蛋白质分离纯化与检测技术_精品文档.ppt

蛋白质分离纯化与检测技术_精品文档.ppt

《蛋白质分离纯化与检测技术_精品文档.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白质分离纯化与检测技术_精品文档.ppt（35页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

蛋白质分离纯化与检测技术,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PolyAcrylamideGelElectrophoresis,聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺（Acr）和交联剂亚甲双丙烯酰胺（Bis）在加速剂N，N，N，N四甲基乙二胺（简称TEMED）和催化剂过硫酸铵（简称AP）或核黄素（C17H20O6N4）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。

凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同分子的迁移率，当施加一定电压时小分子的物质的迁移速率将快于大分子的物质，即所谓的分子筛效应。

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,消除蛋白质分子形状的影响,掩盖不同类蛋白质分子原有的电荷差别,聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品与上样缓冲液混合变性，上样缓冲液中含有SDS和巯基乙醇使得蛋白质分子中的二硫键还原，氢键、疏水键打开，SDS按1.4gSDS/1g蛋白质的比例结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物。

由于十二烷基磺酸根带负电，SDS覆盖于蛋白质的表面，破坏了蛋白质分子的四级结构而使多肽复合物具有近似的形状（长椭圆棒状），并且复合物所带有的负电荷大大超过了多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了多肽分子原有的电荷差别。

聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,如图所示，蛋白质所带的电性主要取决于氨基酸R集团所带的电性。

图中的H代表无极性的R集团为了躲避水而聚集于内部。

当SDS结合到蛋白质多肽链分子上，形成SDS-多肽复合物后，SDS均匀覆盖于蛋白质的表面，破坏蛋白质分子的疏水作用而成为线性分子。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。

在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。

在电泳时，SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。

试剂,30%凝胶贮备液：

含29%（W/V）丙烯酰胺1%（W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺10%SDSTEMED（N，N，N，N-四甲基乙烯二胺）10%过硫酸胺Tris-甘氨酸电泳缓冲液：

25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸（pH8.3）0.1%SDS1.5mol/LTrisCl（pH8.8）分离胶1.0mol/LTrisCl（pH6.8）浓缩胶,表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围适用的凝胶浓度/（%）蛋白质10420-301-410415-201-5104-110510-1511055-1051052-5核酸（RNA）10415-20104-1055-10105-21062-2.6,蛋白质的分离纯化,InvitrogenProbondTMPurificationSystem,分离纯化原理,金属螯合层析：

在琼脂糖上偶联了螯合剂亚氨基二乙酸（IDA）钠。

IDA的钠盐与金属离子如Ni+螯合后，可与生物分子如蛋白质结合，不同的蛋白质与金属离子结合力不同，从而将蛋白质分离。

ProBond是一种带有正电荷镍离子的琼脂糖树脂，带有6His标签的蛋白与固定在ProBond上的二价镍离子具有高度的亲和性，用某种与吸附蛋白质竞争结合的溶质洗脱亲和基质，特异性地将吸附的各种蛋白质分别洗脱下来。

这类溶质包括含-NH2、-COOH、-SH等基团的物质和咪唑等取代剂。

带有HisTag蛋白质分子,分离纯化原理,咪唑,分离纯化原理,操作流程,一、柱子的制备二、蛋白的纯化,一、柱子的制备,将装有树脂的瓶子不断的颠倒轻敲，使树脂在瓶中重悬。

吸取2ml树脂加入纯化柱中，静置5-10分钟，通过重力使树脂沉淀在柱底；也可以通过低速离心（800g,1min）的方法使树脂沉淀在柱底,轻轻吸去上清液。

吸取6ml无菌蒸馏水加入柱中，不断的颠倒轻敲，使树脂在柱中重悬。

重复步骤2。

在柱子中加入6mLNativeBindingBuffer。

不断的颠倒轻敲，使树脂在柱中重悬。

重复步骤2。

重复步骤5-7。

二、蛋白的纯化,吸取8ml溶解产物加入已经制备好的纯化柱中。

轻轻滚柱子动使树脂在溶解产物中保持悬浮状态，使带有组氨酸标签的蛋白与树脂充分结合，此过程30-60min。

通过重力或低速离心（800g）的方法使树脂沉淀在柱底，轻轻吸去上清夜,上清液于4储存并做SDS-PAGE分析。

用8mlNativeWashBinding洗涤，通过重力或低速离心（800g）的方法使树脂沉淀在柱底，轻轻吸去上清夜,上清液于4储存并做SDS-PAGE分析。

重复步骤4三次以上。

夹紧柱子，使柱子与地面保持垂直，将柱子底端的帽折断，用8-12ml的NativeElutionBuffer洗脱蛋白，收集洗脱液，并取少量做SDS-PAGE分析。

抗体的制备,佐剂,佐剂：

延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。

常用的佐剂是福氏佐剂（Freundadjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：

29（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入120mg卡介苗就成为完全佐剂。

效价,定义：

抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。

测定方法：

双向琼脂糖扩散、ELISA等方法测定。

抗体制备过程,制备纯净的抗原测定抗原浓度，0.5mg/mL。

抗原用佐剂乳化一般常用皮下或背部多点皮内注射，首次剂量为300500g，使用完全佐剂。

加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。

每23周加强免疫一次，加强免疫时用不完全佐剂。

在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取23ml，制备血清，检测抗体效价。

如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。

当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。

血清的采集,收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm，10min。

在无菌条件，吸出血清，分装（0.050.2mL），贮于-40以下冰箱，或冻干后贮存于4冰箱保存。

双向琼脂板扩散免疫试验,双向琼脂板扩散免疫试验又称双向免疫扩散试验，将抗原和相应的抗体分别加入同一凝胶板的相邻小孔中，使两者相互扩散，当扩散到它们比例合适的部位时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀，在琼脂中呈现一条乳白色的沉淀线。

故此试验可用已知抗原检测未知抗体。

由于沉淀线形成的位置与抗原、抗体的浓度相关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，同样，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距离抗体孔越远。

据此，固定抗原浓度，稀释抗体，可测定抗体效价。

双向琼脂板扩散免疫试验,配制1.5%生理盐水琼脂：

100mL生理盐水中加入1.5g优质琼脂粉，置水浴中融化后，加入硫柳汞浓度为0.01%以防腐，分装于小试管中，每管3mL，置于冰箱保存备用；将盛有3mL生理盐水琼脂的小试管置水浴中融化；将融化好的琼脂倾注于载玻片上，每管铺一板，厚度为1mm，共铺3块板；琼脂凝固后，按模板打孔，中心孔为抗原孔，四周8个孔为抗体孔，孔径3mm，孔距4mm。

打孔后将载玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使琼脂与玻片贴紧；,琼脂板双向扩散免疫实验,将从兔中采得的血清按二倍稀释法稀释成1:

2、1:

4、1:

8、1:

16、1:

32的不同浓度，同时也将抗原按二倍稀释法稀释成1:

2、1:

4、1:

16；将已经稀释好的抗体按一定的顺序加入到四周孔中，其中一孔滴入生理盐水以做对照（均以滴满不溢出为度或用微量加样器定量加入），中心孔中加入抗原，将已经稀释好的抗原分别滴入3块板的中心孔中；放入湿盒内，置37经24小时观察沉淀线出现的情况，记录结果。

以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。

兔抗血清效价检测a、b、c板中心孔为纯化的抗原SCMRP，稀释倍数分别是0、1/4、1/16；四周孔为制备的抗血清梯度稀释液和对照，孔1为生理盐水，孔2-7为抗血清0、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32稀释液，孔8为空白；d板为免疫的1号新西兰大耳兔。

Detectionoftherabbitantiserumvaluethecenterofa,b,cplateisthepurificationantigen,respectivelydiluteintheproportion0,1/4,1/16;thearoundholeisfilledwithaserialantiserumdilutedingradsandtheblankhole;hole1:

isotonicNachloride,hole2-7:

antiserumrespectivelydiluteintheproportion0,1/2,1/4,1/8,1/16,1/32;hole8:

blankpicture;d:

immuneNewZealandlongearrabbit.,兔抗血清效价测定,WesternBlot,WesternBlot原理,WesternBlot印迹常用转移膜及其特点,电转移流程,配制电转移缓冲液，4预冷。

将膜与滤纸切成与胶同样的大小。

注：

通常情况下长宽各比胶小1mm；切一个小小的角以标识正反面和上下。

将膜、滤纸与海绵垫在电转移缓冲液中平衡15min-1h注：

PVDF膜在使用前先用100%甲醇浸泡15s，然后用去离子水浸泡2min。

压膜电转移膜固定：

干燥（37干燥h）膜重新湿润：

先用100%甲醇浸泡15s，然后用去离子水浸泡2min,电转移流程,转膜条件,标记,将膜在室温下用封闭试剂封闭20-60分钟，期间不断摇动，如要得到最佳结果，需在室温下封闭1小时。

移去封闭剂，加上适当的初级抗体稀释液，在不断摇动下杂交1小时。

如果需要，与初级抗体的预杂交可在2-8摇动过夜。

洗涤杂交膜，时间5分钟，此过程重复4-6次，移去洗涤缓冲液。

加入二抗（辣根过氧化物酶复合物），在不断摇动下杂交1小时。

洗涤杂交膜，时间5分钟，此过程重复4-6次，移去洗涤缓冲。

重复过程3以除去没有结合上的辣根过氧化物酶复合物。

显影,工作液的制备：

可以可以把过氧化物溶液与发光氨（氨基苯二酰一肼）以等体积混合。

每平方厘米膜使用0.125ml工作液，工作液可以在室温下稳定贮藏8小时。

注：

暴露于日光或其它强光下可以损坏工作液，为了得到最好的实验结果工作液应贮存在棕色瓶中，避免长时间暴露于任何强光下。

膜与工作液杂交5分钟。

将杂交膜从工作液中移出，放入一塑料膜保护器中：

塑料薄膜或塑料包装。

用吸水组织移去多余液体，仔细排出膜杂交与塑料保护器之间的气泡。

将膜保护器放入暗盒中，有蛋白质的一面要朝上，关闭所有的灯除了那些适合于胶片曝光的光线（如，红外线）。

小心将胶片放在膜上。

建议第一次曝光时间是60s，为了得到最佳结果应优化曝光时间，增强放射能照像光强是没有必要的，在胶片曝光之前应避免提前的放射能照像闪光。

注意事项,不要直接用手直接接触杂交膜，应该戴手套或用干净的镊子。

上样不应过多。

滤纸和膜的长和宽都要比胶小1mm，避免短路。

膜要标记好正反面，在感光时要用膜的正面与胶片相贴。

压膜时膜与胶之间、膜与滤纸间、胶与滤纸之间要避免有气泡产生；感光时，膜与胶片之间都要避免有气泡产生。

膜用工作液处理后，应立即在暗室中使胶片感光。

初级抗体的稀释到0.2-1.0g/ml或由1mg/ml的母液按1：

1，0001：

5，000稀释。

抗原抗体的量需要优化，次级抗体的稀释到10-50ng/ml或由1mg/ml的母液按1：

20，000-1：

100，000稀释。

预先统计好所用药品的量；新配制的药品不要存放时间过长最好提前一天配制好，还有一些药品要现用现配。