如胶原和蛋白间的静电约束和疏水性反应。
所以,胶原微球和rhVEGF中的静电反应可能会是释放状况不一的原因之一。
因此,可以通过药物扩散和胶原降解达到rhVEGF释放的目的。
3.7释放后的rhVEGF的生物活性
可通过在体外形成毛细管的化验评估出释放后的rhVEGF是否保持生物活性(图6)。
有研究显示,在EGM中,因为有VEGF的存在,HUVECS干细胞表现出类毛细管结构。
尽管,在此条件下的EGM形成的毛细管的总长比用软件分析计算结果小,且随着潜伏期增加而变小。
这个结论可以用来解释在EGM中的释放状况。
在EGM中rhVEGF的释放数量随着潜伏期的增加而变少。
释放的rhVEGF的总数量在0-7,8-14,15-21,22-28天内分别为56.5,15.0,8.8和6.2ng/ml,远低于所控制的76.4ng/ml.因此,rhVEGF的生物活性的保持可以作为毛细管形成的观察指标。
图六:
培养时间分别为0-7(A),8-14(B),15-21(C),22-28(D)天装载微球的rhVEGF,收集了人脐静脉内皮细胞中毛细管形成图。
E图为未经处理细胞,F图为在含有2nmrhVEGF的EGM中处理过的细胞
有一些关于组织工程中胶原微球制备的记录。
Kim等人报道了骨组织工程中平均直径为166um的胶原-磷灰石复合微球。
Swafschek的研究小组发现了平均直径为2.2um,可传递维A的agglomated胶原微球。
Berthold等人报道了平均直径为10um,可输送糖皮质激素的胶原微球。
Chan等人制成了平均直径为70um的纳米纤维胶原微球,并探明了它们的神经生长因子释放情况。
目前的研究制备出了小到1-30um直径的微球,具有生物活性的rhVEGF可持续四周潜伏。
此外,现在的研究第一次提供了更简便控制微粒直径的技术。
本实验中用到的WSC交联剂因为不会在胶原分子间反复交联及交联后被清除的特性而具有较好的生物相容性。
因此,胶原微球将会应用到临床上,例如组织工程中的可注射药物输送体系生物材料。
4结论
我们成功制备了可使rhVEGF持续释放的胶原微球。
微粒直径可通过在乳化过程中控制表面活性剂浓度和转速轻易控制。
rhVEGF释放时间可持续4周,并且保持生物活性。
这项工作将会有利于组织工程领域里胶原微球蛋白基质药物输送体系的发展。
附略
参考文献略
原文译自NobuhiroNagai•NorihiroKumasaka•TakeakiKawashima•HirokazuKaji•MatsuhikoNishizawa•ToshiakiAbe所著《PreparationandcharacterizationofcollagenmicrospheresforsustainedreleaseofVEGF》
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- 促进 VEGF 持续 释放 胶原 制备 特性 研究